Suivi des rampants neutrophiles intraluminale, migration trans et le chimiotactisme dans les tissus par microscopie intravitale Vidéo

L’objectif global de ce protocole est d’utiliser la photographie vidéo en fond clair, microscopique intravital et time-lapse pour étudier les interactions dynamiques des cellules endothéliales neutrophiles lors du recrutement des neutrophiles en réponse à un attractif de chimiothérapie de neutrophiles in vivo. Dans cette vidéo, nous montrons les procédures d’utilisation de la vidéo microscopique intravitale en fond clair pour visualiser et déterminer le rampement intraluminal des neutrophiles, la migration de l’endothélium T et la chimiotaxie dans le tissu musculaire de la souris. Le recrutement leucocytaire est la marque de l’inflammation.

Ce processus de recrutement commence lorsque les leucocytes dans la circulation sanguine commencent à rouler sur l’endothélium des vees post-capillaires au site de l’inflammation. En réponse aux chimiokines ou à d’autres attractifs de chimiothérapie sur la surface ulaire, ces leucocytes roulants arrêtent l’endothélium et y adhèrent fermement. Après l’adhésion, de nombreux leucocytes rampent sur la surface luminale et semblent rechercher un site de transmigration optimal.

Après que les leucocytes rampants se déplacent à travers l’endothélium, un processus appelé migration endothéliale T. Par la suite, les neutrophiles migrent dans le tissu extravasculaire vers la source de l’attractif de chimiothérapie dans le site inflammatoire, un processus appelé MOI de chimiotaxie. Cette vidéo montre l’expérience d’utilisation de la vidéo intra-vitale en fond clair, de la photographie microscopique en accéléré et de l’image J pour visualiser, suivre et déterminer le rampement intraluminal des neutrophiles, la migration de l’endothélium T et la migration en chimiotaxie dans le tissu musculaire d’Oma, et la réponse à la source d’un attractif de chimiothérapie de neutrophiles.

Bonjour, je m’appelle Lis Liu et je travaille au Département de pharmacologie du Collège de médecine de l’Université de la Saskatchewan. Aujourd’hui, nous allons vous montrer comment fabriquer la chimiothérapie des neutrophiles dans un gel agricole. Comment préparer le muscle de la souris pour la microscopie intra-vitale.

Comment suivre le mouvement des cellules à l’aide de MEGJ. Et enfin, comment analyser les paramètres de recrutement des neutrophiles, deux étudiants diplômés de notre laboratoire, ngel Naja, sh, et Chile vous montreront les procédures expérimentales détaillées. Bonjour, je m’appelle Naja Sh.Bonjour, je m’appelle le Chili.

Pour commencer cette expérience, préparez un attractif de chimiothérapie pour neutrophiles dans une première pipette agro gel, 10 millilitres de deux fois PBS et un tube conique de 50 millilitres. Réchauffez le tube en le mettant dans un bécher contenant de l’eau chaude. Pipette de 10 millilitres d’eau distillée.

Ajoutez 0,4 gramme de poudre d’aros et un autre tube conique de 50 millilitres. Chauffer le mélange jusqu’à ébullition dans un four à micro-ondes pour faire 2 %agros dans du PBS. Ajoutez le PBS chaud deux fois dans le tube de solution agricole.

Faites tourner la solution mélangée et gardez-la au chaud dans le bécher d’eau chaude. Mélangez bien la solution d’attractif de chimiothérapie avec trois microlitres d’encre de Chine dans le couvercle d’un tube de 1,5 millilitre. Évitez de générer une bulle d’air pendant le mélange.

Coupez l’extrémité d’une pointe de pipette de 200 microlitres et d’une micro-pipette. 110 microlitres de solution agricole à 42 degrés Celsius dans le couvercle et mélangez bien immédiatement. À l’aide d’une autre pointe de pipette, conservez cet attractif de chimiothérapie contenant du gel au réfrigérateur jusqu’à ce qu’il soit utilisé. Anesthésie une souris mâle adulte par une injection IP d’un mélange de xylazine et de kétamine.

Rasez la zone au-dessus de la veine jugulaire externe droite et de la face antérieure du scrotum. Avec un rasoir électrique après anesthésie, il est important d’accorder une attention et des soins particuliers à la souris anesthésiée. Une lampe chauffante peut être utilisée pour empêcher la souris d’hypothermie.

La souris doit être exempte de douleur Reflex. Faites une incision horizontale, trouvez et cathétérisez la veine jugulaire à l’aide d’un tube PE 10 rempli de 100 unités par millilitre de sérum salin d’héparine. Connectez la planche à un circulateur d’eau à 37 degrés Celsius pour garder le muscle crémaster et le plus au chaud pour le plus grand nombre de corps.

Fixez les pattes arrière de la souris avec des bandes ombilicales avec la face la plus couchée vers le haut sur la planche musculaire cremaster. Faites une incision dans la peau du scrotum pour exposer le muscle crémaster gauche. Disséquez soigneusement le muscle du fascia associé.

Super fusionné le muscle crémaster avec une solution saline tamponnée au bicarbonate réchauffé à 37 degrés Celsius. Attachez une suture 4.0 à l’extrémité distale du muscle crémaster pour le maintenir sur le piédestal en verre transparent de la planche musculaire crémaster. Cautériser le muscle crémaster longitudinalement avec une cautère avec une suture à quatre oh.

Tenez le muscle à plat et fixez-le le long des bords du piédestal. Séparez le testicule et l’épididyme du muscle sous-jacent et déplacez-les dans la cavité abdominale. Ajoutez une fine couche de graisse sous vide sur les bords opposés d’une lamelle en verre de 22 x 22 millimètres.

Couvrez ensuite le muscle exposé avec le couvercle en verre. Placez la planche musculaire principale sur la platine du microscope. Examinez le muscle au microscope et trouvez un lieu post-capillaire approprié.

Sélectionnez la vennue qui a un taux de cisaillement normal et un diamètre de 25 à 40 micromètres. Ajustez la caméra vidéo pour permettre de visualiser le lieu en position verticale à l’extrémité droite ou gauche de l’écran de télévision. Après 30 minutes, enregistrez les images vidéo du lieu post-capillaire sélectionné comme données de contrôle de base à l’aide d’un appareil d’enregistrement vidéo tel qu’un enregistreur de DVD.

Il s’agit des images vidéo de contrôle de référence du lieu post-capillaire. Avant de placer l’attractif de chimiothérapie contenant du gel sur la surface du muscle crémaster, arrêtez la superfusion et retirez le couvercle en verre glissant sur le poinçon musculaire un attractif de chimiothérapie d’un millimètre cube contenant du gel du couvercle du tube einor. À l’aide d’une extrémité coupée d’une pointe de pipette de 200 microlitres, placez l’attractif de chimiothérapie perforé contenant du gel à la surface du muscle crémaster dans une zone présélectionnée, à 350 micromètres du lieu post-capillaire observé.

Ajoutez une lamelle pour maintenir le gel en place et fusionnez le tissu musculaire à un rythme très lent, inférieur ou égal à 10 microlitres par minute pour permettre l’établissement d’un gradient d’attractif de chimiothérapie qui est lentement libéré et formé à partir du gel. Enregistrez l’image vidéo pendant 90 minutes après l’ajout de l’attractif de chimiothérapie contenant du gel. Pendant l’enregistrement, ajustez et maintenez la mise au point du microscope sur les leucocytes adhérents, rampants, transmi-migrateurs et sollicitant la chimiothérapie à l’intérieur du lieu et dans le tissu musculaire.

Après l’expérience, importez le fichier vidéo sur un ordinateur. Pour l’analyse sur un ordinateur, extrayez et convertissez la vidéo au format VI. Par exemple, utilisez un logiciel informatique gratuit bit ripper pour convertir une vidéo DVD en un fichier A VI.

Utilisez un logiciel de montage vidéo, par exemple, Windows Movie Maker pour créer un film time-lapse à partir de la vidéo en temps réel d’origine, convertir et enregistrer le film time-lapse au format DVA VI. Enregistrez les images du micromètre d’étalonnage sous le même réglage du microscope. Importez des images sur l’ordinateur.

Ouvrez les images avec l’image J.Mesurez la taille de l’écran sur les axes x et Y et calculez le nombre de pixels par micromètre. Pour importer l’image ouverte du film J.Encore une fois, cliquez sur l’importation de fichiers à l’aide du plugin de films QuickTime, sélectionnez le film à analyser et cliquez sur OK à l’interface de l’ouvre-film QT, cliquez sur plugins. Suivi manuel pour suivre les cellules : remplissez les informations pertinentes dans les champs en bas de l’écran : avant de commencer le suivi, les paramètres suivants doivent être déterminés avant le temps de suivi.

L’intervalle en secondes est le laps de temps complet divisé par 30 l’étalonnage xy est la mesure micromètre par pixel à partir de l’étalonnage de l’image du micromètre L’étalonnage Z est réglé à zéro recherche la taille du carré pour le centrage est égale à un. Il est nécessaire de sélectionner dans la vidéo enregistrée un point stable et clair comme point de référence. Ce point de référence peut être n’importe quel point structurel clair et petit qui reste inchangé et stable tout au long de l’expérience.

Cliquez sur Ajouter une piste pour suivre le point de référence de la première à la dernière image. Ensuite, cliquez et suivez les neutrophiles un par un, l’exploration des pistes et la migration. Cliquez sur Ajouter une piste pour suivre la cellule depuis son apparition dans le tissu jusqu’à sa disparition dans chaque image.

Cliquez ensuite sur le suivi pour terminer et enregistrer les résultats dans Microsoft Excel. Ouvrez le fichier de résultats dans Microsoft Excel. Commencez à analyser les données.

Il est important de prendre en compte les mouvements du point de référence dans l’analyse. Lors du suivi de l’exploration des neutrophiles et des luminaux, nous déterminons la distance de rampement des neutrophiles et des luminaux et la vitesse d’exploration. Lors de l’analyse de la migration endothéliale trans des neutrophiles, nous mesurons le temps de migration trans des neutrophiles et le temps de détachement.

Lors de la détermination de la chimiotaxie des neutrophiles dans le tissu musculaire principal, nous mesurons la distance et la vitesse de la migration des neutrophiles et de la chimiotaxie dans le muscle, et nous déterminons également l’indice de chimiotaxie pendant la chimiotaxie des neutrophiles dans le tissu musculaire. Les définitions de ces paramètres affichées à l’écran sont données en détail dans notre protocole écrit. Dans cette expérience, nous démontrons les procédures d’utilisation du microscopique intravital en champ clair pour visualiser et déterminer la migration endothéliale T rampante intraluminale des neutrophiles et la migration en chimiotaxie.

En réponse à un chimioattracteur de neutrophiles in vivo, nous avons utilisé soit MIP deux CX CL deux, soit un peptide synthétique W-K-Y-M-V-M préparé un agro gel pour induire le recrutement de neutrophiles dans le tissu musculaire CMA de souris. Comme nous pouvons le voir sur cette figure MIP deux à 0,5 MICROMOLAIRE et W-K-Y-M-V-M à 0,1, les millimolaires ont provoqué un rampement intraluminal des neutrophiles à des vitesses similaires. La migration endothéliale trans des neutrophiles et le détachement de la veine étaient comparables dans le temps.

Ces deux attractifs de chimiothérapie ont également induit la migration des neutrophiles et la chimiotaxie dans le tissu musculaire à peu près à la même vitesse et avec des indices de chimiotaxie des neutrophiles similaires. Le microscope intra-vital est un outil précieux pour l’observation directe du processus de recrutement des neutrophiles et pour la détermination quantitative des fonctions des cellules et des molécules à chaque étape du recrutement. En utilisant la photographie vidéo en accéléré et l’image J, la migration endothéliale T rampante intraluminale et la migration en chimiotaxie des leucocytes et des tissus peuvent être mesurées en fond clair, intra-vital, microscopique avec les inhibiteurs sélectifs, transgéniques, souris et attractifs de chimiothérapie sélective.

Le système de dosage peut nous aider à révéler les fonctions de protéines spécifiques dans le recrutement des leucocytes.