Cartographie optique de potentiels d'action et les transitoires de calcium dans le cœur de la souris

L’objectif global de cette procédure est de cartographier optiquement simultanément le potentiel transmembranaire et le transitoire calcique intracellulaire dans des cœurs de souris isolés intacts et perfusés de LOR. Ceci est accompli en excisant d’abord le cœur intact de la souris, puis en canulant l’aorte et en commençant la perfusion LOR. L’étape suivante consiste à immobiliser le cœur en chargeant une contraction d’excitation sur le coupleur, puis en fixant le cœur à la chambre de perfusion.

Les dernières étapes consistent à charger les colorants optiques et à faire des préparatifs pour réduire les artefacts de mouvement pendant l’expérience. Les images optiques sont obtenues en collectant la lumière émise par le cœur avec mes caméras Ultima LC Moss. Hé, je m’appelle di.

Je suis étudiant diplômé à l’Université de Washington. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme les micro-électrodes, est que la cartographie optique permet une plus grande résolution spatiale sur toute la surface du cœur. Bonjour, je m’appelle Matt Sulkin.

Je suis étudiant diplômé à l’Université de Washington. Cette méthode, si elle est effectuée correctement, peut aider à répondre à de nombreuses questions en électrophysiologie cardiaque, telles que la base de l’arythmogenèse. Commencez par configurer une pompe péristaltique pour faire circuler les solutions à 40 millilitres par minute.

Réglez ensuite une deuxième pompe péristaltique à 80 millilitres par minute. Cette pompe ramène le Perfuse eight dans le réservoir de rétention et d’oxygénation. Allumez les pompes et lavez le système avec un litre, 70 % d’éthanol pendant 30 minutes avec recirculation.

Faites suivre ce lavage de deux litres d’eau déminéralisée sans recirculation. Une fois l’eau évacuée, faites circuler deux litres de solution Tyro et passez-la à travers un filtre de cinq microns. Réchauffez les huit à 37 degrés Celsius perfusés avec une chemise d’eau et une bulle de circulation pour injecter du gaz oxygéné dans la solution.

Ajustez le taux de bulles de gaz pour maintenir le pH à 7,35 plus ou moins 0,05. Surveillez à la fois le pH et la température pendant l’expérience. L’appareil de cartographie optique double se compose de deux caméras C Moss à grande vitesse qui peuvent capturer une image de 100 x 100 pixels à 3000 images par seconde.

Fixez un filtre passe-bande à la caméra d’imagerie calcique et fixez un filtre passe-long à la caméra d’imagerie de tension sur un support de caméra double. Fixez un miroir diique et une lentille de sorte que la lumière d’émission provenant du cœur soit focalisée sur le miroir par la lentille. Fixez également deux appareils photo au support et disposez-les de manière à ce qu’ils soient perpendiculaires l’un à l’autre.

Ensuite, configurez le voyant d’excitation. La lumière est générée par une lampe halogène et dirigée à travers un guide de lumière flexible. Faites passer la lumière à travers un filtre thermique, un obturateur pour limiter l’exposition et un filtre passe-bande d’excitation.

Enfin, préparez les électrodes d’argent et de chlorure d’argent en les installant dans la chambre. Après avoir vérifié et ajusté les niveaux sur les amplificateurs et les filtres, la configuration est prête pour un cœur. Utilisez un cocktail de kétamine et de xylazine avec 100 unités d’héparine pour anesthésier une souris avant de continuer.

Assurez-vous que l’animal n’a pas de réflexe de douleur en pinçant les orteils. Après avoir fait une incision au milieu du sternal, retirez rapidement le cœur et les tissus environnants. Ensuite, à l’aide d’un microscope de dissection rapide, identifiez l’aorte et faites une coupe nette à travers l’aorte ascendante sous l’artère sous-clavière droite.

Attachez maintenant une courte section de l’aorte à une canule de calibre 21 faite sur mesure à l’aide de quatre sutures en soie tressée noire après la canulation rétro grandement perfu et super fusionner le cœur. Avec la solution Tyro, ajustez le débit pour maintenir la pression aortique entre 60 et 80 millimètres. Mercure mesuré par un transducteur de pression.

Maintenant, disséquez et retirez le thymus pulmonaire et le tissu adipeux environnants. Insérez maintenant un tube en silicone dans le ventricule gauche à travers les veines pulmonaires. Suturez le tube au tissu conjonctif voisin.

Cette étape très importante permet d’éviter la congestion et l’acidification de Perfuse eight coincé dans le ventricule gauche, en particulier après la suppression des contractions ventriculaires. Pour éviter les mouvements cardiaques induits par Perfuse eight, épinglez le cœur au bas de la chambre de perfusion recouverte d’un pare-couche à son sommet. De plus, étirez et épinglez les appendices auriculaires droit et gauche pour augmenter la surface des oreillettes en configuration verticale.

Cela maximisera la surface d’enregistrement. Pour effectuer les stimulations de stimulation, fixez une électrode sur mesure à la surface du cœur. Pour réduire les artefacts de mouvement, fixez un petit verre de protection sur le cœur à la surface de la solution.

Pour ce faire, coincez le verre entre plusieurs broches. Comme derniers préparatifs, concentrez la lumière d’excitation sur le cœur et positionnez les caméras pour obtenir une image optique, puis commencez par charger le colorant pendant le chargement des matrices. Surveillez en permanence les enregistrements ECG pour assurer une fonction électrique normale du cœur.

Commencez par réchauffer les statines BLE à température ambiante. Ensuite, mélangez un demi-millilitre de statine BLEs dans le huit profuse dans le réservoir de rétention, et diluez le 10e millilitre restant de statine BLEs dans un millilitre de solution Tyros. Au cours des 20 prochaines minutes, injectez lentement la statine BLE dans les tyros à travers un port de médicament près de la canule.

La statine BLE réduira progressivement l’artefact de mouvement. Ensuite, diluez 30 microlitres de colorant sensible à la tension dans une solution de tyro d’un millilitre et injectez lentement ce mélange pendant cinq à sept minutes dans le même port de médicament. Ensuite, faites à nouveau le même mélange.

Cette fois, en ajoutant 30 microlitres supplémentaires d’indicateur de calcium. Appliquez lentement ce mélange pendant cinq à 10 minutes à travers le même orifice. Après l’injection de l’indicateur de calcium, attendez cinq à 10 minutes supplémentaires pour que la statine BLE supprime complètement le mouvement et que les colorants pénètrent dans les cellules avant de poursuivre l’expérience.

Cette préparation cardiaque a été faite. Selon le protocole, les signaux ECG ont été enregistrés pendant la stimulation ventriculaire à partir de la stimulation S one S one. Les potentiels d’action et les signaux transitoires calciques ont été enregistrés à partir des oreillettes de gauche et des ventricules de droite.

La flèche indique où la diffusion du signal des ventricules s’est produite en regroupant les enregistrements de la caméra en unités de trois pixels par trois pixels, un tableau de transitoires calciques et de potentiels d’action peut être affiché à partir des données du réseau. Une figure montrant la conduction du potentiel d’action peut être construite. Les données provenant de trois points consécutifs sur l’axe transversal et longitudinal montrent le changement d’amplitude avec la propagation du potentiel d’action sur une surface ventriculaire.

De même, une figure montrant le potentiel d’action et les durées transitoires du calcium peut être construite. Cela montre une condition de contrôle à gauche à droite. Une injection d’isoprotérénol a été administrée au cœur, ce qui raccourcit clairement la durée des transitoires calciques et des potentiels d’action.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux à trois heures Suite à cette procédure. D’autres méthodes telles que le protocole de stimulation peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que celles concernant la période réfractaire du nœud AV.