ARNi Mediated inactivation génique et la transgénèse par microinjection dans le nématode Necromenic Pristionchus pacificus

L'objectif général de cette procédure est de transformer avec succès de l'ADN étranger et d'inhiber la fonction d'un gène chez les nématodes Priyanka Pacificus. Pour la transgénèse, commencez par préparer l'ADN génomique approprié avec des extrémités cohésives compatibles.

Pour l'interférence ARN, synthétisez le gène d'intérêt à l'aide d'un kit de transcription d'ARN double brin. Ensuite, injectez par microinjection les PRIs DIANCA pacificus avec l'ADN ou l'ARN double brin. Analysez la descendance F1 pour le phénotype marqueur sélectionné en cas de transgénèse, et sélectionnez les individus présentant le phénotype d'extinction génique en cas d'interférence ARN.

Continuez à surveiller les résultats de F deux vers transgéniques afin d'obtenir des résultats montrant des expressions géniques spécifiques à l'aide d'un rapporteur GFP par microscopie de fluorescence. Bonjour, je suis Ray Hong, de l'Université d'État de Californie à Northridge, et cette démonstration décrira les étapes de manipulation génétique chez des nématodes spécifiques à Pristi. Chez un organisme modèle émergent, la réalisation d'ARNi et de truss Genesis permet de répondre à des questions clés en biologie du développement et en comportement en caractérisant les fonctions et expressions géniques.

Les personnes novices avec cette méthode tireront profit d'une démonstration montrant comment placer le ver sur le coussin d'injection et comment l'injecter dans le bon plan focal où les gons sont visibles. Contrairement aux gans, les goads SCA spécifiques se croisent dorsalement et migrent progressivement au fur et à mesure que le nématode se développe du stade J4 tardif jusqu'au stade adulte. En outre, de l'ADN génomique digéré avec des enzymes de restriction compatibles doit être ajouté à vos transgènes et au marqueur de co-injection afin de préparer votre mélange d'injection.

Jessica Single poin lab dans mon laboratoire démontrera la microinjection dans le cas spécifique des PRIs pour la transgénèse. Des constructions d'ADN 3D sont nécessaires pour l'injection du marqueur dominant de co-injection. Les constructions d'ADN génomique et le transgène rapporteur cible sont digérés avec des enzymes de restriction compatibles. Les constructions d'ADN sont récupérées à l'aide d'un protocole de précipitation à l'éthanol.Appel.

Le mélange d'injection est préparé aux concentrations indiquées dans le tableau. Vérifiez les réglages du manomètre de la bouteille d'azote. Chargez maintenant un à deux microlitres de mélange d'injection dans l'aiguille.

Placer l'aiguille dans le manipulateur de microinjection. Casser la pointe de l'aiguille en la touchant légèrement au bord d'un capillaire finement étiré placé sur une lame, puis la positionner en attente. Verser ensuite de l'huile de paraffine pour recouvrir la plaque contenant quatre vers jeunes adultes.

Prenez un unique ver et transférez-le sur un coussin d'injection. Sous la lentille, positionnez l'ovaire du ver dans l'axe de l'aiguille, avec le vulva orienté à l'opposé de l'aiguille. Abaissez ensuite l'aiguille jusqu'à ce qu'elle soit en position dans le champ du microscope.

Amener le gonade supérieur et l’aiguille dans le même plan focal. Piquer doucement le ver et injecter le mélange d’injection. Observer la séparation des œufs vers l’extrémité distale, signe d’une injection réussie.

Repositionnez l’aiguille pour injecter le gonade inférieur et répétez l'injection. Étant donné que ce gonade se trouve sous l’intestin, la dispersion des œufs ne sera pas visible, ce qui rend plus difficile l’évaluation du succès de l'injection. Toutefois, après l’injection, le ver doit rester intact sans présenter de gonades proéminentes.

Remettez l'aiguille en position inactive. Ajoutez une goutte de tampon M neuf pour récupérer le ver en utilisant quelques bactéries OP 50 prélevées à l’aide d’un pic. Touchez le ver avec les OP 50 afin qu’il adhère.

Transférez maintenant le ver sur une boîte contenant des gouttes de 50 microlitres d'OP50. Conservez les vers injectés à 20 degrés Celsius pendant environ quatre jours afin qu'ils pondent et que les F1 se développent. Examinez maintenant les vers pour le phénotype sélectionné.

Prélevez individuellement les F un présentant le phénotype observé et placez-les sur une nouvelle boîte ensemencée ; conservez-les à 25 degrés Celsius. Enfin, pour les lignées transgéniques, transférez individuellement les F deux dans des boîtes séparées. Conservez les générations suivantes à 20 degrés Celsius.

La manipulation de la fonction des gènes au niveau de l'organisme par ARNi et transgénèse constitue un aspect fondamental du modèle Ppac pacificus en biologie évolutive du développement. Contrairement à un ver de type sauvage représenté à gauche, la lignée transgénique stable F quatre PPR L trois produit un phénotype dominant « roller » présentant une expression de la GFP dans les neurones céphaliques. Inversement, cette expérience d'ARNi génère des mutants PRL un qui montrent une abolition complète de la locomotion en rouleau habituellement observée chez le mutant PRL un « roller » avec gain de fonction TU 92. Une fois maîtrisée, chaque injection peut être réalisée en cinq minutes. Il est important de garder à l'esprit que tous les F deux issus de lignées transgéniques F1 indépendantes doivent être sélectionnés individuellement afin d'établir des lignées F deux promi indépendantes.

Cela s'explique par le fait que nous avons observé une expression de la GFP très variable parmi les lignées F2, et que la transmission du phénotype « roller » ne corrèle pas avec le niveau d'expression de la G.