Suivi des rampants neutrophiles intraluminale, migration trans et le chimiotactisme dans les tissus par microscopie intravitale Vidéo

L'objectif général de ce protocole est d'utiliser la microscopie en champ clair, la microscopie intravitale et la vidéographie en accéléré pour étudier les interactions dynamiques entre les cellules endothéliales et les neutrophiles durant le recrutement des neutrophiles en réponse à un chémotactique des neutrophiles in vivo. Dans cette vidéo, nous démontrons les procédures permettant d'utiliser la microscopie vidéo intravitale en champ clair afin de visualiser et de déterminer la migration intraluminale des neutrophiles, la migration transendothéliale et la chimiotaxie dans le tissu musculaire squelettique de la souris. Le recrutement des leucocytes est la caractéristique principale de l'inflammation.

Ce processus de recrutement débute lorsque les leucocytes présents dans la circulation sanguine commencent à rouler sur l'endothélium des veinules post-capillaires au site d'inflammation. En réponse aux chimiotactiques ou autres chémotactissants présents à la surface endothéliale, ces leucocytes en roulement s'arrêtent et adhèrent fermement à l'endothélium. Après l'adhésion, de nombreux leucocytes migrent à la surface luminale et semblent rechercher un site optimal de transmigration.

Après avoir rampé, les leucocytes traversent l'endothélium, un processus appelé migration transendothéliale. Ensuite, les neutrophiles migrent dans le tissu extravasculaire en direction de la source du chémotactique au site inflammatoire, un processus nommé chimiotaxie. Cette vidéo montre l'expérience permettant d'utiliser la vidéomicroscopie intravitale en champ clair, la photographie en prise de vue instantanée et ImageJ afin de visualiser, suivre et quantifier la migration intraluminale des neutrophiles, la migration transendothéliale ainsi que la migration en chimiotaxie dans le tissu musculaire de l'Oma, et leur réponse à la source d'un chémotactique pour les neutrophiles.

Bonjour, je suis Lis Liu du Département de pharmacologie de la Faculté de médecine de l'Université de la Saskatchewan. Aujourd'hui, nous allons vous montrer comment préparer le chimiopréparat de neutrophiles dans un gel en milieu nutritif, ainsi que comment préparer le muscle rétracteur de souris pour la microscopie intravitale.

Comment suivre le mouvement cellulaire à l'aide de MEGJ. Et enfin, comment analyser les paramètres de recrutement des neutrophiles, deux étudiants diplômés de notre laboratoire, ngel Naja, sh, et Chile, vous montreront les procédures expérimentales détaillées. Salut, je suis Naja Sh. Salut, je suis Chile.

Pour commencer cette expérience, préparez d'abord l'agent chimiotactique pour les neutrophiles dans un gel d'agarose. Pipetez 10 millilitres de PBS 2× dans un tube conique de 50 millilitres. Réchauffez le tube en le plaçant dans un bécher contenant de l'eau chaude. Pipetez ensuite 10 millilitres d'eau distillée.

Ajouter 0,4 gramme de poudre d'agros dans un autre tube conique de 50 millilitres. Chauffer le mélange jusqu'à ce qu'il commence à bouillir dans un four à micro-ondes afin d'obtenir une solution d'agros à 2 % dans du PBS. Ajouter au tube contenant la solution d'agros du PBS tiède, deux fois le volume.

Agiter la solution mixte et la maintenir au chaud dans le bécher d'eau chaude. Bien mélanger la solution de chimioprotéine avec trois microlitres d'encre de Chine dans le couvercle d'un tube Eppendorf de 1,5 millilitre. Éviter de former une bulle d'air pendant le mélange.

Coupez l'extrémité d'une pipette de 200 microlitres et pipetez 110 microlitres de solution agro à 42 degrés Celsius dans le couvercle, puis mélangez immédiatement soigneusement. À l'aide d'une autre pipette, conservez ce gel contenant l'agent chimiotactique au réfrigérateur jusqu'à son utilisation. Anesthésiez une souris mâle adulte par injection intrapéritonéale d'un mélange de xylazine et de kétabmine.

Raser la zone située au-dessus de la veine jugulaire externe droite et de la face antérieure du scrotum avec un rasoir électrique. Après l'anesthésie, il est important d'accorder une attention et des soins particuliers à la souris anesthésiée. Une lampe chauffante peut être utilisée afin d'éviter l'hypothermie de la souris.

La souris doit être exempte de réflexe douloureux. Réaliser une incision horizontale, repérer et cathétériser la veine jugulaire à l’aide d’un tube PE 10 rempli de solution saline contenant 100 unités par millilitre d’héparine. Connecter la préparation à un circulateur d’eau à 37 degrés Celsius afin de maintenir au chaud le muscle crémastère et la majeure partie du corps.

Fixer les pattes arrière de la souris avec des bandes ombilicales, en positionnant l'animal sur le dos sur la platine du muscle crémastère. Pratiquer une incision dans la peau du scrotum afin d'exposer le muscle crémastère gauche. Dissecter soigneusement le muscle de la fascia associée.

Superfusion du muscle crémastère avec une solution saline tamponnée au bicarbonate réchauffée à 37 degrés Celsius. Faire un nœud avec un fil 4.0 à l'extrémité distale du muscle crémastère afin de le maintenir plaqué sur le socle transparent en verre de la platine du muscle crémastère. Cautériser le muscle crémastère longitudinalement à l’aide d’un cautère muni d’un fil 4-0.

Tenez le muscle à plat et fixez-le le long des bords sur le socle. Séparez le testicule et l'épididyme du muscle sous-jacent et déplacez-les dans la cavité abdominale. Ajoutez une fine couche de graisse à vide sur les bords opposés d'une lame de verre carrée de 22 par 22 millimètres.

Ensuite, recouvrez le muscle exposé avec la lame de verre. Placez la platine maîtresse de muscle sur la platine du microscope. Examinez le muscle au microscope et repérez un venule post-capillaire approprié.

Sélectionnez le vaisseau qui présente un taux de cisaillement normal et un diamètre compris entre 25 et 40 micromètres. Ajustez la caméra vidéo de manière à visualiser le vaisseau en position verticale à l'extrémité droite ou gauche de l'écran du moniteur. Après 30 minutes, enregistrez les images vidéo du vaisseau post-capillaire sélectionné comme données de contrôle de base à l'aide d'un dispositif d'enregistrement vidéo tel qu'un enregistreur DVD.

Il s'agit des images vidéo de contrôle de base du veinule postcapillaire. Avant de placer le gel contenant l'agent chimiotactique sur la surface du muscle crémastère, arrêtez la perfusion en surface et retirez la lame de verre recouvrant le muscle. Prélevez à l'aide du couvercle du tube Eppendorf un gel contenant l'agent chimiotactique d'une taille d'un millimètre cube. À l'aide de l'extrémité coupée d'une pipette de 200 microlitres, déposez le gel contenant l'agent chimiotactique prélevé sur la surface du muscle crémastère dans une zone préalablement choisie, située à 350 micromètres du veinule postcapillaire observé.

Ajouter une lamelle pour maintenir le gel en place et superposer lentement le tissu musculaire à un débit très faible, inférieur ou égal à 10 microlitres par minute, afin de permettre l'établissement d'un gradient de chimioprotéine qui est lentement libérée et formée à partir du gel. Enregistrer l'image vidéo pendant 90 minutes après l'ajout du gel contenant la chimioprotéine. Pendant l'enregistrement, régler et maintenir le microscope focalisé sur les leucocytes adhérents, rampants, transmigrants et chimiotactiques à l'intérieur du vaisseau et dans le tissu musculaire.

Après l'expérience, importez le fichier vidéo sur un ordinateur. Pour l'analyse sur ordinateur, extrayez et convertissez la vidéo au format VI. Par exemple, utilisez un logiciel gratuit de type bit ripper pour convertir une vidéo DVD en un fichier A VI.

Utilisez un logiciel de montage vidéo, par exemple Windows Movie Maker, pour créer un film accéléré à partir de la vidéo en temps réel d'origine, puis convertissez et enregistrez le film accéléré au format DV AVI. Enregistrez les images du micromètre d'étalonnage avec les mêmes paramètres du microscope. Importez les images sur l'ordinateur.

Ouvrez les images avec ImageJ. Mesurez la taille de l'écran selon les axes X et Y et calculez le nombre de pixels par micromètre. Pour importer le film, ouvrez ImageJ. Cliquez de nouveau sur Fichier, puis sur Importer à l'aide du module complémentaire QuickTime pour les films, sélectionnez le film à analyser, puis cliquez sur OK dans l'interface de l'ouvertureur de film QT. Cliquez ensuite sur Modules complémentaires. Utilisez le suivi manuel pour suivre les cellules. Remplissez les informations pertinentes dans les champs situés en bas de l'écran avant de commencer le suivi. Les paramètres suivants doivent être déterminés avant le suivi.

L'intervalle en secondes correspond au temps total divisé par 30. Le calibrage xy est la mesure en micromètres par pixel obtenue lors de l'étalonnage de l'image du micromètre. Le calibrage z est défini à zéro. La taille du carré de recherche pour le centrage est égale à un. Il est nécessaire de sélectionner dans la vidéo enregistrée un point stable et net comme point de référence. Ce point de référence peut être n'importe quel point structurel net et petit qui reste inchangé et stable tout au long de l'expérience entière.

Cliquez sur « ajouter une trajectoire » pour suivre le point de référence de la première à la dernière image. Ensuite, cliquez et suivez les neutrophiles rampant et migratoire un par un. Cliquez sur « ajouter une trajectoire » pour suivre la cellule depuis son apparition dans le tissu jusqu'à sa disparition dans chaque image.

Ensuite, cliquez et suivez la procédure pour terminer et enregistrer les résultats dans Microsoft Excel. Ouvrez le fichier de résultats dans Microsoft Excel. Commencez à analyser les données.

Il est important de prendre en compte les mouvements du point de référence dans l'analyse. Lors du suivi des neutrophiles et de leur migration intraluminale, nous déterminons la distance parcourue par les neutrophiles dans la lumière et leur vitesse de migration. Lors de l'analyse de la migration transendothéliale des neutrophiles, nous mesurons la durée de la migration transcellulaire des neutrophiles ainsi que la durée du détachement.

Lorsqu'on étudie la chimiotaxie des neutrophiles dans le tissu musculaire, nous mesurons la distance et la vitesse de migration des neutrophiles ainsi que leur chimiotaxie dans le muscle, et nous déterminons également l'indice de chimiotaxie au cours de la migration des neutrophiles dans le tissu musculaire. Les définitions de ces paramètres, affichées à l'écran, sont précisées en détail dans notre protocole écrit. Dans cette expérience, nous détaillons les procédures permettant d'utiliser la microscopie intravitale en champ clair pour visualiser et analyser la migration intraluminale des neutrophiles, leur franchissement endothélial et leur déplacement en situation de chimiotaxie.

En réponse au chémotactique des neutrophiles in vivo, nous avons utilisé soit le MIP-2 (CXCL2), soit le peptide synthétique W-K-Y-M-V-M, préparé dans un gel d'agarose afin d'induire le recrutement des neutrophiles dans le tissu musculaire CMA de souris. Comme on peut le voir sur cette figure, le MIP-2 à 0,5 µM et le W-K-Y-M-V-M à 0,1 mM induisent une migration intraluminale des neutrophiles à des vitesses similaires. La migration transendothéliale des neutrophiles et leur détachement de la veine étaient comparables en durée.

Ces deux chémotactiques induisent également la migration des neutrophiles et la chimiotaxie dans le tissu musculaire à une vitesse presque identique et avec des indices de chimiotaxie des neutrophiles similaires. La microscopie intravitale est un outil précieux permettant l'observation directe du processus de recrutement des neutrophiles et la détermination quantitative des fonctions des cellules et des molécules à chaque étape du recrutement. En utilisant la photographie vidéo en accéléré et ImageJ, la migration intraluminale, la traversée endothéliale ainsi que la migration dans la chimiotaxie des leucocytes et du tissu peuvent être mesurées en champ clair, par microscopie intravitale, en présence d'inhibiteurs sélectifs, chez des souris transgéniques et avec des chémotactiques sélectifs.

Le système de dosage peut nous aider à révéler les fonctions de protéines spécifiques dans le recrutement des leucocytes.