Name: Présentation de contrainte de cisaillement dans létude de ladhésion bactérienne (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Découvrez une technique d'étude de l'adhésion bactérienne sous contrainte de cisaillement utilisant des chambres à flux et des cellules endothéliales. Cette méthode permet d'analyser la colonisation par Neisseria meningitidis et d'autres pathogènes.

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Les auteurs tiennent à remercier Emilie Mairey et Emmanuel Donnadieu pour le réglage initial de la procédure.

1. Cellule hôte de l'homme et de la culture bactérienne <ol><li> HUVEC culture entre le passage 1 et 9 à 37 ° dans un incubateur humidifié avec 5% (v / v) de CO 2. Passage des cellules quand ils s'approcheront 80% de confluence avec la trypsine / EDTA à fournir des cultures de maintenance sur 75 flacons cm 2 de culture et de cultures expérimentales en chambres d'écoulement jetables (μ-Slides VI). </li><li> Retirer moyenne des flacons pour être repiquées, laver les cellules avec 10 ml de PBS, de retirer et le remplacer par 1,5 ml de trypsine / EDTA. Permettre aux cellules de se détacher dans un incubateur de culture cellulaire pendant 5 minutes à 37 ° C. </li><li> Recueillir les cellules avec 10 ml de milieu de culture cellulaire dans un tube de 15 ml de collecte. Pellet les cellules avec une centrifugation de 5 minutes (à 200 g), à température ambiante. Suspendre les cellules dans 4 ml d'Endo-GDF complété avec 10% (v / v) de FBS et les compter sur une chambre de Malassez, conformément aux instructions du fabricant. </li><li> Présentez-30 ul d'un 1x10 6 cellules HUVEC par ml de suspension dans le canal (3x10 4 au total) et permettent aux cellules d'adhérer pendant 3 heures à 37 ° dans un incubateur humidifié avec une atmosphère de 5% (v / v) de CO 2. Ajouter un volume supplémentaire de 120 pl d'Endo-GDF pour remplir les puits. Les cellules doivent former une monocouche subconfluentes (figure 2). </li><li> Cultivez N. meningitidis exprimant la GFP (dans ce cas souche 8013 GFP exprimé sous le contrôle d'un promoteur inductible par l'IPTG), sur gélose GCB contenant des suppléments de Kellogg et 5 ug / ml de chloramphénicol à 37 ° C dans une atmosphère humide contenant 5% (v / v) de CO 2 pendant 16 heures. </li></ol> 2. Adhérence initiale de bactéries individuelles à des cellules hôtes <ol><li> Ajuster la concentration de bactéries cultivées sur gélose GCB à une DO600 de 0,05 avec préchauffé Endo-GDF, contenant 10% (v / v) de FBS et incuber pendant 120 minutes à 37 ° C dans une atmosphère humide contenant 5% (v / v) de CO 2, sous agitation douce (130 rpm). Induire l'expression de la GFP en ajoutant 1 mM d'IPTG dans le milieu de culture pour la période d'incubation. </li><li> Placez le jetables μ-Slide sur la scène d'un microscope inversé équipé d'une plateforme chauffé pour maintenir la température de l'échantillon à 37 ° C. </li><li> Verser préchauffé Endo-GDF supplémenté avec 2% (v / v) de FBS dans un bécher de verre stérile et de remplir une seringue stérile de 50 ml avec ce médium. Fixez le "entrée" tube à la seringue et remplir par l'introduction à moyen terme. </li><li> Connectez le "entrée" tuyau à la μ-Slide, avec soin, afin d'éviter l'introduction d'air dans la chambre. Puis, apposer la «sortie» du tube à l'autre extrémité et remplissez soigneusement le canal de moyenne à environ 1 cm de distance de la chambre de «sortie». </li><li> Mesurer la DO600 bactérienne et d'ajuster à 0,15 en Endo-GDF contenant 2% (v / v) de FBS. Afin de regarder les bactéries individuelles, les agrégats doivent être perturbée par des vortex vigoureux de l'échantillon bactérien. </li><li> Placer 100 pi d'Endo-GDF supplémenté avec 2% (v / v) de FBS milieu dans le réservoir et ajouter 100 ml de la solution bactérienne prises depuis le sommet de la solution de vortex d'éviter de prélever des autres agrégats bactériens. </li><li> Soigneusement introduire le volume de 200 ul dans le μ-Slide en tournant le robinet d'injecter des bactéries dans la chambre. </li><li> Présentez-Endo-GDF contenant 2% (v / v) de FBS, maintenue à 37 ° C avec la plate-forme chauffée, dans la chambre à l'aide d'une seringue avec une contrainte de cisaillement compatible avec l'adhésion de 0,044 dynes / cm 2 pendant 15 minutes. </li></ol> Voir par exemple la vidéo 1 ou la figure 3. Après cette étape, soit de déplacer des articles 3, 4 ou 6. 3. Quantification de l'adhésion initiale des bactéries aux cellules hôtes individuels <ol><li> Après l'adhésion initiale pendant 15 minutes, d'acquérir des images de dix champs au hasard tandis que le liquide est toujours en circulation. </li><li> Analyser les images acquises en utilisant le logiciel ImageJ 8, afin d'accéder au nombre moyen de bactéries adherant par champ. Cela se fait comme suit: tout d'abord, chaque image est seuillée en utilisant le «seuil» dans la fenêtre de trouver menu "Image" pour mettre en évidence individuels adhérant bactéries fluorescentes, tout en minimisant le fond des cellules. Ensuite, chaque bactérie unique est compté, en utilisant le Plug-In "Contre Cell" ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html">http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html</a> ). Les données pour chaque image sont rapportés dans un tableur Excel et sont en moyenne de quantifier le nombre moyen de bactéries adhérentes par champ. </li></ol> 4. Mesure de la résistance à l'écoulement des bactéries individuelles adhérentes à cellules de l'hôte <ol><li> Programme de la pompe seringue mise en place pour générer des contraintes de cisaillement variant de 3 à 100 dynes / cm 2 pendant 5 minutes. </li><li> A la fin des 5 minutes, l'acquisition de dix champs choisis au hasard, comme décrit dans l'étape 3.1, mais avec l'écoulement arrêté prIOR à l'acquisition. </li><li> Analyser les images acquises comme décrit dans l'étape 3.2 et de quantifier le nombre moyen de bactéries restantes par champ. </li></ol> 5. Mesurer la croissance d'une bactérie isolée adhérente à une micro- <ol><li> Présentez-Endo-GDF, contenant 10% (v / v) de FBS, maintenue à 37 ° C avec la plate-forme chauffée, dans la chambre à l'aide d'une seringue avec le stress de cisaillement choisie pour plusieurs heures. Enregistrement des images pour la microscopie vidéo en temps réel à une image toutes les 5 minutes. </li><li> Suite à la microscopie vidéo, arrêtez la contrainte de cisaillement en désactivant la pompe seringue, d'acquérir des images supplémentaires 2-3 puis arrêter la séquence d'acquisition d'image sur le logiciel. Un exemple de la prolifération bactérienne peut être vu sur la vidéo 2. </li></ol> 6. Mesure de la résistance à l'écoulement des microcolonies bactériennes adhérente <ol><li> Après la formation de microcolonies grande à la surface cellulaire (step5.2) acquérir 2-3 images des deux cellules (par contraste de phase) et des bactéries (par la GFP-fluorescence) avant l'application de flux. Pour le reste de l'expérience, le protocole d'acquisition sera de surveiller que la fluorescence. </li><li> Application des contraintes de cisaillement élevées pendant 5 minutes (300-100 dynes / cm 2) et d'enregistrer des images à une image toutes les 5 secondes. </li><li> Arrêtez la contrainte de cisaillement en désactivant la pompe seringue, d'acquérir des images supplémentaires 2-3 puis arrêter la séquence d'acquisition d'image sur le logiciel. </li><li> Ensuite, retirez la "sortie" première tubulure et soigneusement, pour éviter de vider le canal, puis ajoutez préchauffé milieu frais pour remplir les puits avant d'enlever le "entrée" tubes. </li><li> Pour déterminer quantitativement l'effet de la contrainte de cisaillement sur la résistance bactérienne, un dosage de plaquage peut être effectuée comme suit: recueillir le milieu restant et laver les μ-Slide deux fois avec 120 pl de PBS, qui enlève le milieu restant du canal (deux lavages sont ) a également recueilli. </li><li> Détacher les cellules infectées par l'ajout de 50 pi de trypsine / EDTA pendant 5 minutes à 37 ° et mélanger cet échantillon indépendante avec la suspension recueillis à l'étape précédente. </li><li> Effectuer des dilutions en série dans du PBS et la plaque une fraction de 10 ul sur des plaques de gélose GCB, en trois exemplaires, afin de déterminer le nombre d'unités formant colonies (UFC), le jour suivant, après l'incubation des plaques à 37 ° C dans un incubateur à 5% (v / v) de CO 2. </li></ol> Vidéos 3 et 4 comparer la souche de type sauvage avec le mutant pilV. 7. Décollement de microcolonies bactériennes <ol><li> Infecter les cellules dans la chambre d'écoulement en répétant les étapes 2.1 à 2.8 et permettent l'infection se poursuivre pendant 30 minutes. </li><li> Retirer bactéries non en augmentant le flux à 10 dynes / cm 2 pour une période de 2 minutes et laisser l'infection se poursuivre pendant 2h. </li><li> Réduire le débit à 0,15 dynes / cm 2. </li><li> Chaque heure, de recueillir une goutte de milieu sortant de la chambre d'écoulement. </li><li> Effectuer des dilutions en série des échantillons et leur plaque sur gélose GCB. </li><li> Déterminer le nombre d'unités formant colonies (UFC), le jour suivant, après l'incubation des plaques à 37 ° C dans un incubateur à 5% (v / v) de CO 2. </li></ol> 8. Les résultats représentatifs <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1: Différentes étapes d'une monocouche cellulaire qui peuvent être observés et mesurés en présence de l'écoulement dans la procédure. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2: monocouche de cellules endothéliales dans la chambre de circulation au début d'une expérience (absence de cisaillement). Environ 50 cellules endothéliales sont organisés en une monocouche sous-confluente. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3: représentation graphique de l'adhésion initiale des bactéries à la surface cellulaire. Les valeurs des trois champs sont indiqués pour donner une idée de la variation de champ à champ qui est prévu (0044 dynes / cm 2). Vidéo 1. Visualisation de l'adhésion initiale des bactéries sur la monocouche cellulaire en fonction du temps (0044 dynes / cm 2). Exprimant la GFP bactéries sont en suivant la direction du milieu coule. Le film est accéléré de 60 fois, la durée réelle de la vidéo est de 10 minutes. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video1.mov">Cliquez ici pour voir la vidéo.</a> Vidéo 2. Après l'adhésion initiale des bactéries ont été autorisés à proliférer à la surface cellulaire pour une période de 7 heures (accélérée 1000 fois). <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video2.mov">Cliquez ici pour voir la vidéo.</a> Vidéo 3. Après la prolifération à la surface cellulaire le mécanicienRésistance al de microcolonies a été testé en augmentant le niveau de stress de cisaillement à 10 dynes / cm 2 pendant 5 minutes, mais microcolonies de type sauvage sont résistants accélération de 60 fois. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video3.mov">Cliquez ici pour voir la vidéo.</a> Microcolonies vidéo 4. Formé par le mutant pilV sont perturbés par augmenter le flux (10 dynes / cm 2). Ce mutant ne parvient pas à induire le remodelage de la membrane plasmique en microcolonies et est donc plus très sensibles à la contrainte de cisaillement augmente (la vidéo est accélérée 60 fois) 5. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video4.mov">Cliquez ici pour voir la vidéo.</a>

<ol><li>Mairey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+microcirculation+shear+stress+levels+determine+Neisseria+meningitidis+attachment+sites+along+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Cerebral microcirculation shear stress levels determine Neisseria meningitidis attachment sites along the blood-brain barrier.</a> J Exp Med. 203, 1939-1950 (2006).</li>
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</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

L&#39;importance de la contrainte de cisaillement et généralement des aspects mécaniques de la biologie est de plus en plus reconnu. Par exemple, les propriétés hautement adaptées adhésif de la famille des sélectines de protéines dans le processus d&#39;adhésion des lymphocytes et roulant sur la paroi vasculaire a été reconnu par l&#39;introduction de la contrainte de cisaillement dans le processus. La procédure décrite ci-dessus a été appliquée à l&#39;meningitidis bactéries à Gram négatif Neisseria mais devrait être applicable à un large éventail d&#39;agents pathogènes. L&#39;importance de la contrainte de cisaillement a été montré aussi pour d&#39;autres pathogènes et les sites d&#39;autres infections. Adhésion bactérienne conditionnée par la contrainte de cisaillement a été décrit par l&#39;étude de l&#39;adhésine FimH trouvé sur Escherichia coli uropathogènes (UPEC) 9. Similaire à sélectines, l&#39;interaction entre FimH et son récepteur de la cellule hôte a été montré pour être renforcée par cisaillement induite par des forces mécaniques 9 et l&#39;adhésine CFAE des E.coli entérotoxinogène a été rapporté également de servir de médiateur d&#39;adhérence aux cellules épithéliales via un cisaillement-dépendant mécanisme 10. Nous avons signalé, en utilisant le protocole flux laminaire chambre de dosage décrite dans ce chapitre que Streptococcus agalactiae pili étaient essentiels pour l&#39;adhésion de cet agent pathogène aux cellules épithéliales dans des conditions d&#39;écoulement 11. De telles études confirment que notre test de la chambre de flux est un outil utile pour enquêter sur des cellules hôtes-pathogènes dans des conditions de contrainte de cisaillement.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> μ-Slide VI 0.4 kit de débit </td><td> IBIDI </td><td> 80606 </td></tr><tr><td> Seringue Plastipak 50 ml Luer-Lock </td><td> Becton Dickinson </td><td> 300865 </td></tr><tr><td> Tygon R3603 Tubing 3.2 x 4.8mm </td><td> Fisher Scientific- </td><td> R3603 </td></tr><tr><td> Robinet 3 voies, 2 Luer femelle Luer mâle </td><td> Bio-Rad </td><td> 7328103 </td></tr><tr><td> Pompe à seringue </td><td> Harvard Apparatus </td><td> PHD 2000 </td></tr><tr><td> Microscope inversé, Nikon </td><td> Nikon </td><td> Eclipse T i </td></tr><tr><td> La caméra CCD </td><td> Hamamatsu </td><td> ORCA 285 CCD ou ORCA 3-CCD </td></tr><tr><td> Logiciel ImageJ </td><td> NIH </td><td> Freeware ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) </td></tr></tbody></table>

présentation de contrainte de cisaillement dans l&#39;étude de l&#39;adhésion bactérienne

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Lors des infections bactériennes d&#39;une séquence d&#39;interactions se produisent entre le pathogène et son hôte. L&#39;adhérence des bactéries à la surface de la cellule hôte est souvent l&#39;étape initiale et la détermination de la pathogenèse. Bien que l&#39;adhérence est expérimentalement étudiée principalement dans des conditions statiques d&#39;adhérence a effectivement lieu, en présence de l&#39;écoulement liquide. Les premières rencontres entre les bactéries et leur hôte se produisent souvent au niveau des muqueuses, bouche, poumon, intestin, yeux, etc, où le mucus s&#39;écoule le long de la surface des cellules épithéliales. Plus tard dans l&#39;infection, les pathogènes occasionnellement accès à la circulation sanguine provoquant des maladies mortelles telles que la septicémie, la septicémie et la méningite. Un trait caractéristique de ces infections est la capacité de ces agents pathogènes d&#39;interagir avec les cellules endothéliales en présence de sang circulant. La présence de liquide s&#39;écoulant, de mucus ou de sang par exemple, détermine l&#39;adhésion, car elle génère une force mécanique sur le pathogène. Pour caractériser l&#39;effet de l&#39;écoulement d&#39;un liquide se réfère généralement à la notion de contrainte de cisaillement, ce qui est la force tangentielle exercée par unité de surface par un fluide en mouvement près d&#39;une paroi fixe, exprimée en dynes / cm 2. Intensités de contrainte de cisaillement varient largement selon les différents types des navires, la taille, l&#39;orgue, emplacement, etc (0-100 dynes / cm 2). Circulation dans les capillaires peut atteindre des valeurs très faibles contraintes de cisaillement et même arrêter temporairement durant les périodes allant de quelques secondes à plusieurs minutes 1. À l&#39;autre extrémité du spectre de la contrainte de cisaillement dans les artérioles peuvent atteindre 100 dynes / cm 2 2. L&#39;impact de la contrainte de cisaillement sur ​​différents processus biologiques a été clairement démontré que, par exemple lors de l&#39;interaction des leucocytes avec les 3 endothélium. Pour prendre en compte ce paramètre mécanique dans le processus d&#39;adhésion bactérienne, nous avons profité d&#39;une procédure expérimentale basée sur l&#39;utilisation d&#39;un flux jetables chambre 4. Les cellules hôtes sont cultivées dans la chambre de circulation et de bactéries fluorescentes sont introduits dans le flux contrôlé par une pompe seringue. Nous avons d&#39;abord concentré nos recherches sur le bactériennes pathogènes de Neisseria meningitidis, une bactérie Gram-négatif responsable de la septicémie et la méningite. La procédure décrite ici nous a permis d&#39;étudier l&#39;impact de la contrainte de cisaillement sur ​​la capacité des bactéries à: adhérer aux cellules 1, à proliférer à la surface cellulaire et 5 pour détacher à coloniser de nouveaux sites 6 (figure 1). Des informations techniques complémentaires peuvent être trouvés dans la référence 7. Les valeurs des contraintes de cisaillement présentées ici ont été choisis en fonction de notre expérience précédente 1 et pour représenter les valeurs trouvées dans la littérature. Le protocole devrait être applicable à une large gamme de pathogènes avec des ajustements spécifiques en fonction des objectifs de l&#39;étude.

Pendant le processus d&#39;infection, une étape clé est l&#39;adhésion des agents pathogènes avec les cellules hôtes. Dans la plupart des cas, cette étape d&#39;adhésion a lieu en présence de contraintes mécaniques générées par l&#39;écoulement liquide. Nous décrivons une technique qui introduit la contrainte de cisaillement comme un paramètre important dans l&#39;étude de l&#39;adhésion bactérienne.

Présentation de contrainte de cisaillement dans l&#39;étude de l&#39;adhésion bactérienne

Lors d'infections bactériennes, une séquence d'interactions se produit entre l'agent pathogène et son hôte. L'adhésion bactérienne à la surface de la cellule hôte est souvent la ...

Cette vidéo illustre une procédure permettant d'étudier les effets du cisaillement sur l'adhésion bactérienne. Lors d'une infection sévère par un agent pathogène bactérien tel que *Neisseria meningitidis*, le pathogène pénètre dans la circulation sanguine, où il s'attache aux cellules de l'hôte et s'y développe sous l'effet des contraintes mécaniques exercées par le flux sanguin. Après une phase de prolifération, certaines bactéries se détachent et colonisent de nouveaux sites, répétant ainsi le cycle. Afin d'étudier les facteurs influençant l'adhésion bactérienne aux cellules hôtes, des cellules endothéliales sont introduites dans des chambres d'écoulement jetables et mises en culture afin d'obtenir une confluence cellulaire.Des bactéries fluorescentes sont ajoutées et le stress de cisaillement est contrôlé expérimentalement. À l’aide d’une pompe à seringue, l’adhésion des bactéries aux cellules hôtes et leur prolifération sont suivies par microscopie. Les vidéos obtenues sont analysées afin de déterminer l’effet du stress de cisaillement sur le processus de colonisation de l’endothélium.Cette procédure peut être très utile pour étudier la pathogénie de la méningite à *N. meningitidis*, mais elle peut également être utilisée pour d'autres bactéries soumises à des contraintes de cisaillement au cours du processus de pathogénie. Cette technique peut être un peu délicate à réaliser, en particulier lorsqu'il s'agit d'introduire des bulles dans le système, ce qui peut poser problème. Aujourd'hui, la procédure sera démontrée par Mega, une étudiante en doctorat travaillant dans mon laboratoire.Les expériences décrites dans cette vidéo sont réalisées à l’aide de cellules cultivées dans une lamelle micro IDI six 0,4, constituée d’une lamelle en plastique stérile jetable contenant six canaux de 17 millimètres de long et de 3,8 millimètres de large, d’une profondeur de 0,4 millimètre. Chaque canal possède deux ports d’accès équipés d’adaptateurs Luer, situés à chaque extrémité, permettant d’introduire les cellules UVE. Introduisez 30 microlitres d’une suspension cellulaire à une concentration de 1 × 10⁶ cellules dans chacun des canaux de la lamelle. Laissez les cellules s’adhérer pendant trois heures à 37 °C dans un incubateur humidifié avec une atmosphère de 5 % CO₂.Après l'incubation, ajouter 120 microlitres supplémentaires de milieu SFM endo. Les cellules doivent former une monocouche subconfluente après environ 20 heures pour remplir les puits. Entre-temps, réaliser des stries de *Neisseria meningitidis* exprimant la GFP sur des boîtes APL ; cette bactérie est un agent pathogène humain.Par conséquent, toute manipulation de cet microorganisme doit être effectuée dans une installation de niveau de sécurité deux, par du personnel formé portant une blouse et des gants ; la vaccination du personnel contre le groupe sérologique utilisé est recommandée. Voici la souche 8 0 1 3. Exprimant la GFP, elle est cultivée sous le contrôle d'un promoteur inductible IPDG en strie.Les bactéries sur les milieux GC BPL contenant des suppléments Kellogg et cinq microgrammes par millilitre de chloramphénicol sont incubées à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5 % de CO₂ pendant 16 heures. Une fois les cultures de cellules mammaires établies, les bactéries sont ajoutées aux cellules hôtes dans le canal. En préparation de l’essai d’écoulement, prélever les bactéries à l’aide d’un anneau d’ensemencement depuis la boîte de Pétri et les transférer dans un tube conique de 50 millilitres contenant un milieu de culture cellulaire endothéliale supplémenté et préchauffé.Milieu Endo SFM. Ajuster la densité optique à une DO 600 de 0,05 en diluant l'échantillon dans le même milieu jusqu'à un volume final de cinq millilitres. Pour induire l'expression de la GFP, ajouter l'IPTG à une concentration finale de un millimolaire et incuber la culture pendant 120 minutes.Dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 avec agitation douce. Placez la lame microscopique contenant les cellules endothéliales cultivées préparées précédemment sur la platine d'un microscope inversé équipé d'une plateforme chauffée afin de maintenir la température de l'échantillon à 37 degrés Celsius. Versez le milieu endo SFM préchauffé supplémenté avec 2 % de FBS dans un haut-parleur en verre stérile et remplissez la seringue de 50 millilitres en tirant sur le piston.Le tube d'entrée est relié à un robinet à trois voies. Ensuite, fixez le tube d'entrée à la seringue et appuyez sur le piston pour remplir le tube avec le milieu. Reliez soigneusement l'autre extrémité du tube d'entrée à la micro-lamelle en utilisant les raccords en angle droit fournis.Évitez d'introduire de l'air dans la chambre. Placez la seringue sur la pompe, puis fixez une seringue coupée d'un millilitre sur l'emplacement disponible du robinet en T afin de l'utiliser comme réservoir. Fixez ensuite le tube de sortie à l'autre extrémité du canal et remplissez soigneusement le canal avec le milieu en appuyant sur le piston de la seringue, jusqu'à environ un centimètre du point de sortie de la chambre.Mesurez la DO à 600 nm des bactéries et ajustez-la à 0,15 dans du milieu SFM endo contenant 2 % de FBS comme précédemment, puis vortexez vigoureusement l'échantillon pour rompre les agrégats bactériens. Ensuite, à l’aide d’une pipette Pasteur jetable, transférez 100 microlitres de milieu endo fm supplémenté avec 2 % de FBS dans le réservoir. Puis aspirez 100 microlitres de la solution bactérienne depuis le haut de la solution vortexée et ajoutez-la au réservoir.Retournez soigneusement le robinet, injectez les bactéries dans la chambre de la lamelle microscopique pour permettre l'adhérence en présence d'un niveau contrôlé de contrainte de cisaillement. Introduisez le milieu SFM endo contenant 2 % de FBS dans la chambre à l'aide de la pompe à seringue à raison de 3,5 millilitres par heure pendant 15 minutes. Cette vidéo est accélérée 60 fois.La durée réelle est de 10 minutes. Après cette étape, l'adhérence et le détachement des bactéries aux cellules hôtes dans diverses conditions peuvent être évalués, comme cela sera décrit dans les sections suivantes de la vidéo. Pour quantifier l'adhérence initiale des bactéries individuelles aux cellules hôtes, commencez l'acquisition d'images après 15 minutes d'écoulement, pendant que le liquide circule encore ; acquérez des images de 10 champs aléatoires afin de déterminer le nombre moyen de bactéries adhérentes par champ observé.Commencez par ouvrir le logiciel Image Day et ouvrez l'image à analyser. Commencez par cliquer sur le menu image et sélectionnez. Ajustez le contraste et la luminosité.Optimisez la visualisation des bactéries fluorescentes individuelles adhérentes par rapport au fond en ajustant les niveaux d'intensité à l'aide du curseur. Ensuite, dans le plugin, ouvrez le menu de comptage des cellules. Lancez l'outil de comptage des cellules, initialisez l'image, sélectionnez l'objet, le type, puis cliquez sur chacune des bactéries individuelles.Le nombre total de bactéries apparaît dans la fenêtre. Enfin, exportez les données de chaque image vers Excel et faites la moyenne pour quantifier le nombre moyen de bactéries adhérentes par champ afin de mesurer la résistance au flux des bactéries adhérentes individuelles. Après les 15 minutes initiales du programme d'écoulement, la pompe à seringue est réglée pour générer une contrainte de cisaillement allant de trois à 100 dynes par centimètre carré pendant cinq minutes.À la fin des cinq minutes, arrêtez l'écoulement et acquérez et analysez 10 champs aléatoires comme précédemment afin de déterminer le nombre moyen de bactéries restantes par champ. Après les 15 premières minutes d'écoulement, réglez la pompe à seringue sur la contrainte de cisaillement choisie. Laissez s'écouler pendant plusieurs heures, en enregistrant des images à raison d'une image toutes les cinq minutes.Idéalement, plusieurs positions peuvent être suivies si le microscope est équipé d'une plateforme motorisée XY. Après la microscopie vidéo, arrêtez le cisaillement en arrêtant la pompe à seringue. Acquérez immédiatement deux à trois images supplémentaires, puis mettez fin à la séquence d'acquisition d'images dans le logiciel.Un exemple de prolifération bactérienne est visible ici. Enfin, pour analyser les images, utilisez le menu de réglage du seuil d'image J pour convertir les images en binaire. Ensuite, dans le menu analyser sous paramètres de mesure, sélectionnez la mesure de la surface.Ensuite, utilisez l'outil d'analyse des particules pour déterminer automatiquement la taille des colonies. De grandes microcolonies se forment à la surface cellulaire après cinq à sept heures, qu'un flux soit maintenu ou non à ce stade. Pour mesurer la résistance des microcolonies au flux, acquérez d'abord deux à trois images des deux cellules en contraste de phase et des bactéries par fluorescence GFP.Appliquez un fort stress de cisaillement pendant cinq minutes et prenez des images de fluorescence à raison d'une image toutes les cinq secondes. Arrêtez le stress de cisaillement en éteignant la pompe à seringue. Acquérez deux à trois images supplémentaires, puis interrompez la séquence d'acquisition d'images dans le logiciel avant de recueillir le milieu pour un dosage par étalage.Commencez par retirer le tube de sortie en prenant soin d'éviter de vider le canal. Ajoutez du milieu frais préalablement réchauffé pour remplir les puits. Ensuite, retirez le tube d'entrée et récupérez le milieu restant à l’aide d’une micropipette, puis transférez-le dans un tube de microcentrifugation. Pour éliminer tout milieu résiduel du canal, rincez la lame microscopique deux fois en ajoutant 120 microlitres de PBS dans le canal.Incliner la lame deux fois et éliminer le milieu. Pour recueillir les cellules infectées, ajouter 50 microlitres de trypsine-EDTA sur la micro-lame et incuber cinq minutes à 37 degrés pour les détacher du canal, puis mélanger cet échantillon détaché avec une suspension recueillie à l'étape précédente. Après avoir effectué une dilution sériée dans la plaque PBS, déposer des fractions de 10 microlitres sur des plaques gélosées GCB et incuber en triplicata à 37 degrés Celsius sous 5 % de CO₂ pendant une nuit.Le lendemain, déterminez le nombre d'unités formant colonies afin d'évaluer le détachement bactérien des microcolonies. Infectez les cellules dans la chambre d'écoulement comme précédemment, à faible débit (3,5 millilitres par heure). Après 30 minutes, éliminez les bactéries non liées en augmentant le débit à cinq millilitres par minute pendant deux minutes, puis revenez au faible débit de 3,5 millilitres par heure et laissez l'infection se poursuivre pendant deux heures. Ensuite, chaque heure, recueillez une goutte de milieu sortant de la chambre d'écoulement dans un tube de microcentrifugeuse pendant quatre heures.Une fois tous les échantillons collectés, déterminez le nombre d'unités formant colonies comme précédemment. Il s'agit d'une représentation graphique de l'adhésion initiale des bactéries à la surface cellulaire. Chaque courbe sur le graphique représente le nombre cumulé de bactéries liées dans un champ donné en fonction du temps.Les valeurs de trois champs sont indiquées afin de donner une idée de la variation d'un champ à l'autre attendue après la prolifération à la surface cellulaire. La résistance mécanique des microcolonies a été testée en augmentant le cisaillement jusqu'à 10 dymes par centimètre carré ; toutefois, tandis que les microcolonies de type sauvage sont résistantes, celles formées par le mutant pilV sont perturbées par l'augmentation du flux. Ce mutant ne parvient pas à induire le remodelage de la membrane plasmique au sein des microcolonies et est donc plus sensible à l'augmentation du stress de cisaillement après son développement.Cette technique a ouvert la voie à d'autres chercheurs dans le domaine des maladies infectieuses pour explorer l'impact du stress de cisaillement sur l'interaction de divers agents pathogènes avec différents types cellulaires. N'oubliez pas que le travail avec des agents pathogènes humains peut être extrêmement dangereux et que des précautions appropriées, telles que des mesures de niveau deux ou trois, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Source : Ditkowski, B., et al. Un modèle in vitro d’un système de perfusion à plaques parallèles pour étudier l’adhésion bactérienne aux tissus greffés. J. Vis. Exp. (2019).Cette vidéo démontre la méthode d’utilisation d’une chambre de flux à plaques parallèles pour perfuser des bactéries marquées fluorescentement sur les tissus de greffe vasculaire, permettant une analyse contrôlée de l’adhésion bactérienne et de la pathogénie précoce en conditions de cisaillement.

Modèle in vitro à flux parallèle de plaques pour étudier l’adhésion bactérienne lors d’une biopsie tissulaire

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates an in vivo method for analyzing shear-dependent bacterial adhesion in a live mouse model. Following surgical preparation and catheterization, the mesenteric vasculature is exposed for real-time imaging under a fluorescence microscope. Perfusion with an ionophore and fluorescently labeled bacteria reveals how shear stress triggers...

An In Vivo Model to Study Shear-Dependent Bacterial Adhesion

Pour étudier l’interaction des bactéries avec les vaisseaux sanguins sous contrainte de cisaillement, une chambre d’écoulement et un modèle de microscopie intravitale mésentérique in vivo sont décrits qui permettent de disséquer les facteurs bactériens et hôtes contribuant à l’adhésion vasculaire.

In vitro et in vivo modèle pour étudier l&#39;adhésion bactérienne au navire muraux dans des conditions de débit

L’attachement bactérien aux cellules hôtes est une étape clé lors de la colonisation et de l’infection de l’hôte. Ce protocole décrit la génération d’adhésines recombinantes couplées à des polymères en tant que matériaux biomimétiques qui permettent d’analyser la contribution des adhésines individuelles à ces processus, indépendamment d’autres facteurs bactériens.

Matériaux biomimétiques à caractériser les interactions bactéries-hôtes

Ce test d'adhésion de flux fournit un modèle d'impact simple, élevé d'interactions cellulaires de cellules épithéliales T. Une pompe à seringue est utilisée pour générer une contrainte de cisaillement, et la microscopie confocale capture des images pour la quantification. Le but de ces études est de quantifier efficacement l'adhérence des cellules T en utilisant des conditions d'écoulement.

Dosage de Adhérence Sous contrainte de cisaillement pour l&#39;étude des lymphocytes T-Adhesion Molecule Interactions

adhérences de surface cellulaire sont au cœur de la mécanotransduction, car ils transmettent une tension mécanique et d'initier les voies de signalisation impliquées dans l'homéostasie et le développement des tissus. Ici, nous présentons un protocole pour disséquer les voies biochimiques qui sont activés en réponse à une tension, en utilisant des microbilles magnétiques revêtues de ligand et l'application de la force sur les récepteurs d'adhérence.

Analyse de surface cellulaire Adhérence remodelage en réponse à la tension mécanique utilisant des billes magnétiques

Nous avons développé un test multipuits format polyacrylamide pour sonder l’effet de la rigidité de la matrice extracellulaire sur une infection bactérienne de cellules adhérentes. Ce dosage est compatible avec la cytométrie en flux, immuno-coloration et microscopie de force de traction, ce qui permet des mesures quantitatives des biomécaniques interactions entre cellules, leur matrice extracellulaire et des bactéries pathogènes.

Un test multipuits Format Polyacrylamide pour étudier l’effet de la rigidité de la matrice extracellulaire sur l’Infection bactérienne de cellules adhérentes

Nous décrivons ici l’utilisation d’un bioréacteur de microfluidique un débit plus élevé couplé avec un microscope à fluorescence pour l’analyse des effets de la contrainte de cisaillement sur les biofilms de Pseudomonas aeruginosa exprimant des protéines fluorescentes vertes, y compris les instruments mettre en place, la détermination des propriétés morphologiques, taux de croissance et couverture de biofilm.

Cellule analyse de contrainte de cisaillement en direct sur Pseudomonas aeruginosa en utilisant un système automatisé de microfluidique de débit supérieur

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Examiner la dynamique de l'adhérence cellulaire et la propagation des cellules épithéliales sur la fibronectine pendant le stress oxydatif

Ce protocole présente les procédures expérimentales pour effectuer le test d’empreinte d’adhérence afin d’imager les événements d’adhérence pendant l’adhésion rapide des cellules.

Imagerie de l’adhésion moléculaire dans le laminage cellulaire par essai d’empreinte d’adhérence

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