Name: Profilage Single Cell transcriptionnelle des cardiomyocytes de souris adultes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Découvrez le profilage transcriptomique single cell de cardiomyocytes de souris adultes viables. Cette méthode combine isolation enzymatique, qPCR et analyse microarray pour étudier la variabilité de l'expression génique au niveau cellulaire.

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Les auteurs tiennent à remercier l&#39;assistance technique de C. Zambataro pendant le tournage de ce protocole. Nous remercions chaleureusement le soutien de la Fondation Glenn pour la recherche médicale (SM), la fondation Hillblom, et le National Institutes of Health pour un prix de Nathan Centre Choc (P30AG025708) et PO1AG025901. JMF a été soutenue par T32AG000266 décerné à l&#39;Institut Buck pour la recherche sur le vieillissement.

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</ol>

<p class="jove_content"&gt; Accès libre et la production de cette de cet article est sponsorisé Sigma-Aldrich.</p

Cette méthode a la possibilité de générer des cardiomyocytes pour un certain nombre de fonctions ainsi que les études d&#39;expression génique. L&#39;examen des cellules individuelles est une région en plein essor dans l&#39;analyse de l&#39;expression génique. L&#39;avantage de l&#39;examen de niveau transcriptionnel au niveau de la cellule unique est qu&#39;il permet l&#39;examen d&#39;une population cellulaire pure, qui n&#39;est pas possible à partir des préparations de tissus ensemble. De plus, l&#39;analyse seule cellule permet à l&#39;examen de la variation stochastique des taux d&#39;ARNm dans des cellules individuelles pour définir les populations de cellules qui étaient auparavant considérés comme homogènes 8,9. En plus d&#39;identifier les gènes qui sont potentiellement stochastique dans leur expression des gènes 10,11,12, la méthode permet aussi l&#39;identification des populations de cellules rares définies par leurs profils d&#39;expression génique. Bien que cette méthode fournit un certain nombre de passionnantes utilisations potentielles dans l&#39;analyse de l&#39;expression des gènes, il ya des some mises en garde et considérations dans l&#39;utilisation des cellules individuelles. La principale limitation à l&#39;analyse unicellulaire, est la collecte de suffisamment de cellules dans l&#39;expérience pour atteindre une signification statistique en ce qui concerne la métrique d&#39;intérêt, de la variance par exemple. Dans le cas où le nombre de cellules isolées à partir du tissu d&#39;intérêt n&#39;est pas une limitation, on peut examiner des centaines de cellules par groupe, en utilisant des approches telles que séquençage de nouvelle génération, ou des tableaux nanofluidique. Toutefois, dans certains cas, il peut y avoir des difficultés à obtenir suffisamment de cellules du tissu d&#39;intérêt. Cela peut être en partie causée par le temps des procédures idiosyncratiques intensif pour la collection du type de cellules ciblées. Cependant, une planification minutieuse et la préparation avant de procéder à la collecte seule cellule peut encore permettre une analyse rigoureuse de cellule unique avec une erreur technique limitée. Lorsque l&#39;on examine les résultats, il doit être considéré que, même si cette procédure pour isoler les cellules a été utilisé dans de nombreux Studies (y compris la microscopie, l&#39;électrophysiologie, etc), l&#39;isolement se pourrait potentiellement effet l&#39;expression des gènes. Comme avec n&#39;importe quelle méthode qui manipule des échantillons biologiques, les résultats de vos résultats devraient être soigneusement validé pour garantir l&#39;expression cellule unique est représentatif du tissu lui-même et un biais non pas technique. Des méthodes telles que l&#39;hybridation in situ peut s&#39;avérer utile de vérifier ces résultats dans le tissu intact. Enfin, il est essentiel de s&#39;assurer que les données générées sont soigneusement vérifiées pour le contrôle qualité. Les données présentées dans la figure 8 montre que les dosages qPCR peut être très robustes dans leur spécificité, comme test n ° 13 (A13) ou ont un niveau élevé de variabilité qui peut conduire à la variance techniques telles que le dosage n ° 34 (A34).

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 71378 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 60128 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;acide pyruvique </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4562 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 54457 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1020 </td><td></td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 monobasique </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9791 </td><td></td></tr><tr><td> Dextrose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G6721 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 72068 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O3777 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 21115 </td><td></td></tr><tr><td> Protéase, type XIV </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P5147 </td><td></td></tr><tr><td> Collaoxygénase, Type I </td><td> Worthington </td><td> C9891 </td><td></td></tr><tr><td> Tampon 1x suspension l&#39;ADN (10 mM Tris, pH 8,0, EDTA 0,1 mM) </td><td> TEKnova, </td><td> PN T0221 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B8667 </td><td></td></tr><tr><td> Pentobarbital sodique </td><td> Henry Schein Vet. * Alimentation </td><td> Contacter avec le fournisseur pour commander </td><td> * Doit être procuré par un vétérinaire ou un laboratoire animalier professionnel </td></tr><tr><td> IT ExoSAP </td><td> Affymetrix / USB </td><td> 78201 </td><td></td></tr><tr><td> CellsDirect 2x Mix Rxn </td><td> Invitrogen </td><td> 11737-030 </td><td></td></tr><tr><td> SuperScript III Platinum Taq Mix RT </td><td> Invitrogen </td><td> 10928-042 </td><td></td></tr><tr><td> Mélange d&#39;amorces de RT-STA </td><td> IDT </td><td> Personnalisé </td><td></td></tr><tr><td> Nucléase l&#39;eau libre </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> W4502 </td><td></td></tr><tr><td> WTA2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> WTA2-50rxn </td><td></td></tr><tr><td> Kit QIAquick PCR Purification </td><td> Qiagen </td><td> 28104 </td><td></td></tr><tr><td> QIAcube </td><td> Qiagen </td><td> 9001292 </td><td></td></tr><tr><td> Spectrophotomètre NanoDrop </td><td>NanoDrop </td><td> 2000c </td><td></td></tr><tr><td> BioAnalyzer DNA kit 7500 </td><td> Agilent </td><td> 7500 Kit </td><td></td></tr><tr><td> Un kit de marquage couleur </td><td> Roche-NimbleGen </td><td> 5223555001 </td><td></td></tr><tr><td> Mus musculus 12x135k array </td><td> Roche-NimbleGen </td><td> 5543797001 </td><td></td></tr><tr><td> GenePix 4200A Scanner </td><td> Molecular Devices </td><td> 4200A </td><td></td></tr><tr><td> Transplex Complete kit complet d&#39;amplification du transcriptome (WTA2 Kit) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> WTA2-50RXN </td><td></td></tr></tbody></table>

profilage single cell transcriptionnelle des cardiomyocytes de souris adultes

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Alors que de nombreuses études ont examiné les changements d&#39;expression génique à partir des homogénats de tissu cardiaque, ce qui empêche l&#39;étude de la variation stochastique inhérente entre les cellules dans un tissu. L&#39;isolement des populations pures cardiomyocyte à travers une perfusion de collagénase des cœurs de souris facilite la génération de puces à cellule unique pour l&#39;expression génique toute transcriptome, ou qPCR d&#39;objectifs spécifiques en utilisant des tableaux nanofluidique. Nous décrivons ici une procédure pour examiner les profils de simples cellules d&#39;expression génétique des cardiomyocytes isolés du coeur. Ce paradigme permet l&#39;évaluation des mesures d&#39;intérêt qui ne sont pas dépendants de la moyenne (par exemple pour la variance entre les cellules dans un tissu) qui n&#39;est pas possible lors de l&#39;utilisation traditionnelle des workflows tissu entier pour l&#39;évaluation de l&#39;expression génique (figure 1). Nous avons réalisé l&#39;amplification robuste du transcriptome des cellules microgrammes seule cession d&#39;ADNc double brin qui facilite l&#39;utilisation de puces sur les iertaines cellules. Dans la procédure que nous décrivons l&#39;utilisation de tableaux de NimbleGen, qui ont été sélectionnés pour leur facilité d&#39;utilisation et de possibilité de personnaliser leur conception. Alternativement, une transcriptase inverse - amplification de la cible spécifiques (RT-STA) de réaction, permet de qPCR de centaines de cibles en nanofluidique PCR. En utilisant une de ces approches, il est possible d&#39;examiner la variabilité d&#39;expression entre les cellules, ainsi que l&#39;examen des profils d&#39;expression de types de cellules rares à partir d&#39;un tissu. Globalement, l&#39;approche cellule unique permet l&#39;expression des gènes à la génération de données qui peuvent permettre de définir des profils d&#39;expression idiosyncrasique qui sont généralement en moyenne à l&#39;examen d&#39;expression de millions de cellules à partir d&#39;homogénats typiques générés à partir des tissus ensemble.

Simple cellule de profilage de l&#39;expression génique permet l&#39;analyse détaillée d&#39;expression des cellules individuelles. Nous décrivons des méthodes pour l&#39;isolement des cardiomyocytes, et la préparation des lysats résultant soit pour tout ou biopuces transcriptome qPCR d&#39;objectifs spécifiques.

Profilage Single Cell transcriptionnelle des cardiomyocytes de souris adultes

Bien que de nombreuses études aient examiné les changements d'expression génique à partir d'homogénats de tissu cardiaque, cette approche empêche l'étude de la variation stochastique inhérente...

Les objectifs de cette présentation sont d'illustrer d'abord l'isolement de cardiomyocytes viables d'adulte chez la souris, puis de démontrer deux méthodes d'analyse de l'expression génique au niveau de la cellule unique. Après avoir disséqué le cœur d'une souris, celui-ci est perfusé avec une solution de digestion à la collagénase afin d'obtenir des cellules isolées. Pour la PCR quantitative de cellules uniques, les cellules purifiées sont directement soumises à des tests de PCRq.Les cardiomyocytes isolés peuvent également être utilisés pour une analyse par puces à ADN. L'analyse par puces à ADN de cellules uniques implique l'extraction d'ARNm, l'amplification de tout le transcriptome via une bibliothèque plex, suivie d'une amplification limitée, puis le marquage et l'hybridation sur une puce à microarray. La dernière étape des deux procédures consiste à garantir des données de haute qualité.Ces procédures démontrent qu'une analyse robuste de l'expression génique est possible à partir de cardiomyocytes adultes isolés individuellement. L'avantage de cette méthode par rapport aux méthodes existantes, telles que le profilage de l'expression génique d'un homogénat total de tissu, est que l'expression génique au niveau de la cellule unique permet d'obtenir des informations sur l'expression au sein d'une cellule unique, ainsi que sur la variabilité d'expression entre les cellules. Commencez par un système d'isolement préparé, comprenant les solutions et tampons requis, sédater définitivement une souris par injection intrapéritonéale de 0,25 millilitre de solution de pentobarbital de sodium, et vérifiez que la souris est inconsciente et sans réponse aux stimuli douloureux.Ne pas utiliser de dioxyde de carbone ni de dislocation cervicale pour euthanasier la souris avant que celle-ci ne s'arrête. Couper soigneusement la respiration. Ouvrir la cavité thoracique le long de la marge thoracique en passant par le diaphragme.Ensuite, sectionner vers le haut en direction supérieure et écarter la cage thoracique antérieure. Aspirer délicatement le cœur dans une pipette en plastique préalablement coupée et exciser le cœur de la cavité thoracique. Déposer le cœur dans le milieu de digestion glacé.Le tampon A et rincer le sang après 15 à 45 secondes, effectuer un deuxième rinçage bref dans le tampon A, puis transférer le cœur dans la boîte de Pétri contenant le tampon A et le placer sous un microscope de dissection. Isoler soigneusement l'aorte et ses branches. Tailler l'aorte juste en dessous de la dernière branche.Insérez la pointe de la canule dans l'aorte au-dessus des artères coronaires et fixez-la en place à l'aide d'un fil 4 oh ou 6 oh. Commencez la perfusion en utilisant le tampon de digestion A. L'effluent passera du rouge au clair au fur et à mesure que le sang sera éliminé du cœur. La durée entre l'euthanasie de l'animal et le raccordement du cœur au dispositif de perfusion est critique.Idéalement, vous devez maintenir cette durée en dessous de cinq à dix minutes. De plus, la température du fluide circulant dans le dispositif de perfusion doit être maintenue à 37 degrés Celsius. S’il est trop chaud ou trop froid, cela détruira le tissu.Une fois que le sang est éliminé du cœur, passez à l'utilisation du tampon de digestion. Perfusez le cœur avec le tampon b pendant deux à trois minutes, jusqu'à ce que le cœur commence à perdre sa forme et prenne un aspect arrondi. Le myocarde doit devenir plus clair au fur et à mesure de la perfusion ; découpez maintenant les ventricules et hachez-les en morceaux plus petits.Placer le tissu ventriculaire dans un tube conique de 50 millilitres contenant 15 millilitres de tampon de collecte tiède. Mélanger délicatement le tissu dans le tampon à l’aide d’une pipette en plastique afin d’obtenir un mélange de cardiomyocytes en cellules uniques. Après une minute, transférer le mélange dans un nouveau tube et laisser décanter une fois le culot formé.Jetez le surnageant et resuspendez. Resuspendez les cellules en culot dans cinq millilitres de tampon de lavage de neutralisation. Les cellules sont désormais prêtes à être sélectionnées pour une analyse en cellule unique.Diluez les cellules dans une petite boîte de Pétri afin de pouvoir les sélectionner individuellement. Au microscope, sélectionnez des cellules individuelles saines à l’aide d’une micropipette étirée fixée à un sas d’air. Lors de la sélection des cellules, veillez à éviter toute contamination et à réduire au minimum le volume capturé à moins de deux microlitres.Placer les cellules individuelles au fond de tubes PCR séparés et les congeler immédiatement sur de la glace sèche. Ensuite, conserver les cellules à moins 80 degrés Celsius. Commencer par resuspendre toutes les paires d'amorces pour les gènes d'intérêt à 100 micromolaire et un tampon de suspension XDNA, combiner et diluer les paires d'amorces à 20 micromolaires. Enfin, diluer toutes les paires d'amorces en une solution unique ayant une concentration finale de 200 nanomolaire.Les solutions d'amorces étant prêtes, préparez immédiatement le mélange maître, sortez les cellules congelées du congélateur et centrifugez-les à force maximale pendant 30 secondes. Ajoutez ensuite neuf microlitres du mélange maître dans chaque tube et poursuivez avec la PCR. Retirez les tubes du thermocycleur et ajoutez quatre microlitres d'exonucléase I à chaque réaction.Ensuite, faire réagir chaque échantillon pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius, suivies de 15 minutes à 80 degrés Celsius. Terminer en maintenant les échantillons à quatre degrés Celsius. Ensuite, diluer les échantillons au 1/5 avec du tampon de suspension d'ADN.Les échantillons sont désormais prêts pour l'analyse par PCR quantitative. Nous utilisons maintenant ce matériau et le système fluid IMS BIOMARK avec des puces d'expression génique à 48 points ou à 96 points. Il est possible d'utiliser des formats QPCR plus traditionnels tels que des plaques à 96 puits et à 384 puits.Le format en puits limite toutefois le nombre de tests pouvant être réalisés à partir d'une seule cellule. Ce processus utilise le kit WTA two de Sigma, capable d'amplifier l'ADNc double brin à partir de bothons et de cellules uniques. Le kit commence par rompre la membrane des cellules uniques, puis amplifie les ARNm en deux cycles.Après avoir effectué l'étape de préparation de la bibliothèque, ajouter un cinquième de l'échantillon de bibliothèque à 70 microlitres du mélange maître d'amplification WTA deux et amplifier les échantillons pendant 25 cycles en utilisant les paramètres du kit. Ensuite, purifier les échantillons à l'aide du kit de purification PCR rapide Kayak et les traiter sur le Kayak Cube de Cain. Une fois terminé, concentrer les échantillons purifiés à cinq microlitres à l'aide d'un vide accéléré et utiliser le kit WTA deux pour soumettre les échantillons à 17 cycles supplémentaires d'amplification selon les mêmes paramètres que l'amplification précédente.Purifiez les échantillons comme précédemment et vérifiez leur qualité à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDrop et du kit DNA 7,500 d'Agilent Bioanalyzer. Étiquetez maintenant deux microgrammes d'ADN double brin provenant de chaque échantillon cellulaire amplifié en utilisant le kit de marquage en une couleur de NimbleGen, puis hybridisez cinq microgrammes d'échantillon marqué au CY3 sur une matrice d'expression génique NimbleGen. Après l'hybridation, lavez et séchez la lame afin de permettre l'acquisition d'images. Utilisez un scanner GenePix 4,200 de Molecular Devices, avec les paramètres calibrés à 100 POW et 300 à 350 PMT.Analysez les puces à gènes, puis générez des fichiers appariés pour chaque matrice à l'aide du logiciel NimbleGen NimbleScan, et poursuivez avec l'analyse des données. Un cœur correctement perfusé a fourni un pourcentage élevé de cellules cardiaques saines ayant conservé leur morphologie rectangulaire typique. Si la perfusion n'avait pas bien fonctionné, un grand nombre de cellules seraient mortes.Les cellules ont été amplifiées par la méthode WTA deux et la qualité des produits finaux a été testée. L'échantillon a montré une amplification forte à la fois sur la lecture du spectrophotomètre nano drop spec, ainsi que sur le tracé électrophorétique obtenu à partir de la puce du bioanalyseur. En résumé, de nombreux gènes étaient fortement exprimés dans les cardiomyocytes.Cependant, tous les dosages ne sont pas également fiables, comme le montre cette carte thermique des températures de fusion maximales issues d'un sous-ensemble de données de qPCR avec fluide nanofluide. Chaque ligne de cette carte représente un échantillon de cellule unique analysé dans 43 dosages de qPCR distincts. Certains dosages sont assez variables et probablement moins fiables que ceux qui présentaient une spécificité PCR plus élevée.Lors de l'exécution de cette procédure, il est important de se rappeler qu'il faut obtenir dès le départ des cellules de qualité. Cela garantira la qualité de votre profilage d'expression génique en aval. Une fois maîtrisée, la procédure d'isolement de cellules uniques peut être réalisée en moins de deux heures et demie, et le profilage d'expression génique à partir de ces cellules peut être achevé en moins de deux jours.

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