Un protocole Chelex simple pour l'extraction d'ADN à partir de Anopheles Spp.

L’objectif global de cette procédure est d’extraire l’ADN du paludisme, du parasite et des moustiques à partir des sections de l’intestin moyen et des glandes salivaires des anomalies, des échantillons. Ceci est accompli en coupant d’abord le moustique exactement au niveau de l’articulation entre l’abdomen et le thorax, séparant ainsi l’intestin moyen de la section des glandes salivaires. Ensuite, chaque section est broyée séparément dans de l’eau déminéralisée.

Ensuite, la suspension tissulaire est mise en suspension et lavée et la pastille cellulaire est récupérée. Enfin, la pastille cellulaire est reconstituée et bouillie, et l’ADN est extrait. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent que l’ADN des moustiques et du paludisme de haute qualité peut être utilisé comme modèle pour identifier les anomalies, les espèces vecteurs et le génotype des infections palustres par PCR et digestion enzymatique de restriction spécifique des allèles.

Ainsi, le principal avantage de cette technique très simple par rapport aux techniques existantes comme l’extraction organique et les méthodes de tri est qu’elle utilise très peu de réactifs sûrs et facilement disponibles et beaucoup moins de temps de traitement. Pour commencer à disséquer le moustique, placez-le sur un petit morceau de paraforme et montez-le sur un microscope à dissection. Couvrez-le d’une goutte d’eau déminéralisée.

Pour adoucir la taille du tissu, la carcasse du moustique se situe précisément à l’articulation entre le thorax et l’abdomen. Entaillant ainsi la tête et le thorax de la section abdominale. Transférez chaque section de moustique disséquée dans un autoclave propre, un tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre pré-étiqueté avec le numéro d’identification du moustique et une section du corps, jetez le film para et, à l’aide d’une lingette Kim imbibée d’alcool à 70 %, essuyez soigneusement la platine du microscope avant de passer au moustique suivant pour extraire l’ADN du moustique, pipetez d’abord 20 microlitres d’eau déminéralisée dans le tube d’échantillon.

Et utilisez la pointe de la pipette pour broyer la section de moustique immergée en une suspension uniforme. Ajouter 100 microlitres d’autoclave, une solution de saponine XPBS à 1 % à l’homogénat de l’échantillon et agiter doucement pour mélanger. Incuber l’échantillon à température ambiante pendant 20 minutes.

Centrifugez ensuite à 20 000 G pendant deux minutes et jetez le surnageant. Remettre en suspension le granulé dans 100 microlitres un XPBS. Répétez ensuite l’essorage.

Ajouter 75 microlitres d’eau déminéralisée stérile et 25 microlitres de 20 % de poids par volume. Suspension de résine Cellex 100 dans de l’eau déminéralisée et un léger vortex pour remettre la pastille en suspension à l’aide d’une aiguille hypodermique stérile de calibre 23 flammée dans un bec Bunsen. Percez un trou dans le couvercle du tube d’échantillon.

Faites bouillir la suspension de l’échantillon dans un bloc chauffant pendant 10 minutes. Centrifuger à 20 000 G pendant une minute et transférer la solution d’ADN dans un flacon de stockage pré-étiqueté pour l’utiliser comme matrice dans les réactions PCR afin de vérifier la qualité de l’ADN extrait, amplifier une région du gène de la sous-unité quatre de la nicotinamide mitochondriale de l’arthropode mi adénine dinucléotide déshydrogénase qui devrait produire un fragment de 400 paires de bases. Ensuite, pour différencier les espèces d’Ananais Gambia, amplifiez une région flanquant les SNP dans la région intergénique spacer qui devrait produire des tailles de 390 paires de bases pour Ananais Gambia Sens Stricto, et de 315 paires de bases pour Ananais api.

Ansis puis au génotype p falciparum polymorphismes de résistance aux médicaments anti-folates. Effectuez une PCR imbriquée pour amplifier la région flanquant les codons d’acides aminés 16, 51, 59, 108 et 164. Chez les parasites, le gène de la dihydro-folate réductase effectue la digestion spécifique de l’allèle de l’amplicon pour détecter la résistance aux médicaments anti-folates.

Polymorphismes associés. Vérifiez les réactions lors d’un examen sur gel AROS à 2 %. Des exemples de résultats de tests PCR pour la qualité de l’extrait d’ADN de moustique, l’analis RABIS l’identification moléculaire et le génotypage de p falciparum montrent que la méthode simplifiée Kelex donne des résultats similaires à ceux du protocole standard de salage malgré moins d’étapes et moins d’un quart du temps avec une qualité d’ADN comparable dans les extraits respectifs, il n’est pas surprenant que les taux de positivité des échantillons par rapport aux anomalies, Les espèces sœurs de la Gambie, ainsi que les taux d’infection par les parasites n’étaient pas statistiquement différents sur la base du test du chi carré de McNear.

L’ajout de BSA aux mélanges réactionnels entraîne une augmentation générale des résultats positifs à la PCR en raison de l’élimination des inhibiteurs de PCR pour le kelex simplifié et le protocole de salage régulier. Cependant, cette augmentation n’était pas statistiquement significative, sauf pour la qualité de l’ADN sur les extraits de kelex. La digestion enzymatique de restriction spécifique de l’allèle de l’amplicon de p falciparum permet le génotypage des infections palustres de l’intestin moyen et des glandes salivaires pour les allèles de résistance aux médicaments Une fois maîtrisé.

Cette technique devrait pouvoir être réalisée en 37 minutes environ si elle est exécutée correctement.