Name: GENPLAT: une plate-forme automatisée pour Discovery enzymatique de la biomasse et loptimisation Cocktail (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Découvrez l'optimisation automatisée des cocktails enzymatiques pour la dégradation de la biomasse lignocellulosique avec GENPLAT. Cette plateforme améliore le rendement en sucres fermentescibles pour la production de biocarburants.

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Ce travail a été financé en partie par le Département américain de l&#39;Energie des Grands Lacs Bioenergy Research Center (DOE Office of Science du BER DE-FC02-07ER64494) et accorder DE-FG02-91ER200021 du Département américain de l&#39;énergie, Bureau des sciences fondamentales de l&#39;énergie, Division des sciences chimiques, sciences de la terre et les biosciences. Nous remercions John Scott-Craig et Melissa Borrusch pour leurs contributions matérielles et conceptuelles.

1. La production d'enzymes <ol><li> Produire des protéines dans Pichia pastoris par clonage des gènes correspondants dans des vecteurs ou des pPICZ pPICZα et sa transformation en P. pastoris. Cultiver des cellules dans 300 ml de lots dérouté flacons de 500 ml de méthanol à l'induction de tous les h 24 (Banerjee et al., 2010a). </li><li> Concentré et dessaler les filtrats de culture par filtration à flux tangentiel. </li><li> Stocker les enzymes dans de petites aliquotes de 20% de glycérol à -80 ° C. La gamme de concentration est 1-10 mg / ml. </li></ol> 2. Conception de l'expérience <ol><li> Entrez le nombre d'enzymes pour être testés, leurs supérieurs et inférieurs des proportions (par exemple, une proportion plus faible de 5% pour les enzymes de base), et le type de conception expérimentale (par exemple, quadratique ou cubique) dans la conception-Expertsoftware. </li><li> Calculez le montant en ug de chaque enzyme à ajouter pour faire un chargement total de 15 mg / g de glucane, puis calculer le montant de chaque enzyme en ul à ajouter àchaque réaction. </li><li> Générer feuilles de calcul Excel en spécifiant matériel de laboratoire de source, puits de source, du matériel de laboratoire de destination, des puits de destination, et les volumes de transfert pour distribution d'eau et d'enzymes selon la conception expérimentale et l'importer dans le logiciel Biomek FXP utilisant la fonction de transfert-de-fichier. </li></ol> 3. L'hydrolyse enzymatique <ol><li> Suspendre la boue de la biomasse dans 50 mM citrate de sodium, pH 4,8, contenant 5 ug / ml de tetracycline et 5 ug / ml de cycloheximide, dans le réservoir à aubes. </li><li> Robotisé de pipette 200 pl de la suspension dans chaque puits d'une plaque 96 puits de réaction en utilisant des puits profonds Span-8 embouts de pipettes 1000-ul avec la dernière 0.5 cm coupés. Mélangez le coulis une fois à 100 l / sec puis aspirer le même volume du réservoir de paddle et répartir dans les assiettes. </li><li> Distribuer les enzymes dans la même assiette en utilisant le programme est entré dans le FX Beckman. </li><li> Sceau des plaques avec capmats perçable. </li><li> Inversez et frappezles plaques à plusieurs reprises pour surmonter la tension de surface. Placez les plaques à 50 ° C pendant 48 h dans l'hybridation incubateur tournant à 10 rpm. </li></ol> 4. Détermination de Glc et Xyl <ol><li> Centrifuger les plaques de réaction pendant 3 min à 1250 xg dans une centrifugeuse à godets oscillants. </li><li> Transférer 100 ul du surnageant dans réguliers plaques à 96 puits en utilisant la gousse AP96 du FX Biomek. </li><li> Incuber les plaques à 90-95 ° C pendant 10 min afin d'inactiver les enzymes, puis centrifuger à 1250 xg pendant 30 sec. </li><li> Pour des mesures de Glc, transférer 12 ul des surnageants en emploi régulier plaques à 96 puits. Ajouter 192 ul de la glucose oxydase / peroxydase (goPod) réactif. Incuber les plaques à 50 ° C pendant 20 min et lire les absorbances à 510 nm dans un lecteur de microplaques. Blank est mélange réactionnel sans enzyme. </li><li> Pour des mesures Xyl, transfert 4 pl dans 384 puits. Ajouter les réactifs de dosage et de lire les plaques à 340 nm. Viergeest le mélange réactionnel sans enzyme. </li></ol> 5. Analyse des données <ol><li> Convertir les valeurs d'absorbance à leur Glc% et des rendements sur la base des Xyl connue Glc et le contenu Xyl de la biomasse d'origine. Importer ces pourcentages que les réponses dans le logiciel Design-Expert. Vérifiez la paramenters statistiques pour être sûr que les critères d'un modèle robuste sont remplies. </li><li> Confirmer la meilleure prédiction du modèle expérimental. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs avec GENPLAT: (1) Création de mélanges optimisés des individuels protéines pures. Les résultats indiquent que les enzymes sont importants, et dans quelles proportions, et aussi quelles enzymes ne sont pas importants. Certaines protéines qui sont abondantes dans le T. reesei sécrétome (Nagendran et al., 2009), comme Cip1 et CIP2, semblent jouer aucun rôle dans la libération Glc à partir de maïs prétraités par l'expansion de fibres d'ammoniaque (AFEX) ou alcalines hyd Stover peroxyde d'Rogen (AHP) (Banerjee et al., 2010b). D'autre part, certaines protéines sont importantes inattendue. Par exemple, l'endo-xylanases de familles Hydrolase glycosyle 10 et 11 sont toutes deux importantes pour Glc libération; une xylanase peut pas se substituer à l'autre (Banerjee et al, 2010b, c).. Cel61A, une protéine mineure dans le T. reesei sécrétome, est très important pour Glc mais pas Xyl communiqué. Certaines enzymes sont importantes pour la libération des deux Glc et Xyl, alors que d'autres ne sont nécessaires que pour l'une ou l'autre (Banerjee et al., 2010c). Un mélange synthétique contenant 16 éléments, chacun à une concentration de 0,94 mg / ml (c'est à dire, un mélange non optimisé), a publié 38% de la disposition du Glc AFEX-prétraités DDG. Dans des conditions identiques hydrolyse, un mélange optimisé, dans laquelle les concentrations des 16 composantes variait de 0% à 32%, a publié 52% de la CGL (Fig. 2). Cette expérience illustre l'utilité de construire des mélanges définis. _content "&gt; (2) Création de cocktails optimisé pour un prétraitement différent / combinaisons substrat. actuelle des préparations commerciales sont cellulase" one-size-fits-all ". En réalité, le meilleur cocktail dépend à la fois le substrat et le prétraitement. Un seul produit tels que Accellerase 1000 donne des rendements différents de différents substrats prétraités de la même manière, et à partir du même substrat exposée à différents prétraitements (Fig. 1). Nous avons utilisé pour optimiser les mélanges GENPLAT des enzymes pures de prétraitement des matières premières et de multiples mutiple (Banerjee et al., 2010c). figure 2 montre comment les proportions optimales d'enzymes de 16 enzymes pures diffère du maïs AFEX-prétraités canne, le maïs PLA-prétraités Stover et AFEX-prétraités DDG. Seulement 11 enzymes sont présentés dans la figure 2. optimale parce que la proportions des cinq autres (Cel61B, AbfB, Cip1, point d'appel 2, et Cel12A) ont été trouvés à 0% (Banerjee et al., 2010c). (3) découverte de nouvelle enzyme T. reesei et A. Niger cultivés sur différents substrats. Un extrait particulièrement stimulé le rendement Glc lorsqu'il est ajouté à notre noyau. La protéine responsable a été purifié et montré être un roman de glycosyl hydrolase pas présent dans toute préparation enzymatique commerciale (Banerjee et Walton, résultats non publiés). (4) Découverte de la meilleure des enzymes. Ayant montré avec GENPLAT laquelle les enzymes sont les plus importants de la dégradation d'unparticulier la biomasse, nous avons une meilleure compréhension de laquelle les enzymes devrait être le centre d'amélioration. Mieux exemples des enzymes essentielles pourraient être trouvés par la recherche dans la nature ou fabriqués par l'ingénierie des protéines. (Une enzyme pourrait être «mieux» que son homologue de T. reesei de plusieurs façons, selon la propriété désirée, par exemple, l'activité spécifique plus élevée, une plus grande synergie, une diminution de la sensibilité protéolytique, ou une meilleure stabilité thermique). GENPLAT fournit une plate-forme significative pour doser les enzymes potentiellement mieux, car il utilise un cocktail réaliste complexes (important car aucune enzyme biomasse fonctionne en vase clos) et un substrat réaliste (important car les résultats avec de la cellulose pure ou d'autres substrats artificiels peuvent ne pas être pertinents pour lignocellulosiques naturelles matériaux). (5) l'optimisation de l'enzyme de commerce. Quantité suffisamment importante d'enzymes pures n'existent pas encore dans le monde réel. Jusqu'à ce qu'ils font, l'éthanol Proproducteurs doivent compter sur des produits commerciaux tels que Accellerase 1000 et MultifectXylanase. Toutefois, les mélanges d'enzymes commerciaux fonctionnent généralement mieux que tout autre individu, et GENPLAT peut être utilisé pour la conception optimisée de multiples cocktails enzymes commerciales. La figure 3 montre l'utilisation de GENPLAT pour optimiser un mélange de quatre préparations enzymatiques commerciales. Les proportions optimales pour la libération de Glc d'AFEX-prétraités DDG ont été trouvés à 47% Accellerase1000, 27% Multifect pectinase, 22% Novozyme 188, et 4% Multifect xylanase (Banerjee et al., 2010c). La figure 3B montre les différences dans le rendement du Glc AFEX-DDG avec quatre préparations enzymatiques; le mélange optimisé commerciale donne un rendement plus élevé que Glc Accellerase1000 seul, SpezymeCP seul, ou un mélange de 16 composants synthétiques. Cette expérience indique également que le mélange de 16 composant synthétique qui manque un ou plusieurs enzymes nécessaires à la libération optimale Glc, qui sont présents dans un ou plusieurs des enzymes commerciales. GENPLAT peut nous êtreED afin d'identifier de tels composants. <img src="/files/ftp_upload/3314/3314fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Pas de préparation enzymatique commerciale unique est optimale pour tous les supports et tous les prétraitements. Cinq substrats et trois prétraitements ont été comparés dans des conditions similaires de broyage (0,5 mm la taille des particules), le chargement d'enzymes (15 mg / g de glucane), et les conditions de l'hydrolyse (48 h, 50 ° C). A. La digestion des différents substrats prétraités AFEX- avec Accellerase 1000. Digestion B. canne de maïs prétraités par trois méthodes différentes avec Accellerase 1000 (voir Banerjee et al., 2010c). <img src="/files/ftp_upload/3314/3314fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Proportions optimales de 11 enzymes pour la libération de Glc d'AFEX-canne de maïs prétraités (AFEX-CS), alcalines d'hydrogène peroxyde de maïs prétraités Stover (PLA-CS), ou AFEX-prétraitées séchées distillentvailleurs céréales (AFEX-DDG). Les données proviennent de Banerjee et al. (2010c). Numéros en haut des barres sont les rendements Glc que un pour cent du total Glc dans l'échantillon de la biomasse. <img src="/files/ftp_upload/3314/3314fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. A. L'utilisation de GENPLAT pour produire un mélange optimisé de quatre préparations enzymatiques commerciales pour la libération de Glc d'AFEX-prétraités DDG. Multifect xylanase fait la plus petite contribution (4%) et a donc été omis dans ce diagramme ternaire. B. rendements Glc d'AFEX-DDG avec des traitements enzymatiques différentes, dans des conditions identiques hydrolyse (15 enzymes glucane mg / g, 48 h, 50 ° C) . "Quatre-composante commerciale" a les proportions déterminées par l'expérience le montre la figure. 3A.

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<li>Harris, P. V., Welner, D., McFarland, K. C., Re, E., Poulsen, J. C. N., Brown, K., Salbo, R., Ding, H., Vlasenko, E., Merino, S., Xu, F., Cherry, J., Larsen, S. Y., LoLeggio, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+lignocellulosic+biomass+hydrolysis+by+proteins+of+glycoside+hydrolase+family+61%3A+Structure+and+function+of+a+large%2C+enigmatic+family%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Stimulation of lignocellulosic biomass hydrolysis by proteins of glycoside hydrolase family 61: Structure and function of a large, enigmatic family.</a> Biochemistry. 49, 3305-3316 (2010).</li>
<li>Kim, E., Irwin, D. C., Walker, L. P., Wilson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factorial+optimization+of+a+six-cellulase+mixture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Factorial optimization of a six-cellulase mixture.</a> Biotechnol. Bioeng. 58, 494-501 (1998).</li>
<li>King, B. C., Donnelly, M. K., Bergstrom, G. C., Walker, L. P., Gibson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+microplate+assay+system+for+quantitative+evaluation+of+plant+cell+wall-degrading+enzyme+activity+of+fungal+culture+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">An optimized microplate assay system for quantitative evaluation of plant cell wall-degrading enzyme activity of fungal culture extracts.</a> Biotechnol. Bioeng. 102, 1033-1044 (2009).</li>
<li>Nagendran, S., Hallen-Adams, H. E., Paper, J. M., Aslam, N., Walton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+genomic+potential+for+secreted+plant+cell-wall-degrading+enzymes+in+the+ectomycorrhizal+fungus+Amanita+bisporigera%2C+based+on+the+secretome+of+Trichoderma+reesei%5BTitle%5D)+AND+%22Fung.+Genet.+Biol%22%5BJournal%5D)">Reduced genomic potential for secreted plant cell-wall-degrading enzymes in the ectomycorrhizal fungus Amanita bisporigera, based on the secretome of Trichoderma reesei.</a> Fung. Genet. Biol. 46, 427-435 (2009).</li>
<li>Rosgaard, L., Pedersen, S., Langston, J., Akerhielm, D., Cherry, J. R., Meyer, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+minimal+Trichoderma+reesei+cellulase+mixtures+on+differently+pretreated+barley+straw+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Prog%22%5BJournal%5D)">Evaluation of minimal Trichoderma reesei cellulase mixtures on differently pretreated barley straw substrates.</a> Biotechnol. Prog. 23, 1270-1276 (2007).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Il est largement reconnu que la réduction du coût des enzymes est important pour le développement d&#39;une industrie d&#39;éthanol lignocellulosique économique. Actuellement disponibles cocktails enzymatiques commerciales sont des mélanges complexes et mal définies de nombreuses protéines (Nagendran et al., 2009), et ils sont adaptés pour une utilisation essentiellement sur l&#39;acide prétraité les tiges de maïs. Afin d&#39;accélérer le développement de cocktails enzymatiques mieux, plusieurs laboratoires ont développé des plates-formes à haut débit pour la découverte et la caractérisation d&#39;enzymes. Les efforts dans ce domaine ont intégré un ou plusieurs des propriétés suivantes ont également trouvé dans GENPLAT: robotique de distribution d&#39;enzymes et de boues de la biomasse, la conception statistique de l&#39;expérience et / ou la détermination automatisée de Glc et Xyl (Berlin et al, 2007; Decker et al. al, 2009;. Kim et al, 1998;. King et al, 2009).. GENPLAT étend ces efforts antérieurs, la plupart de manière significative dans la complexité des mélanges d&#39;enzymes qui peuvent être analysés à partir au plus 6 composantsles études antérieures à plus de 16 dans notre dernier travail (Banerjee et al., 2010c). D&#39;autres caractéristiques clés de GENPLAT sont l&#39;utilisation d&#39;une chambre de mélange billes (réservoir aube) qui peuvent garder boues tiges suspendues pendant la distribution; mélange en douceur lors de la digestion d&#39;ici la fin de plus en bout de rotation, et automatisé dosage colorimétrique du Glu et Xyl.

Equipements et logiciels utilisés: <ol><li> Design-Expert logiciel, la version 8.0 (Stat-Ease, Inc, Minneapolis, MN) ( <a href="http://www.statease.com">http://www.statease.com</a> ) </li><li> Biomek FXP automatisation des laboratoires poste de travail (Beckman-Coulter, Fullerton, CA) </li><li> Biomek FXP logiciel, la version 3.3 (Beckman-Coulter, Fullerton, CA) </li><li> Réservoir de Paddle (modèle VP-756C 1P100, V &amp; P Scientific Inc, San Diego) </li><li> Plaques, 96 de profondeur (1,5 ml) et (ABgene, Fisher Scientific, Epson, Royaume-Uni) </li><li> Capmats perçable (Etats-Unis scientifique, Ocala, Floride) </li><li> L&#39;hybridation rotatif incubateur (Modèle 5420, VWR) </li><li> Swinging-seau de centrifugeuse (Modèle 5810R, Eppendorf, Hambourg, Allemagne) </li><li> Assiettes, Costar de 96 puits (ABgene, Fisher Scientific, Epson, Royaume-Uni) </li><li> Assiettes, de 384 puits (BD Falcon, BD Biosciences, San Jose, CA) </li></ol> Réactifs utilisés: <ol><li> Pichia pastoris et les vecteurs: la souche X33, et pPICZ et pPICZα (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> T. reesei et les vecteurs: la souche QM9414 (Département américain de l&#39;Agriculture Centre national de recherche sur l&#39;utilisation agricole, Peoria, IL), et pCB1004-EV (Banerjee et al, 2010b). </li><li> Accellerase 1000 (1600844643 numéro de lot) (Genencor, Inc, Rochester, NY) </li><li> 50 mM de tampon citrate de sodium, pH 4,8 </li><li> Tétracycline stock: 10 mg / ml </li><li> Stock de cycloheximide: 10 mg / ml </li><li> GoPod test kit, catalogue K-gluc (Megazyme, Bray, Irlande) </li><li> Xylose test kit, le catalogue de K-xylose (Megazyme, Bray, Irlande) </li></ol>

genplat: une plate-forme automatisée pour discovery enzymatique de la biomasse et l&#39;optimisation cocktail

GENPLAT: an Automated Platform for Biomass Enzyme Discovery and Cocktail Optimization

Le coût élevé des enzymes nécessaires à la déconstruction de la biomasse constitue un obstacle majeur à la conversion économique de matières premières lignocellulosiques en carburants liquides de transport, tels que l'éthanol. Nous avons mis au point une plateforme intégrée à haut débit, appelée GENPLAT, destinée à la découverte et au développement de nouvelles enzymes et de mélanges d'enzymes pour libérer des sucres à partir de diverses combinaisons de prétraitements et de biomasses. GENPLAT comprend quatre éléments : des enzymes pures individuelles, la conception statistique d'expériences, le pipetage robotisé de boues de biomasse et d'enzymes, et la détermination automatisée par colorimétrie du Glc et du Xyl libérés. Les enzymes individuelles sont produites par expression dans Pichia pastoris ou Trichoderma reesei, ou par purification chromatographique à partir de mélanges commerciaux ou d'extraits de micro-organismes nouveaux. Des modèles de mélanges en treillis simplex (factoriels fractionnaires) sont conçus à l'aide d'un logiciel statistique commercial de plan d'expériences. Les mélanges d'enzymes de grande complexité sont préparés par pipetage robotisé dans un format 96 puits. La quantification du Glc et du Xyl libérés est automatisée à l'aide de dosages colorimétriques couplés à des enzymes. Des mélanges d'enzymes optimisés, contenant jusqu'à 16 composants, ont été testés sur diverses combinaisons de matières premières et de prétraitements.
GENPLAT est adaptable à des mélanges d'enzymes pures, des mélanges de produits commerciaux (par exemple Accellerase 1000 et Novozyme 188), des extraits de micro-organismes nouveaux ou à des combinaisons de ceux-ci. Pour préparer et tester des mélanges de &tilde;10 enzymes purs nécessitent moins de 100 &mu;g de chaque protéine et moins de 100 réactions au total, lorsqu'elles sont utilisées à une charge totale finale de 15 mg de protéine par g de glucane. Nous utilisons des enzymes provenant de plusieurs sources. Les enzymes peuvent être purifiées à partir de sources naturelles telles que des cultures fongiques (par exemple, Aspergillus niger, Cochliobolus carbonum, et Galerina marginata), ou elles peuvent être produites par l'expression des gènes codants (obtenus à partir du nombre croissant de séquences génomiques microbiennes) dans des hôtes tels que E. coli, Pichia pastoris, ou un champignon filamenteux tel que T. reeseiLes protéines peuvent également être purifiées à partir de cocktails enzymatiques commerciaux (par exemple, Multifect Xylanase, Novozyme 188). Un nombre croissant d'enzymes pures, notamment des glycosylhydrolases, des estérases actives sur la paroi cellulaire, des protéases et des lyases, sont disponibles auprès de fournisseurs commerciaux, par exemple Megazyme, Inc. (www.megazyme.com), NZYTech (www.nzytech.com) et PROZOMIX (www.prozomix.com).
Le logiciel Design-Expert (Stat-Ease, Inc.) est utilisé pour créer des plans simples latice et analyser les réponses (dans ce cas, la libération de Glc et de Xyl). Les mélanges contiennent de 4 à 20 composants, dont les proportions peuvent varier entre 0 et 100 %. Les points d'essai incluent généralement les sommets extrêmes, accompagnés d'un nombre suffisant de points intermédiaires afin de générer un modèle valide. En termes de plan d'expériences, la plupart de nos études relèvent d'expériences « de mélange », ce qui signifie que la somme de tous les composants correspond à une charge totale fixe de protéines (exprimée en mg/g de glucane). Le nombre de mélanges dans le simplexe latice dépend à la fois du nombre de composants du mélange et du degré du polynôme (quadratique ou cubique). Par exemple, une expérience à 6 composants nécessite 63 réactions distinctes avec un modèle cubique spécial augmenté, capable de détecter des interactions à trois facteurs, tandis que seulement 23 réactions individuelles sont nécessaires avec un modèle quadratique augmenté. Pour les mélanges comportant plus de huit composants, un plan d'expérience quadratique est plus pratique, et selon notre expérience, de tels modèles sont généralement valides sur le plan statistique.
Toutes les charges enzymatiques sont exprimées en pourcentage de la charge totale finale (qui, dans nos expériences, est généralement de 15 mg de protéine par g de glucane). Pour les enzymes « centrales », la limite inférieure est fixée à 5 %. Cette limite découle de notre expérience, au cours de laquelle les rendements en Glc et/ou en Xyl étaient très faibles lorsque l'une des enzymes centrales était absente (0 %). Des modèles peu fiables résultent d'un trop grand nombre d'échantillons présentant des rendements très faibles en Glc ou en Xyl. La fixation d'une limite inférieure détermine par conséquent une limite supérieure. Ainsi, dans une expérience à six composants, si la limite inférieure pour chaque composant individuel est fixée à 5 %, la limite supérieure pour chaque composant individuel sera de 75 %. Les limites inférieures pour toutes les autres enzymes considérées comme « accessoires » sont fixées à 0 %. Les désignations « centrale » et « accessoire » sont quelque peu arbitraires et varient selon le substrat, mais dans nos études, les enzymes centrales impliquées dans le relargage du Glc à partir de paille de maïs comprennent les enzymes suivantes provenant de T. reesei : CBH1 (également connue sous le nom de Cel7A), CBH2 (Cel6A), EG1 (Cel7B), BG (β-glucosidase), EX3 (endo-β1,4-xylanase, GH10) et BX (β-xylosidase).
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GENPLAT (Plateforme Enzyme GLBRC) est une plate-forme automatisée pour la découverte et l&#39;optimisation des cocktails d&#39;enzymes de dégradation de la biomasse. Il peut être adapté à plusieurs matières premières et des mélanges d&#39;enzymes contenant de multiples composants.

GENPLAT: une plate-forme automatisée pour Discovery enzymatique de la biomasse et l&#39;optimisation Cocktail

Le coût élevé des enzymes pour la déconstruction de la biomasse constitue un obstacle majeur à la conversion économique des matières premières lignocellulosiques en carburants liquides...

Dans cette procédure, les mélanges d'enzymes destinés à convertir la biomasse lignocellulosique en sucres libres sont optimisés à l'aide d'un système automatisé appelé plateforme enzymatique A-G-L-B-R-C ou gen plat. Tout d'abord, un modèle de mélange est conçu dans lequel de quatre à dix-huit enzymes distinctes sont combinées selon jusqu'à 96 rapports différents à l'aide d'un logiciel d'expérimentation planifiée. La biomasse et les enzymes sont ensuite pipetées dans des plaques profondes 96 puits à l'aide d'un système robotique de manipulation des liquides.Les plaques sont scellées et incubées pendant 48 heures à 50 degrés Celsius. Après l'incubation, les puits sont prélevés à l'aide d'un système automatisé de manipulation des liquides, et le glucose et le xylose libres sont mesurés à l'aide d'un dosage colorimétrique couplé à une enzyme. Un logiciel de planification d'expériences est ensuite utilisé pour déterminer quelles combinaisons d'enzymes produisent le glucose libre et les silos maximaux.L'objectif général de cette procédure est de tester simultanément l'efficacité de divers cocktails enzymatiques pour convertir les matières de biomasse lignocellulosique en sucres fermentescibles destinés à la production d'éthanol, dans le but global de réduire les coûts de production des biocarburants. Bien que nous utilisions principalement cette méthode pour analyser des cocktails enzymatiques sur des résidus de maïs prétraités de manière alcaline, elle peut être adaptée à n'importe quel prétraitement et à toute matière première, comme le peuplier ou la panic raide traités à l'acide, ou encore les grains distillés séchés. Cette technique permet de découvrir de nouvelles enzymes importantes pour la déconstruction de la biomasse, ainsi que d'identifier de meilleures variantes des enzymes déjà connues.Bien que les enzymes utilisées pour les gem plats puissent provenir de diverses sources, les enzymes utilisées dans cette démonstration sont produites par expression de PPIC ou de PPIC alpha dans des cellules Pia Pastis gro, en lots de 300 millilitres, dans des flacons de 500 millilitres munis d'anneaux anti-remous, pendant trois jours. Ensuite, pendant les quatre jours suivants, effectuez une induction au méthanol toutes les 24 heures après le dernier jour d'induction au méthanol. Versez les échantillons dans un système de filtration à flux tangentiel équipé d'une membrane de coupure à 10 kilodaltons afin de concentrer et de désaler la culture.Les filtrats subissent ensuite un échange de tampon avec cinq volumes d'acétate de sodium 25 millimolaire, pH 5, puis on concentre l'échantillon afin de ramener le volume à une valeur comprise entre 10 et 25 millilitres. Dosage des protéines par la méthode BCA en utilisant la BSA comme standard ; la concentration finale des solutions mères d'enzyme doit être comprise entre 0,5 et 10 milligrammes par millilitre. Conserver les enzymes en petites aliquotes dans 20 % de glycérol à −80 degrés Celsius pour créer des plans en treillis simplex.Commencez par ouvrir le programme Design Expert sur un ordinateur. Saisissez le nombre d'enzymes à tester ainsi que les proportions supérieure et inférieure. Par exemple, une proportion inférieure de 5 % pour les enzymes centrales, puis indiquez si le plan expérimental est quadratique ou cubique.Un modèle quadratique est nécessaire pour les mélanges comportant plus de huit composants dans Excel. Calculez la quantité en microgrammes de chaque enzyme à ajouter afin de charger un total de 15 milligrammes par gramme de glucane par échantillon. Ensuite, calculez la quantité de chaque enzyme en microlitres à ajouter à chaque réaction en fonction des concentrations en protéines des stocks.Générez des feuilles de calcul Excel supplémentaires, en précisant les puits sources dans LabWare, le LabWare de destination, les puits de destination et les volumes de transfert pour la distribution d'eau et d'enzymes selon le plan expérimental. Importez enfin la feuille de calcul dans le logiciel Biome FX à l'aide de la fonction de transfert à partir d'un fichier afin de produire une bouillie de biomasse de paille de maïs prétraitée. Versez la biomasse sèche dans un broyeur Wiley et broyez-la jusqu'à ce qu'elle passe à travers un tamis de 0,5 millimètre.Collecter la biomasse broyée dans un bécher. La teneur en glucane est mesurée selon des méthodes standard décrites dans la vidéo JoVE d'analyse compositionnelle complète des parois cellulaires végétales, partie un : lignine. Une fois la teneur en glucane déterminée, mélanger la biomasse avec un tampon citrate de sodium de manière à obtenir une concentration finale en glucane de 0,5 %. Allumer le réservoir à palette et y verser la suspension de biomasse.Maintenant que les enzymes sont sur de la glace, la quantité de chaque enzyme nécessaire dépend de la taille de l'expérience pour distribuer la biomasse. Les suspensions produisent des embouts larges en utilisant une lame de rasoir pour couper les derniers 0,5 centimètre de l'embout. Huit embouts de pipette de 100 microlitres.Les embouts coupés du SPAN eight peuvent être réutilisés. Une fois coupés, placez les embouts dans une boîte à embouts afin qu’ils puissent être automatiquement prélevés par le SPAN eight. Cet instrument est équipé d’un module SPAN eight doté d’une fonction d’embout jetable capable de distribuer des solutions individuelles dans des puits individuels, ainsi que d’un module fixe AP 96, qui peut transférer 96 solutions identiques simultanément dans une plaque de 96 puits. Ensuite, organisez la surface de travail du système de manipulation des liquides.Ceci comprend une plaque de réaction profonde à 96 puits, un couvercle de boîte de pointes contenant de l'eau, un support d'enzymes contenant les enzymes dans des tubes Eppendorf de 1,5 millilitre et plusieurs boîtes de pointes pleines aux positions du plateau telles que programmées lors de la configuration de l'appareil. Une fois le plateau prêt, vérifiez le programme pour détecter d'éventuelles erreurs. Démarrez le Beckman FX.Le bras SPAN à huit canaux pipettera d'abord 200 microlitres de la suspension de biomasse dans chaque puits des plaques de réaction profondes 96 puits. Le module SPAN à huit canaux dispensera ensuite les enzymes dans chacun des puits, conformément au tableau importé dans le logiciel Biome FX. Une fois la pipette terminée, retirez la plaque profonde 96 puits du plateau.Scellez la plaque avec un film adhésif ou un capuchon. Ensuite, retournez la plaque et tapez-la une ou deux fois pour rompre la tension superficielle. Placez la plaque dans l’étuve d’hybridation pendant 48 heures après la centrifugation d’incubation.Placer la plaque à 96 puits profonds pendant trois minutes à 1 500 ×g dans une centrifugeuse à godets oscillants, pendant que la plaque tourne. Programmer le Beckman FX pour utiliser le module AP 96 afin de pipeter 100 microlitres de chaque puits dans une plaque standard à 96 puits. Ensuite, après la centrifugation, placer la plaque dans l'appareil et démarrer la pipetterie.Lorsque la pipetteuse a terminé. Incuber les plaques à 100 degrés Celsius pendant 10 minutes sur un bloc chauffant afin d'inactiver les enzymes, puis centrifuger la plaque à 1 500 ×g pendant 30 secondes. Pour les mesures de GLC, ajouter d'abord 192 microlitres du réactif glucose oxydase peroxydase, en utilisant un programme écrit pour le module AP 96 du Beckman FX.Ensuite, utilisez la tête AP 96 pour transférer 12 microlitres de l'échantillon dans une plaque 96 puits standard. Incubez les plaques à 50 degrés Celsius pendant 20 minutes et mesurez l'absorbance à 510 nanomètres à l'aide d'un lecteur de microplaques. Pour les mesures xlo, ajoutez les réactifs d'analyse selon les instructions du kit.Ensuite, utilisez la station AP 96 pour transférer quatre microlitres de chaque puits dans des plaques 384 puits et mesurez l'absorbance à 340 nanomètres. Effectuez l'analyse des données comme décrit dans le document accompagnant, à l'aide du logiciel Design Expert. Cinq substrats et trois prétraitements ont été comparés dans des conditions similaires de broyage avec une taille de particule de 0,5 millimètre, une charge enzymatique de 15 milligrammes par gramme de glucane et des conditions d'hydrolyse identiques.48 heures à 50 degrés Celsius, comme on peut le voir ici. Il existe des différences marquées entre les matières premières et entre les prétraitements. Il est clair que le cocktail d'enzymes accélère 1000 seul, ne peut pas gérer toute la variabilité observée dans les prétraitements et les matières premières.Cette expérience compare un four à maïs prétraité par A FEX, appelé A-F-E-X-C-S, un four à maïs prétraité par peroxyde alcalin, A-H-P-C-S, et des grains distillés séchés prétraités par A FEX, A-F-E-X-D-D-G. Les nombres situés au-dessus des barres indiquent les rendements en glucose exprimés en pourcentage du glucose total présent dans l'échantillon de biomasse. Remarquez que la composition des mélanges varie considérablement selon le prétraitement et le substrat de biomasse.Bien que l'utilisation principale de gem plat soit de créer des mélanges synthétiques d'enzymes pures, elle peut également servir à produire des mélanges optimisés de préparations enzymatiques commerciales. Le panneau A présente un diagramme circulaire de quatre enzymes optimisées pour libérer du glucose à partir de A-F-E-X-D-D-G. Le panneau B montre les rendements obtenus à l'aide de ce mélange optimisé par rapport à trois autres préparations enzymatiques. Nous venons de démontrer l'utilisation de gen plat pour faciliter la dégradation de la biomasse à l'aide d'enzymes pures individuelles.Chaque enzyme possède une activité catalytique spécifique qui contribue à la dégradation complète des parois cellulaires végétales en sucres individuels. Toutefois, il n'est pas nécessaire de connaître l'activité catalytique précise d'une enzyme pour évaluer son importance dans la déconstruction de la biomasse. En utilisant Gen pla, savoir quelles enzymes sont importantes et en quelles proportions est essentiel pour orienter la prospection biotechnologique.Pour de nouvelles enzymes destinées à l'ingénierie des protéines et au développement d'organismes pour un traitement biologique consolidé, les résultats peuvent parfois être surprenants. Par exemple, nous avons constaté que, pour libérer du glucose à partir de Conover, une combinaison de deux Xin aises non apparentés est supérieure à chacun des Xin utilisés seul. Nous avons également constaté qu'une meilleure manase est importante pour la libération de glucose à partir de grains secs de distillerie.Bien que ce matériau ait une faible teneur en betterman et en contenu, cette méthode ouvrira la voie aux chercheurs pour développer des cocktails enzymatiques encore meilleurs pour diverses conditions. Vous n'avez même pas besoin de connaître la fonction enzymatique précise d'une protéine particulière afin de tester sa contribution à la déconstruction de la lignocellulose.

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