Name: Cartographie optique de potentiels daction et les transitoires de calcium dans le cœur de la souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Découvrez la cartographie optique des potentiels d'action et des transitoires de calcium dans le cœur de souris isolé. Cette méthode offre une résolution spatiale supérieure pour étudier l'électrophysiologie cardiaque et les mécanismes des arythmies.

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NIH subventions R01 HL085369.

1. Préparation avancée des solutions de stock <ol><li> Préparer deux solutions de stock de solution de Tyrode (16x) à l'avance dans l'eau déminéralisée et de les stocker à 4 ° C: <ol class="lalpha"><li> Stock I (119.872 g / L de NaCl, 3,056 g / L de CaCl 2 (2H 2 O), 5,6 g / L de KCl, 2,6274 g / L NaH 2 PO 4, 3,408 g / L MgCl 2 (6H 2 O), (Fisher scientifique, Fair Lawn, NJ)); </li><li> Stock II (26,88 g / l NaHCO3, (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ)). </li></ol></li><li> Préparer des solutions stock de colorants fluorescents. Pour éviter la congélation et décongélation répétées, nous stockons 30 aliquotes des deux colorants à -20 ° C, ce qui est suffisant pour une expérience: <ol class="lalpha"><li> Sensibles au voltage solution stock de colorants RH237 (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1,25 mg / ml solution dans le diméthylsulfoxyde (DMSO, Sigma, St. Louis, MO); </li><li> Indicateur de calcium Rhod-deux heures solution stock (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1 mg / ml solution dans le DMSO. </li></ol></li><li> Préparer excitation-contraction solution stock découplant blebbistatin (Bioscience Tocris, St. Louis, MO, 2 mg / ml solution dans le DMSO) à l'avance et de stocker les blebbistatin dissous à 4 ° C. </li></ol> 2. Préparer des solutions de perfusion et de l'installation expérimentale 7 <ol start="4"><li> Fraîchement préparer la solution de Tyrode 2L de (128.2mM NaCl, CaCl 2 1,3 mm (2H 2 O), 4,7 KCl, MgCl 2 1,05 mm (6H 2 O), 1.19mM NaH 2 PO 4, 20mm de NaHCO 3, 11.1mm D-glucose dans l'eau, pH = 7,35 ± désionisée 0,05). Si la solution stock est utilisé pour faire des 2L solution de Tyrode (suffisant pour une expérience) de prendre 1750 ml d'eau déminéralisée et mélanger dans 125 ml de bouillon de I, 125 ml de bouillon de II, et 4g de glucose. </li><li> Allumez les deux pompes du système de perfusion. Régler la pompe péristaltique (Peri-Star, WPI, Sarasota, Etats-Unis) qui est utilisé pour perfusion rétrograde à 40 mL / min. Réglez la pompe péristaltique d'autres (Cole-Parmer Masterflex Pompe Peristalic L / S, Instrument Company Cole-Parmer, Vernon Hills, Illinois) qui est utilisé pour surfusion et de revenir le perfusat de retour au réservoir tenant à 80 mL / min. </li><li> Lavez le système de perfusion à l'éthanol 70% pendant 30 min puis à l'eau déminéralisée 2L. </li><li> Une fois toute l'eau déminéralisée est évacué de la chambre, faire circuler la solution de Tyrode et le passer à travers un filtre de 5 um (Millipore, Billerica, MA, Etats-Unis). Chauffer le perfusat à 37 ° C avec une chemise d'eau et circulateur (ThermoNESLAB EX7, Newtown, Etats-Unis) et d'oxygéner le perfusat par barbotage d'O 2 / CO 2 (95% / 5%) de gaz dans la solution. Surveiller le pH de la solution avec un pH-mètre (Oakton Instruments, Vernon Hills, IL) et d'ajuster le taux d'O 2 / CO 2 bouillonnant à maintenir le pH à 7,35 ± 0,05. Poursuivre la surveillance du pH et de température pendant l'expérience. </li><li> L'appareil de cartographie optique double composé de deux caméras MICAM Ultima-L CMOS (SciMedia, Costa Mesa, Californie) qui ont spatiale élevée (100x100 pixels, 230 ± 20 um par pixel) et temporelle (1000-3000 images / sec) de résolution. Correction d'un filtre passe-bande (590 ± 15 nm, Thorlabs, Newton, NJ), en face de la caméra d'imagerie calcique désigné, tandis que, d'un filtre passe-temps (&gt; 700 nm, Thorlabs, Newton, NJ), doit être placé dans devant la caméra d'imagerie de tension désigné. Les caméras sont disposées perpendiculairement les uns aux autres par un porteur, qui contient un miroir dichroïque (635 nm de coupure, Omega Optical, Brattleboro, VT). Immédiatement au-dessous du support de caméra à double il ya un objectif (Nikon Nikkor 55 mm 1:1.4 235 052), qui focalise la lumière d'émission provenant du coeur sur le miroir dichroïque. Le travail à distance est d'environ 3cm. La lumière d'excitation est produite par une lampe halogène (Newport Oriel Instruments, Stratford, CT; SciMedia, Costa Mesa, Californie) et est passé à travers un filtre de chaleur, d'obturation et filtre passe-bande (520 ± 45 nm). Un guide de lumière flexibles dirige la lumière filtrée passe-bande sur la préparation, et d'un obturateur est utilisée pour s'assurer que la préparation est exposé à la lumière que lors de l'acquisition d'image pour éviter photoblanchiment des colorants. </li><li> Préparer Ag / AgCl 2 électrodes de stimulation et de détection à l'avance et de les installer dans la chambre avant de placer au cœur. Assurez-vous que les amplificateurs et les filtres sont ajustés à des niveaux appropriés. </li></ol> 3. Récolte au cœur de la souris, cathétériser, et mettre en place une perfusion de Langendorff <ol start="10"><li> Anesthésier la souris avec la kétamine / xylazine (kétamine, 80mg/kg de poids corporel; xylazine, 10 mg / kg de poids corporel) et l'héparine (100 unités) par injection intrapéritonéale. Assurer le niveau approprié de l'anesthésie par le manque de réflexe de douleur. </li><li> Après une incision médiane du sternum, enlever rapidement le cœur et le laver dans oxygénée (95% d'O 2, 5% CO 2), à température constante (37 ± 1 ° C) une solution de Tyrode. </li><li> En utilisant un microscope à dissection, D'identifier rapidement l'aorte et de faire une coupe nette dans l'aorte ascendante dessous de l'artère sous-clavière droite. Une courte section de l'aorte est ensuite attaché à une coutume fait de calibre 21 canule avec un embout évasé. 4-0 suture de soie noire tressée (Surgical Corporation Spécialités, Reading, PA) est utilisé pour fixer le cœur sur la canule. Après canulation, le coeur est perfusé et rétrograde perfusées avec une solution de Tyrode. Le taux de perfusion rétrograde est ajusté dans la gamme de 2-5 mL / min pour maintenir la pression aortique entre 60 et 80 mmHg (capteur de pression, instruments de précision du Monde Inc (WPI), Sarasota, Etats-Unis; Pont Amplificateur TBM4M, WPI, Sarasota, Etats-Unis). </li><li> Après le cœur est une canule, du poumon, du thymus et des tissus adipeux sont ensuite disséqués et enlevé. </li><li> Le cœur isolé est épinglé (Outils Fine Science) à l'apex au fond de la chambre de perfusion (couché Sylgard) pour empêcher flux induits par le mouvement. Les appendices auriculaires droite et gauche sont également étirées et épinglé (Outils Fine Science, Inc, Foster City, CA) au fond de la chambre, qui donne la superficie maximale pour les mesures optiques de l'oreillette. Très important! Un tube de silicium petite est inséré dans le ventricule gauche par les veines pulmonaires et fixé par une suture en soie au tissu conjonctif voisin. Cela évite la congestion solution et l'acidification de l'perfusat piégés dans le ventricule gauche, qui est particulièrement important après la suppression des contractions ventriculaires avec un découplant excitation-contraction (voir partie 4 étape 19). </li><li> Une électrode sur mesure est placé sur la surface du cœur de mener les stimulations rythme, qui est généré par le maître-8 (AMP Instruments Ltd, Jérusalem, Israël) ou PowerLab 26T (AD Instruments, Sydney, Australie). </li><li> Un couvercle en verre petite est fixé sur la surface de la solution sur le cœur pour réduire artefacts de mouvement de la solution de vibration. </li><li> Focaliser la lumière d'excitation sur le cœur. En outre, ajuster la distance entre l'appareil photo et le double cœur pour que la résolution maximale sera obtenue. </li><li> Eteignez toutes les lumières dans la pièce et de commencer les enregistrements électriques utilisant PowerLab 26T. </li></ol> 4. Tension de charge et de colorants sensible au calcium et d'excitation-contraction découplant <ol start="19"><li> Warm-up 0,6 mL d'blebbistatin. Mélanger 0,5 mL de la blebbistatin avec le perfusat dans le réservoir de maintien. Diluer le reste 0,1 mL de blebbistatin dans 1 ml de solution de Tyrode et de l'injecter lentement (sur une période de 20 minutes) par un port de drogue situé près de la canule. Observez que blebbistatin réduit progressivement l'artefact de mouvement. </li><li> Diluer 30 uL de la tension de la solution de teinture d'actions sensibles RH237 dans la solution 1 ml de Tyrode et injecter lentement au cours de 5-7 minutes dans le port d'injection même blebbistatin. </li><li> 30 uL de calcium indicateur de Rhod-deux heures est de 1:1 mélangé avec Pluronic F127 (Invitrogen, Carlsbad, CA, solution à 20% dans le DMSO), puis dilué dans 1 mL de solution de Tyrode et lentement appliqué sur 5-10 min à travers le port même injection . </li><li> Attendre 5-10 minutes pour blebbistatin et colorants pour atteindre la membrane cellulaire et le cytosol. Continuer avec le protocole lorsque le mouvement est complètement supprimée. </li><li> Surveiller en permanence les enregistrements ECG au cours de la procédure entière pour assurer le fonctionnement normal électrique du cœur. </li><li> Commencer enregistrements signal fluorescent en utilisant les logiciels personnalisés SciMedia (SciMedia, Costa Mesa, Californie). </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3275/3275fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Dispositif expérimental pour la perfusion, les enregistrements électriques et optiques de cartographie. EM = émission; Lp = longpass <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3275/3275fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Préparation expérimentale et des exemples de signaux enregistrés pendant la stimulation ventriculaire. Gauche: Les signaux ECG sont recueillies auprès de Ag / AgCl 2 électrodes à disque (en haut) et un exemple de S1S1 protocole de stimulation est indiqué (en bas). Centre: préparation de Langendorff cœur de la souris. Droite: Représentant des potentiels d'action optiques et signaux calciques transitoires d'oreillettes (en haut) et les ventricules (bas) sont affichés. La flèche jaune (en haut) les points de la dispersion du signal fluorescent provenant des ventricules, ce qui est vu dans les enregistrements auriculaire. LV = ventricule gauche; VD = ventricule droit; LA = oreillette gauche; RA = oreillette droite <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3275/3275fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Représentant enregistrements optiques de V m et CAT des ventricules du cœur de souris de type sauvage. A. La préparation expérimentale avec un tableau de points uniformément répartis marquée par des points noirs dont les enregistrements optiques peut être vu dans (C). B. Exemple de traçage de V m et chat d'un emplacement central sur le tableau (voir encadré In (C)). C. V m (bleu) et Cat (rouge) à partir du tableau des emplacements régulièrement espacés. Les signaux ont été mis en cellule de 3x3. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3275/3275fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Carte d'activation et de conduction. A. Une carte d'activation par exemple d'un cœur de souris de type sauvage avec transversale (T) et longitudinale (L) directions indiquées par les flèches blanches. B. V signaux m (haut) et dV / dt (Bas), correspondant aux trois points de vue dans un (T1, T2, T3, L1, L2, L3). <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3275/3275fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 5"> Figure 5. Potentiels d'action et analyse de la durée de calcium transitoire. A. Durée du potentiel d'action à 80% de repolarisation (APD80) et la durée de calcium transitoire à 80% détente (80 CAD) les cartes sont affichées à partir d'un coeur dans des conditions de contrôle (à gauche) et après application 30 nM isoprotérénol (à droite). La couleur jaune / vert dans les ventricules (à droite) indique l'isoprotérénol raccourcie APD80 et 80 CAD. B. Exemple de tracés et de 80 CAD APD80 des ventricules souris de type sauvage (haut) et oreillettes (bas).

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<li>Salama, G., Hwang, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+optical+mapping+of+intracellular+free+calcium+and+action+potentials+from+Langendorff+perfused+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cytom%22%5BJournal%5D)">Simultaneous optical mapping of intracellular free calcium and action potentials from Langendorff perfused hearts.</a> Curr Protoc Cytom. 12, 17-17 (2009).</li>
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</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Dans cette expérience, nous avons modifié la méthode de perfusion de Langendorff en ajoutant un tube de silicium faible, ce qui est particulièrement crucial après la suppression des contractions ventriculaires avec un découplant excitation-contraction. Le tube de silicium est utilisé pour prévenir la congestion solution, l&#39;acidification de la solution de perfusion, et le développement de l&#39;ischémie dans le ventricule gauche. Le cœur de la souris est très sensible à l&#39;hypothermie; ainsi, les variations de température à travers le cœur d&#39;entraîner des variations artificielles dans la durée du potentiel d&#39;action. Par conséquent, un système de chauffage a été mis en œuvre dans la chambre de perfusion afin de maintenir une température constante de 37 ° C pendant la totalité de l&#39;expérience 8. Depuis un modèle de Langendorff ne conserve pas l&#39;innervation du cœur, on doit envisager d&#39;ajouter neurotransmetteurs pour le perfusat afin d&#39;enquêter physiologiques du tonus sympathique et parasympathique 9. Outre une perfusion rétrograde, plus de surfusion du cœur aide à maintenir adaptée paramètres environnementaux tels que le pH et la température. Dans cette méthode, le coeur perfusé de Langendorff a été placée horizontalement. Une configuration de Langendorff verticales perfusion peut également être utilisé 10, mais peut entraîner un peu différent mécanique cardiaque 11. En plus de caméras CMOS, des détecteurs de rechange sont également disponibles et peuvent être appliquées à la carte V m et chat simultanément 12. Application de caméras CMOS de haute résolution spatio-temporelle assure la précision des enregistrements, mais les signaux optiques ne sont pas la cartographie d&#39;une seule cellule. Au contraire, chaque signal de fluorescence provient de centaines ou de milliers de cellules, en fonction de grossissement optique. La fluorescence du ventricule beaucoup plus grand peut fausser les signaux auriculaire par diffusion optique, par conséquent, une interprétation prudente des signaux enregistrés optiquement est nécessaire. Une autre limitation de la préparation de la souris est la distorsion du signal et le bruit induit par la courbure de la surface en raison de la petite taille du cœur 13. Mesures de vitesse de conduction peut être modifié non seulement par la courbure de la souris, mais aussi le cœur de la polarité des électrodes et des électrodes virtuel. Pour atteindre la précision pour la vitesse de conduction, l&#39;anisotropie d&#39;activation, et des cartes de repolarisation, de rectification et de focalisation de la caméra à la surface du cœur est essentielle. Dans cette méthode, en temps réel les enregistrements ECG peuvent compléter la recherche optique de l&#39;électrophysiologie cardiaque. Tension colorant sensible (RH237) et l&#39;indicateur de calcium (Rhod-deux heures) sont utilisés dans le protocole en raison de leur réponse rapide, d&#39;excitation semblables, et les spectres d&#39;émission distincts 3,7. Il ya d&#39;autres combinaisons de colorants qui peuvent être utilisés pour mesurer V m et CAT autres que RH237 et Rhod-2 heures 3. Un roman sensible au voltage colorant, PGHI, avec un grand déplacement de Stoke (&gt; 200nm) a été trouvée pour permettre une meilleure m V et les signaux de chat car la plus grande séparation des longueurs d&#39;onde d&#39;émission entre PGHI et Rhod-2 heures 14. Les améliorations futures peuvent se concentrer sur l&#39;exploration de nouvelles sondes fluorescentes, le développement de détecteurs d&#39;imagerie, et l&#39;amélioration des logiciels de traitement d&#39;image. Une résolution et une nouvelle imagerie optique pour la cartographie 3D optique sont aussi importants les orientations futures de la cartographie optique 5.

<table border="1"><tbody><tr><td> Chimique </td><td> Société </td><td> Nombre de catalogue </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S271-1 </td></tr><tr><td> CaCl 2 (2H 2 O) </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> C79-500 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S217-500 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (6H 2 O) </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> M33-500 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 (H 2 O) </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S369-500 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S233-3 </td></tr><tr><td> D-glucose </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> D16-1 </td></tr><tr><td> Blebbistatin </td><td> Bioscience Tocris, Ellisville, MO </td><td> 1760 </td></tr><tr><td> RH237 </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> S1109 </td></tr><tr><td> Rhod-deux heures </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> R1244 </td></tr><tr><td> Pluronic F127 </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> P3000MP </td></tr><tr><td> Diméthylsulfoxyde (DMSO) </td><td> Sigma, St. Louis, MO </td><td> D2650 </td></tr></tbody></table>

cartographie optique de potentiels d&#39;action et les transitoires de calcium dans le cœur de la souris

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

Le cœur de la souris est un modèle populaire pour les études cardiovasculaires en raison de l&#39;existence d&#39;une technologie à faible coût pour le génie génétique dans cette espèce. Phénotypage cardiovasculaire physiologique du cœur de souris peut être facilement fait en utilisant l&#39;imagerie de fluorescence employant différentes sondes de potentiel transmembranaire (V m), les transitoires de calcium (CAT), et d&#39;autres paramètres. Couplage excitation-contraction est caractérisée par une dynamique d&#39;action du calcium intracellulaire potentiel et, par conséquent, il est extrêmement important de cartographier la fois V m et chat simultanément au même endroit sur ​​le cœur 1-4. Simultanée de cartographie optique de Langendorff perfusé coeurs de souris a le potentiel pour élucider les mécanismes qui sous-tendent l&#39;insuffisance cardiaque, les arythmies, les maladies métaboliques, et d&#39;autres maladies cardiaques. Visualisation de l&#39;activation, la vitesse de conduction, la durée du potentiel d&#39;action, et d&#39;autres paramètres à une myriade de sites ne peuvent pas être atteints de l&#39;enquête au niveau cellulaire, mais est bien résolu par cartographie optique 1,5,6. Dans cet article nous présentons la configuration d&#39;instrumentation et des conditions expérimentales pour la cartographie optique simultanée de V m et chat dans les cœurs de souris à haute résolution spatio-temporelle en utilisant l&#39;état de l&#39;art technologie d&#39;imagerie CMOS. Conformément enregistrements optiques obtenus avec cette méthode montrent que la cartographie simultanée optique de coeurs perfusés de Langendorff la souris est à la fois réalisable et fiable.

Ce document détaille la procédure de dissection, la configuration instrumentale, et des conditions expérimentales lors de la cartographie optique de potentiel transmembranaire (Vm) et de calcium intracellulaire transitoire (CAT) dans Langendorff isolés perfusés intacte cœur de la souris.

Cartographie optique de potentiels d&#39;action et les transitoires de calcium dans le cœur de la souris

Le cœur de souris est un modèle courant pour les études cardiovasculaires en raison de l'existence de technologies de génie génétique à faible coût pour cette espèce. ...

L'objectif général de cette procédure est de cartographier simultanément le potentiel transmembranaire et le transitoire calcique intracellulaire dans des cœurs de souris isolés et perfusés intacts avec du LOR. Cela est réalisé en excisant d'abord le cœur de souris intact, puis en canulant l'aorte et en commençant la perfusion au LOR. L'étape suivante consiste à immobiliser le cœur en chargeant un coupleur excitation-contraction, puis en épinglant le cœur dans la chambre de perfusion.Les dernières étapes consistent à charger les colorants optiques et à effectuer les préparatifs afin de réduire les artefacts de mouvement pendant l'expérience. Les images optiques sont obtenues en capturant la lumière émise par le cœur à l'aide de caméras my cam Ultima LC Moss. Hé, je m'appelle di.Je suis étudiant diplômé à l'Université de Washington. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'électrode microscopique, est que la cartographie optique permet une résolution spatiale plus élevée sur toute la surface du cœur. Salut, je suis Matt Sulkin.Je suis étudiante diplômée à l'Université de Washington. Cette méthode, si elle est correctement réalisée, peut aider à répondre à de nombreuses questions en électrophysiologie cardiaque, comme les bases de l'arythmogenèse. Commencez par configurer une pompe péristaltique pour faire circuler les solutions à 40 millilitres par minute.Ensuite, régler une deuxième pompe péristaltique à 80 millilitres par minute. Cette pompe renvoie le Perfuse huit au réservoir de maintien et d'oxygénation. Mettre en marche les pompes et rincer le système avec un litre d'éthanol à 70 % pendant 30 minutes en recirculation.Suivez ce lavage par deux litres d'eau déionisée sans recirculation. Une fois l'eau évacuée, faites circuler deux litres de solution de Tyro et faites-la passer à travers un filtre de cinq microns. Réchauffez le perfusat de huit à 37 degrés Celsius à l'aide d'une double enveloppe chauffante et d'un circulateur, et barbotez un gaz oxygéné dans la solution.Régler le débit de bulles de gaz pour maintenir le pH à 7,35 ± 0,05. Surveiller le pH et la température pendant l'expérience. L'appareil de cartographie optique double est constitué de deux caméras C moss haute vitesse capables de capturer une image de 100 sur 100 pixels à raison de 3000 images par seconde.Fixer un filtre passe-bande à la caméra d'imagerie calcique et un filtre passe-haut à la caméra d'imagerie de voltage sur un support double caméra. Placer un miroir dichroïque et une lentille de sorte que la lumière d'émission provenant du cœur soit focalisée sur le miroir par la lentille. Fixer également deux caméras au support et les positionner de manière à ce qu'elles soient perpendiculaires l'une par rapport à l'autre.Ensuite, configurez la lumière d'excitation. La lumière est produite par une lampe halogène et dirigée à travers un guide lumineux flexible. Faites passer la lumière à travers un filtre thermique, un obturateur pour limiter l'exposition, et un filtre passe-bande d'excitation.Enfin, préparez les électrodes d'argent et de chlorure d'argent en les installant dans la chambre. Après avoir vérifié et ajusté soigneusement les niveaux sur les amplificateurs et les filtres, le dispositif est prêt à recevoir un cœur. Utilisez un cocktail de kétamine et de xylazine contenant 100 unités d'héparine pour anesthésier une souris avant de poursuivre.S'assurer que l'animal ne présente aucun réflexe de douleur en pinçant un orteil. Après avoir pratiqué une incision médiane au niveau du sternum, retirer rapidement le cœur et les tissus environnants. Puis, à l'aide d'un microscope stéréo et rapidement, identifier l'aorte et effectuer une coupe nette de l'aorte ascendante en dessous de l'artère subclavière droite.Fixez maintenant un court segment d'aorte à une canule personnalisée de 21 g à l'aide de quatre fils de soie noirs tressés. Après la canulation, perfusez et superperfusez rétrogradement le cœur. À l'aide de la solution de Tyro, ajustez le débit pour maintenir la pression aortique entre 60 et 80 millimètres de mercure, mesurée par un transducteur de pression.Dissez maintenant et retirez le tissu pulmonaire, le thymus et le tissu adipeux environnants. Insérez ensuite un tube en silicone dans le ventricule gauche par les veines pulmonaires. Suturez le tube au tissu conjonctif voisin.Cette étape très importante empêche l'engorgement et l'acidification du Perfuse eight piégé dans le ventricule gauche, en particulier après la suppression des contractions ventriculaires. Pour éviter les mouvements cardiaques induits par le Perfuse eight, épingler le cœur au fond de la chambre de perfusion recouverte d'un revêtement protecteur au niveau de son apex. En outre, étirer et fixer les oreillettes droite et gauche afin d'augmenter la surface de contact des oreillettes dans la configuration verticale.Cela maximisera la surface d'enregistrement. Pour effectuer les stimulations de stimulation, fixez une électrode sur mesure à la surface du cœur. Pour réduire les artefacts de mouvement, fixez un petit verre de couverture au-dessus du cœur à la surface de la solution.Procédez en insérant le verre entre plusieurs broches. En guise de préparatifs finaux, focalisez la lumière d'excitation sur le cœur et positionnez les caméras pour obtenir une image optique, puis commencez le chargement du colorant tout en chargeant les colorants. Surveillez continuellement les enregistrements de l'ECG afin de garantir un fonctionnement électrique normal du cœur.Commencez par réchauffer les BLEs statine à température ambiante. Mélangez ensuite un demi-millilitre de BLEs statine dans les huit profus du réservoir de stockage, et diluez le dixième de millilitre restant de BLEs statine dans un millilitre de solution Tyros. Au cours des 20 minutes suivantes, injectez lentement les BLEs statine dans le Tyros par un port d'administration situé près de la canule.Le statine BLE réduira progressivement l'artéfact de mouvement. Ensuite, diluez 30 microlitres de colorant sensible à la tension dans une solution de tyro de un millilitre, puis injectez lentement ce mélange sur une durée de cinq à sept minutes dans le même port d'administration du médicament. Préparez ensuite à nouveau le même mélange.Cette fois, ajouter 30 microlitres supplémentaires d'indicateur calcique. Appliquer lentement ce mélange sur cinq à dix minutes par le même orifice. Après l'injection de l'indicateur calcique, attendre encore cinq à dix minutes afin que la statine BLE supprime complètement le mouvement et que les colorants pénètrent dans les cellules avant de poursuivre l'expérience.Cette préparation cardiaque a été réalisée. Selon le protocole, les signaux d'ECG ont été enregistrés pendant le balisage ventriculaire à partir d'une stimulation S1-S1. Des potentiels d'action et des signaux transitoires de calcium ont été enregistrés à partir des oreillettes situées à gauche et des ventricules situés à droite.La flèche indique l'endroit où la diffusion du signal provenant des ventricules s'est produite. En regroupant les enregistrements de la caméra par unités de trois pixels sur trois pixels, un réseau de transitoires calciques et de potentiels d'action peut être affiché à partir des données du tableau. Une figure illustrant la conduction du potentiel d'action peut être établie. Les données provenant de trois points consécutifs sur les axes transversal et longitudinal montrent la variation de l'amplitude伴随ée à la propagation du potentiel d'action à la surface d'un ventricule.De même, une figure montrant les durées du potentiel d'action et des transitoires calciques peut être établie. Elle illustre une condition contrôle à gauche et, à droite, une injection d'isoprénaline administrée au cœur, qui réduit nettement la durée des transitoires calciques et des potentiels d'action.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux à trois heures en suivant cette procédure. D'autres méthodes, comme le protocole de stimulation, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, par exemple sur la période réfractaire du nœud auriculo-ventriculaire.

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