Présentation de contrainte de cisaillement dans l'étude de l'adhésion bactérienne

Cette vidéo montre une procédure d’étude des effets du stress pur sur l’adhésion bactérienne. Lors d’une infection sévère par un pathogène bactérien tel que le gentil sirium mens, l’agent pathogène atteint la circulation sanguine là-bas, il se fixe et colonise les cellules hôtes tandis que sous le stress mécanique du sang circulant suite à la prolifération, certaines bactéries se détachent et colonisent de nouveaux sites et le cycle recommence pour étudier les facteurs qui affectent l’adhésion bactérienne aux cellules hôtes. Les cellules endothéliales sont introduites dans des chambres d’écoulement et de culture jetables pour permettre aux cellules d’atteindre la confluence.

Des bactéries fluorescentes sont ajoutées et le stress pur est contrôlé expérimentalement. À l’aide d’un tire-seringue, l’adhésion de la bactérie aux cellules hôtes et la prolifération sont suivies au microscope. Les vidéos résultantes sont analysées pour déterminer l’effet de la contrainte de cisaillement sur le processus de colonisation de l’endothélium.

Cette procédure peut être très utile pour étudier la pathogenèse de la méningite de Nice, mais elle peut également être utilisée pour d’autres bactéries qui sont soumises à un stress de cisaillement tout au long du processus de pathogenèse. Cette technique peut être un peu délicate à mettre en œuvre, en particulier lorsqu’il s’agit d’introduire des bulles dans le système, ce qui peut être un problème. Donc, aujourd’hui, la démonstration de la procédure sera méga, un doctorant travaillant dans mon laboratoire.

Les expériences décrites dans cette vidéo sont réalisées à l’aide de cellules cultivées dans une micro-lame IDI six 0,4 composée d’une lame en plastique stérile jetable contenant six canaux de 17 millimètres de long et 3,8 millimètres de large et de 0,4 millimètre de profondeur. Chaque canal dispose de deux ports d’accès avec des adaptateurs de leurre, un à chaque extrémité pour introduire des cellules UVE, pipette 30 microlitres d’une fois 10 à la suspension à six cellules dans chacun des canaux. Sur la lame, laissez les cellules adhérer pendant trois heures à 37 degrés et un incubateur humidifié avec une atmosphère de 5 % de CO2.

Après l’incubation, ajoutez 120 microlitres supplémentaires d’endo SFM. Pour remplir les puits, les cellules doivent former une monocouche sub-confluente après environ 20 heures. Entre-temps, la protéine GFP exprimant une belle méningite à sirium sur les APL, la bactérie est un agent pathogène humain.

Par conséquent, toute manipulation de ce micro-organisme doit être effectuée dans une installation de sécurité de niveau deux avec du personnel formé portant une blouse et des gants, la vaccination du personnel contre le groupe sérologique utilisé est recommandée. Voici la souche 8 0 1 3. L’expression de la GFP est cultivée sous le contrôle d’une traînée de promoteur inductible par l’IPDG.

Les bactéries sur les BPL GC contenant des suppléments Kellogg et cinq microgrammes par millilitre de chloramphénicol dans un incubateur à 37 degrés Celsius 5 % de CO2 pendant 16 heures. Une fois que les cultures de cellules de mammifères sont établies, des bactéries sont ajoutées aux cellules hôtes dans le canal. En préparation de l’essai en flux, à l’aide d’une boucle d’inoculation, prélever les bactéries de la boîte de Pétri, les transférer dans un tube conique de 50 millilitres contenant une culture de cellules endothéliales préchauffée et supplémentée.

Endo SFM moyen. Ajustez la densité optique à un OD 600 de 0,05 en diluant l’échantillon dans le même milieu jusqu’à un volume final de cinq millilitres. Pour induire l’expression de la GFP, ajoutez IPTG à une concentration finale d’un millimolaire et incubez la culture pendant 120 minutes.

Dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius 5 % de CO2 avec une légère agitation. Placez la microlame avec des cellules endothéliales cultivées préparées plus tôt sur la platine d’un microscope inversé équipé d’une plate-forme chauffée pour maintenir la température de l’échantillon à 37 degrés Celsius. Versez l’endo SFM préchauffé complété par 2 % de FBS dans un haut-parleur en verre stérile et remplissez la seringue de 50 millilitres en tirant sur le piston.

Le tube d’entrée est relié à un robinet d’arrêt à trois voies. Ensuite, fixez le tube d’entrée à la seringue et appuyez sur le piston pour remplir le tube de fluide. Connectez soigneusement l’autre extrémité du tube d’entrée à la micro-glissière à l’aide des connecteurs à angle droit fournis.

Évitez d’introduire de l’air dans la chambre. Placez la seringue sur la pompe, puis placez une seringue coupée d’un millilitre sur la fente disponible sur le robinet d’arrêt en guise de réservoir. Fixez ensuite le tube de sortie à l’autre extrémité du canal et remplissez soigneusement le canal de fluide en poussant sur le piston de la seringue à une distance d’environ un centimètre de la sortie de la chambre.

Mesurez la DO bactérienne 600 et ajustez à 0,15 et endo SFM contenant 2 % FBS comme précédemment, tourbillonnez vigoureusement l’échantillon pour perturber les agrégats bactériens. Ensuite, à l’aide d’une pipette de pâturage en plastique jetable, transférez 100 microlitres d’endos fm, complétés par un milieu FBS à 2 % dans le réservoir. Ensuite, aspirez 100 microlitres de la solution bactérienne par le haut de la solution vortex et ajoutez-la dans le réservoir.

Tournez délicatement le robinet d’arrêt, injectez les bactéries dans la chambre de la micro-lame pour permettre à l’adhérence de se poursuivre en présence d’un niveau de contrainte de soc contrôlé. Introduire l’endo SFM contenant 2 % de FBS dans la chambre à l’aide du pousse-seringue à raison de 3,5 millilitres par heure pendant 15 minutes. Cette vidéo est accélérée 60 fois.

La durée réelle est de 10 minutes. Après cette étape, l’adhésion et le détachement des bactéries aux cellules hôtes dans diverses conditions peuvent être évalués et décrits dans les prochaines sections de la vidéo. Pour quantifier l’adhésion initiale des bactéries individuelles aux cellules hôtes, commencez à acquérir des images après 15 minutes d’écoulement alors que le liquide circule encore, acquérez des images de 10 champs aléatoires pour déterminer le nombre moyen de bactéries adhérentes par champ imagé.

Commencez par ouvrir le logiciel de jour d’image et ouvrez l’image à analyser. Commencez par cliquer sur le menu de l’image et sélectionnez. Ajustez le contraste de luminosité.

Optimisez la visualisation des bactéries fluorescentes adhérentes individuelles sur l’arrière-plan en ajustant les niveaux d’intensité en déplaçant le curseur. Ensuite, dans le plugin, analysez le menu du compteur de cellules. Ouvrez l’outil de comptage de cellules, initialisez l’image, choisissez l’objet, tapez et cliquez sur chaque bactérie individuelle.

Le nombre total de bactéries apparaît dans la fenêtre. Enfin, exportez les données de chaque image pour exceller et faire la moyenne pour quantifier le nombre moyen de bactéries adhérentes par champ afin de mesurer la résistance des bactéries adhérentes individuelles à l’écoulement. Après les 15 premières minutes de programme d’écoulement, la pompe à seringue est configurée pour générer une contrainte de cisaillement allant de trois à 100 centimes par centimètre carré pendant cinq minutes.

À la fin des cinq minutes, arrêtez le flux et acquérez et analysez 10 champs aléatoires comme précédemment pour déterminer le nombre moyen de bactéries restantes par champ. Après les 15 premières minutes de débit, ajustez la pompe à seringue à la contrainte de cisaillement sélectionnée. Laissez-le couler pendant plusieurs heures, en enregistrant des images à raison d’une image toutes les cinq minutes.

Idéalement, plusieurs positions peuvent être suivies si le microscope est équipé d’une plate-forme XY motorisée. Après la microscopie vidéo, arrêtez le stress pur et simple en éteignant le pousse-seringue. Acquérez immédiatement deux à trois images supplémentaires, puis arrêtez la séquence d’acquisition d’images sur le logiciel.

Un exemple de prolifération bactérienne peut être vu ici. Enfin, pour analyser les images, utilisez le menu de seuil d’ajustement de l’image J’s pour convertir les images en binaire. Ensuite, dans le menu d’analyse, sous Définir la mesure, sélectionnez la mesure de surface.

Utilisez ensuite l’outil d’analyse des particules pour déterminer automatiquement la taille des colonies. De grandes microcolonies se forment à la surface cellulaire après cinq à sept heures, que le flux soit maintenu ou non à ce stade. Pour mesurer d’abord la résistance des microcolonies à l’écoulement, il faut d’abord acquérir deux à trois images des deux cellules par contraste de phase et des bactéries par fluorescence GFP.

Appliquez une contrainte de cisaillement élevée pendant cinq minutes et prenez des images de fluorescence à une image toutes les cinq secondes. Arrêtez la contrainte de cisaillement en éteignant le tire-seringue. Acquérez deux à trois images supplémentaires, puis arrêtez la séquence d’acquisition d’images sur le logiciel à côté de la collecte du support pour un test de placage.

Tout d’abord, retirez le tube de sortie en prenant soin d’éviter de vider le canal. Ajouter du milieu frais préchauffé pour remplir les puits. Retirez ensuite le tube d’entrée et récupérez le fluide restant à l’aide d’une micro-pipette et transférez-le dans un micro tube de centrifugation Pour retirer tout fluide restant du canal, rincez deux fois la micro-lame en ajoutant 120 microlitres de PBS au canal.

Incliner la glissière deux fois et jeter le support. Pour collecter les cellules infectées, ajoutez 50 microlitres de tripsin EDTA à la micro lame et incubez pendant cinq minutes à 37 degrés pour les détacher du canal et mélangez cet échantillon détaché avec une suspension collectée à l’étape précédente. Après avoir effectué une dilution en série dans une plaque PBS, 10 fractions microlitres sur des plaques agricoles GCB et un triplat ont incubé 37 degrés Celsius 5 % CO2 pendant la nuit.

Le lendemain, déterminez le nombre d’unités formant une colonie pour évaluer le détachement bactérien des microcolonies. Infectez les cellules dans la chambre d’écoulement comme auparavant à faible débit de 3,5 millilitres par heure après 30 minutes, éliminez les bactéries non liées en augmentant le débit à cinq millilitres par minute pendant une période de deux minutes, puis revenez à un faible débit de 3,5 millilitres par heure et laissez l’infection se poursuivre pendant deux heures. Ensuite, toutes les heures, récupérez une goutte de fluide sortant de la chambre d’écoulement dans un micro-tube de centrifugation pendant quatre heures.

Une fois que tous les échantillons ont été prélevés, déterminez le nombre d’unités formant colonie comme précédemment. Il s’agit d’une représentation graphique de l’adhésion initiale des bactéries à la surface cellulaire. Chaque ligne du graphique représente le nombre cumulé de bactéries liées dans un champ donné en fonction du temps.

Les valeurs de trois champs sont indiquées pour donner une idée de la variation d’un champ à l’autre qui est attendue après la prolifération à la surface cellulaire. La résistance mécanique des micro-colonies a été testée en augmentant le niveau de contrainte de cisaillement à 10 dines par centimètre carré, mais alors que les micro-colonies de type sont résistantes, les micro-colonies formées par la pilule v mutant sont perturbées par l’augmentation du débit. Ce mutant ne parvient pas à induire le remodelage de la membrane plasmique sous les micro-colonies et est donc plus sensible à l’augmentation de la contrainte de cisaillement après son développement.

Cette technique a ouvert la voie à d’autres chercheurs dans le domaine des maladies infectieuses pour explorer l’impact du stress de cisaillement sur l’interaction de divers agents pathogènes avec différents types de cellules. N’oubliez pas que travailler avec des agents pathogènes humains peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que des mesures de niveau deux ou trois, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.