Création d'Epstein-Barr Virus croissance transformées lignées lymphoblastoïdes

L'objectif général de cette procédure est de générer des LCL, c'est-à-dire des lignées cellulaires de lymphoblastes transformés par le virus d'Epstein-Barr, à partir de lymphocytes B humains. Cette étape est réalisée en isolant d'abord les cellules mononucléées du sang périphérique à partir de sang humain.

Ensuite, les cellules sont infectées par le virus d'Epstein-Barr eps en présence de FK 5 0 6 et d'agents immunosuppresseurs ; trois à quatre jours après l'infection par le virus d'Epstein-Barr EP, une sous-population de cellules apparaît, caractérisée par une expression élevée de CD 23, positive pour CD 58, et dont on prévoit qu'elle subira une prolifération CD 23 forte. Les cellules CD 58 positives peuvent être dénombrées par cytométrie en flux comme indicateur prédictif d'un résultat satisfaisant. Les cellules en prolifération peuvent être davantage identifiées, en microscopie et à l'échelle macroscopique, par les agrégats de lymphoblastes formés par les lignées cellulaires dans les cultures cellulaires correctement transformées.

La dernière étape consiste à amplifier les lignées cellulaires de lymphoblastes en vue de leur cryoconservation. Dans mon laboratoire, nous générons des lignées cellulaires de lymphoblastes, ou LCL, afin de comprendre les interactions entre l'hôte et le virus d'Epstein-Barr. Les lignées cellulaires de lymphoblastes présentent également un intérêt général étendu pour la communauté scientifique, en particulier pour les virologistes, les immunologistes et les biologistes du cancer.

En tant que boursier postdoctoral O dans un laboratoire du Macintosh, je vais démontrer la procédure de génération de lignées cellulaires de lymphoblastes. Après avoir prélevé 10 millilitres de sang sur un donneur, ajoutez le sang hépariné dans un tube conique de 50 millilitres, puis diluez-le au ratio de un à deux. En ajoutant 20 millilitres de PBS à température ambiante dans le tube, recouvrez délicatement le sang dilué avec 15 millilitres de milieu de séparation de lymphocytes FICO HIA, puis centrifugez le sang à 225 ×g sans frein, à température ambiante pendant 30 minutes afin d'établir un gradient.

Ensuite, retirez le culot blanchâtre et transférez-le dans un nouveau tube conique de 50 millilitres. Ajustez le volume à 50 millilitres avec du PBS, puis centrifugez les cellules à 600 ×g pendant 10 minutes. Versez le surnageant, resuspendez le culot dans 50 millilitres de PBS, puis lavez les cellules deux fois supplémentaires dans les mêmes conditions.

Resuspendez maintenant les cellules dans un millilitre de RPM complet. J'utilise cinq microlitres de cellules pour effectuer une dilution de un à 10 dans le bleu de tripan, puis je compte les cellules viables à l'aide d'un hémocytomètre, avant d'ajuster le volume avec du RPMI complet afin d'obtenir une concentration cellulaire de deux fois dix puissance six cellules par millilitre, et je transfère les cellules dans un flacon de culture tissulaire de 25 centimètres carrés.

Pour préparer les cellules à l'infection par le virus d'Epstein-Barr, ajouter du FK 5 0 6 dans le flacon de culture tissulaire pour obtenir une concentration finale de 20 M. Placer ensuite le flacon dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant une heure. Lorsque l'incubation des cellules est presque terminée, décongeler rapidement un aliquot de virus d'Epstein-Barr, prélevé à partir de cellules B 95 8. Retirer ensuite le flacon de l'incubateur et ajouter le virus d'Epstein-Barr aux cellules selon un dilution de un à dix. Agiter doucement le flacon pour mélanger le virus d'Epstein-Barr en solution, puis replacer le flacon en position verticale dans l'incubateur avec le bouchon vissé, mais légèrement desserré si un flacon non ventilé est utilisé, pendant deux à trois semaines avant l'expansion de la culture destinée à la cryoconservation.

Une semaine après les eps, l'infection par le virus d'Epstein-Barr, des agrégats de cellules sont visibles en microscopie optique, comme le montre cette figure représentative des premiers agrégats microscopiques. Au fil du temps, les agrégats microscopiques augmentent de taille, au point que des amas deviennent visibles macroscopiquement dans le flacon, comme illustré sur cette figure où de plus grands agrégats de LCL peuvent être observés. Pour nourrir les cellules, doubler le volume du milieu de support dans le flacon de culture au jour 12. Lorsque le milieu de culture devient jaune, généralement environ une fois par semaine, il est temps de nourrir les cellules afin de les faire proliférer, en augmentant le volume de la culture d'un facteur deux à trois.

À l’aide de RPMI complet, étendre la culture à 70 à 100 millilitres dans un flacon carré de 75 centimètres carrés au cours des prochaines semaines afin de produire des cellules destinées à la cryoconservation. La présence de CD23 et d’un grand nombre de cellules positives pour CD58, comme observé sur ce diagramme de dispersion, permet de prédire un résultat positif. Environ 2 à 3 % des cellules viables au jour 3 à 4 après exposition aux particules épisomales d’Epstein-Barr (eps EBV) présentent ce profil. D’autres sous-populations, telles que les cellules CD23 positives, CD23 négatives, CD58 positives et CD58 négatives observées après exposition aux eps EBV, montrent une prolifération minimale. Les cellules non infectées ou infectées par une souche non immortalisante d’EBV ne présentent pas de niveau élevé de CD23.

Cellules positives pour le CD58. Les cellules peuvent également être visualisées par microscopie optique. Comme mentionné, au bout d'une semaine suivant l'infection par le virus d'Epstein-Barr, de petits amas de cellules sont visibles dans le flacon en microscopie optique.

Au fur et à mesure que le temps passe et que les cellules se développent en LCL, les agrégats microscopiques deviennent plus grands, au point que des amas soient visibles macroscopiquement dans le flacon. Très bien. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la méthode permettant d'isoler les cellules mononucléées du sang périphérique à partir de sang humain et de générer des lignées cellulaires de lymphoblastes transformés par le virus d'Epstein-Barr à partir de lymphocytes B humains, bien que la génération de lignées cellulaires de lymphoblastes ait déjà été décrite par d'autres laboratoires.

L'avantage de notre protocole est qu'il fournit aux chercheurs une méthode permettant de prédire un résultat positif dès trois à quatre jours après l'infection des cellules B par le virus d'Epstein-Barr.