Name: Dérivation des cultures enrichies en oligodendrocytes et Oligodendrocyte / Neuron myélinisantes co-cultures de post-natal tissus murins (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 17 s
Description: Apprenez à dériver des populations enrichies de cellules précurseurs d'oligodendrocytes murins et à établir des co-cultures myélinisantes avec des neurones de ganglions rachidiens dorsaux.

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Ce projet a été financé par une subvention de la Société canadienne de la sclérose d&#39;RKRWO est récipiendaire d&#39;une bourse d&#39;études de la Société canadienne de la sclérose. DTS est un récipiendaire de bourses postdoctorales de la Multiple Sclerosis Society of Canada et les Instituts de recherche en santé.

<ol><li>Avellana-Adalid, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+rat+oligodendrocyte+progenitors+into+proliferative+%22oligospheres%22+that+retain+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Expansion of rat oligodendrocyte progenitors into proliferative "oligospheres" that retain differentiation potential.</a> J Neurosci Res. 45, 558-570 (1996).</li>
<li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).</li>
<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+and+control+of+cell+survival+in+the+oligodendrocyte+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell death and control of cell survival in the oligodendrocyte lineage.</a> Cell. 70, 31-46 (1992).</li>
<li>Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NGF+controls+axonal+receptivity+to+myelination+by+Schwann+cells+or+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes.</a> Neuron. 43, 183-1891 (2004).</li>
<li>Camara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-mediated+axoglial+interactions+initiate+myelination+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrin-mediated axoglial interactions initiate myelination in the central nervous system.</a> J Cell Biol. 185, 699-712 (2009).</li>
<li>Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+promote+myelination+in+response+to+electrical+impulses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Astrocytes promote myelination in response to electrical impulses.</a> Neuron. 49, 823-832 (2006).</li>
<li>Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nat Protoc. 2, 1044-1051 (2007).</li>
<li>Pedraza, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+characterization%2C+and+efficient+transfection+of+highly+pure+oligodendrocyte+precursor+cultures+from+mouse+embryonic+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Production, characterization, and efficient transfection of highly pure oligodendrocyte precursor cultures from mouse embryonic neural progenitors.</a> Glia. 56, 1339-1352 (2008).</li>
<li>Lewin, G. R., Ritter, A. M., Mendell, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+role+of+nerve+growth+factor+in+the+development+of+myelinated+nociceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">On the role of nerve growth factor in the development of myelinated nociceptors.</a> J Neurosci. 12, 1896-1905 (1992).</li>
<li>Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+vitro+studies+on+the+nerve+growth+factor+%28NGF%29+requirement+of+neurons.+II.+Sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative in vitro studies on the nerve growth factor (NGF) requirement of neurons. II. Sensory neurons.</a> Dev Biol. 58, 106-113 (1977).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Ce rapport décrit une méthode pour isoler les OPC murin de différenciation dans les cultures OL-enrichi ou OL / DRGN co-cultures. Lorsqu&#39;elle est cultivée seule, l&#39;OPC se différencier en MBP + LO VE, produisant de la myéline comme des feuilles membraneuses. Lorsqu&#39;il est ajouté à DRGN lits neurites, LO enveloppent les neurites DRGN avec MBP + membrane ve. Ce modèle profite à l&#39;enquête sur les fondements complexes qui régissent l&#39;OL à médiation ensheathment axonale. Tout d&#39;une grande valeur, l&#39;établissement de ces cultures est techniquement difficile. En particulier, les aspects exigeants incluent la digestion des tissus efficace / dissociation, l&#39;entretien de la culture médiatique au pH équilibré, et DRGN changements médias. Il est important de considérer que la durée de la digestion, la quantité de tissu étant digérée et le montant de la trituration affecte le résultat d&#39;efficacité et à la fin de la dissociation des tissus. Il n&#39;est pas inhabituel pour les chercheurs expérimentés d&#39;obtenir de faibles rendements cellulaires des tissus du système nerveux dissociés. En outre, les OPC murins ont tendance à être sensibles aux changements dans le pH du milieu de culture, en particulier dans des conditions alcalines. L&#39;entretien des cultures, à 8,5% de CO 2 vise à empêcher cela, puisque les OPC semblent mieux tolérer des conditions légèrement acides au cours de base. En ce qui concerne DRGNs alimentation, les changements de supports doivent être effectués rapidement pour ne pas dessécher les neurones, cependant, doit être doux pour ne pas perturber le lit de neurites en développement. Changements brusques des médias peuvent déloger le lit neurites du substrat, et le résultat probable dans sa dissociation complète de la lamelle. Le mérite potentiel de ce système modèle éclipse fortement son caractère techniquement exigeante. Un avantage de ce système est l&#39;utilisation de la post-natale des souris pour la dérivation de la culture cellulaire, en contournant la nécessité de sacrifier les femelles reproductrices de récolter des tissus embryonnaires. Un autre avantage est l&#39;absence d&#39;obligation pour les facteurs de croissance (GFS) pour l&#39;expansion de l&#39;OPC. Mixte cultures gliales fournir un environnement qui favorise la propagation des OPC, vraisemblablement en raison de la présence de facteurs trophiques astrocyte dérivées. D&#39;autres méthodes, telles que la dérivation via neurosphères 7,8, reposent sur ​​les propriétés mitogéniques de GFS tels que le facteur de croissance fibroblastique basique (bFGF), facteur de croissance épidermique (EGF) et le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) pour l&#39;expansion du CPVP. De même, en utilisant le développement postnatal (P5-10) pour les souris DRGNs évite l&#39;obligation de compléter les milieux de culture avec un facteur de croissance nerveuse (NGF), un facteur neurotrophique requis pour le taux de survie in vitro des embryons DRGNs 9, 10. Il est intéressant d&#39;éviter d&#39;utiliser le NGF car elle influence négativement la capacité de myélinisation des LO lorsqu&#39;elles sont cultivées avec des DRGNs 4. Éviter l&#39;utilisation du GF-complété des médias a aussi des avantages économiques, comme ces réactifs devenir coûteux s&#39;il est utilisé à grande échelle. Peut-être l&#39;avantage le plus important de ce modèle est sa culture de dérivation de la souris uniquement les tissus, offrant ainsi la possibilité de tirer à la fois les OPC et les DRGNs de la grande variété de lignées de souris transgéniques. Cela permet pour l&#39;étude de deux DRGN et / ou OPC propriétés spécifiques qui régissent la myélinisation. Cela sera particulièrement important pour l&#39;élucidation des interactions récepteur / ligand régulation OL-médiée myélinisation des axones. En tout, cette technique est d&#39;une grande valeur en ce qui concerne la recherche en neurosciences en raison de ses applications vers la compréhension des signaux moléculaires qui sous-tendent la myélinisation.

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Nom du produit </td><td> Société </td><td> Numéro de produit </td></tr><tr><td> Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) </td><td> Multicell </td><td> 319 à 005-CL </td></tr><tr><td> Hank Balanced Salt Solution (HBSS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14170-112 </td></tr><tr><td> Minimum Essential Media (MEM) </td><td> GIBCO </td><td> 12360-038 </td></tr><tr><td> Sérum fœtal bovin (FBS) </td><td> GIBCO </td><td> 10091-148 </td></tr><tr><td> Pénicilline-streptomycine (Pen / Strep) </td><td> GIBCO </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td></tr><tr><td> Poly-L-lysine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2636 </td></tr><tr><td> Albumine sérique bovine (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4503 </td></tr><tr><td> Homme mérosine protéine purifiée (LN2) </td><td> Millipore </td><td> CC085 </td></tr><tr><td> Recombinante du facteur neurotrophique rat ciliaire (CNTF) </td><td> PeproTech </td><td> 450-50 </td></tr><tr><td> L-thyroxine </td><td> Biochemika </td><td> 89430 </td></tr><tr><td> Holo-transferrine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T0665 </td></tr><tr><td> B27 complément </td><td> GIBCO </td><td> 0080085-SA </td></tr><tr><td> L&#39;insuline bovine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6634 </td></tr><tr><td> 3,3 &#39;,5-triiodo-L-thyronine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6634 </td></tr><tr><td> La progestérone </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8783 </td></tr><tr><td> Putrescine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7505 </td></tr><tr><td> Sélénite de sodium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5261 </td></tr><tr><td> 5-fluoro-2&#39;-désoxyuridine (FUDR) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0503 </td></tr><tr><td> Solution de papaïne </td><td> Worthington </td><td> LS003126 </td></tr><tr><td> DNaseI </td><td> ROCHE </td><td> 1010159001 </td></tr><tr><td> L-cystéine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7352 </td></tr><tr><td> 24 puits de culture tissulaire </td><td> Cellstar </td><td> 662-160 </td></tr><tr><td> Flacons de culture de tissu T25 avec capuchon de l&#39;évent </td><td> Corning </td><td> 430639 </td></tr><tr><td> Boîtes de 10 cm de culture de tissu </td><td> Corning </td><td> 430167 </td></tr><tr><td> 10 cm de Petri </td><td> Fisher Scientific </td><td> 0875713 </td></tr><tr><td> Une collagénase </td><td> ROCHE </td><td> 103578 </td></tr><tr><td> CellTrics 50 um (optionnel) de filtre </td><td> PARTEC </td><td> 04-004-2327 </td></tr><tr><td> La myéline protéine basique (MBP) Anticorps </td><td> AbD Serotec </td><td> MCA409S </td></tr><tr><td> NG2 d&#39;anticorps </td><td> Millipore </td><td> AB5320 </td></tr><tr><td> La myéline-associated glycoprotein (MAG) antibody </td><td> Millipore </td><td> MAB1567 </td></tr><tr><td> 2 &#39;, 3&#39;-cyclique nucléotide 3&#39;-phosphodiestérase (CNP) antibody </td><td> Covance </td><td> SMI-91R-100 </td></tr><tr><td> L&#39;actine pan Ab-5 anticorps </td><td> Fitzgerald </td><td> 10R-A106AX </td></tr><tr><td> Neurofilament-200 (NF) antibody </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N4142 </td></tr><tr><td> Bêta-tubuline trois chaînes (Tuj1) antibody </td><td> Millipore </td><td> MAB5544 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 chèvre anti-lapin IgG (H + L) anticorps secondaire </td><td> Invitrogen </td><td> A11008 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 555 chèvre anti-souris IgG (H + L) anticorps secondaire </td><td> Invitrogen </td><td> A21422 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 chèvre anti-rat (IgG) (H + L) anticorps secondaire </td><td> Invitrogen </td><td> A21247 </td></tr><tr><td> Chèvre anti-souris IgG (H + L)-HRP anticorps secondaire conjugué </td><td> BioRad </td><td> 170-6516 </td></tr><tr><td> Chèvre anti-rat IgG (H + L)-HRP anticorps secondaire conjugué </td><td> Santa Cruz Biotechnology </td><td> SC-2065 </td></tr><tr><td> 4 &#39;,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9542 </td></tr></tbody></table> Recettes des médias OL-100X * Supplément <table border="1"><tbody><tr><td> Ingrédient </td><td> Montant à ajouter </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 1,02 g </td></tr><tr><td> La progestérone </td><td> 0,6 mg </td></tr><tr><td> Putrescine </td><td> 161 mg </td></tr><tr><td> Sélénite de sodium </td><td> 0,05 mg </td></tr><tr><td> 3,3 &#39;,5-triiodo-L-thyronine </td><td> 4 mg </td></tr></tbody></table> * Store à -80 ° C dans 250 aliquotes t &quot;&gt; Médias OL <table border="1"><tbody><tr><td> Ingrédient </td><td> Montant à ajouter </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 23,75 mL </td></tr><tr><td> OL-100X Supplément </td><td> 250 uL </td></tr><tr><td> L&#39;insuline bovine (de 1 mg / mL de stock) </td><td> 125 ul </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> 250 uL </td></tr><tr><td> Holo-transferrine (de 33 mg / mL de stock) </td><td> 37,5 uL </td></tr><tr><td> B27 Supplément </td><td> 500 ul </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 125 ul </td></tr><tr><td> CNTF (de 50 ng / uL stock) </td><td> 25 uL </td></tr></tbody></table> Mixte des milieux de culture gliales (composé de DMEM) <table border="1"><tbody><tr><td> Ingrédient </td><td> La concentration finale </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Pen / Strep (0,33% du stock) </td><td> 33 unités / ml de pénicilline et 33 pg / ml de streptomycine </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> 1% </td></tr></tbody></table> DRGN médias (constitué de DMEM) <table border="1"><tbody><tr><td> Ingrédient </td><td> La concentration finale </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Pen / Strep (1% du stock) </td><td> 100 unités / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine </td></tr></tbody></table> Recettes solution de digestion: OPC papaïne solution (composé de MEM) <table border="1"><tbody><tr><td> Ingrédient </td><td> La concentration finale </td></tr><tr><td> Solution de papaïne </td><td> 1,54 mg / mL </td></tr><tr><td> L-cystéine </td><td> 360 pg / ml </td></tr><tr><td> DNaseI </td><td> 60 pg / mL </td></tr></tbody></table> DRG papaïne solution (composé de HBSS) <table border="1"><tbody><tr><td> Ingrédient </td><td> La concentration finale </td></tr><tr><td> La papaïne </td><td> 1,54 mg / mL </td></tr><tr><td> L-cystéine </td><td> 360 pg / ml </td></tr></tbody></table> DRG collagénase Une solution (composé de HBSS) <table border="1"><tbody><tr><td> Ingrédient </td><td> La concentration finale </td></tr><tr><td> Une collagénase </td><td> 4 mg / ml </td></tr></tbody></table>

dérivation des cultures enrichies en oligodendrocytes et oligodendrocyte / neuron myélinisantes co-cultures de post-natal tissus murins

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Identifier les mécanismes moléculaires qui sous-tendent le développement OL n&#39;est pas seulement essentielle pour approfondir notre connaissance de la biologie OL, mais a également des implications pour la compréhension de la pathogenèse des maladies démyélinisantes comme la sclérose en plaques (SEP). Développement cellulaire est communément étudié avec primaires modèles de culture cellulaire. Culture de cellules primaires facilite l&#39;évaluation d&#39;un type cellulaire donné en fournissant un environnement contrôlé, sans les variables exogènes qui sont présentes in vivo. Bien que les cultures OL provenant de rats ont fourni une grande quantité de comprendre la biologie de LO, des efforts similaires à établir des cultures OL de souris a été rencontré d&#39;obstacles majeurs. Développer des méthodes de culture murin LO primaire est impératif afin de profiter des lignes disponibles de souris transgéniques. De multiples méthodes pour l&#39;extraction des OPC à partir de tissus de rongeurs ont été décrites, allant de la dérivation Neurosphère, la purification de l&#39;adhérence différentielle et immunopurification 1-3. Alors que de nombreuses méthodes offrent de succès, la plupart nécessitent des temps de culture extensive et / ou du matériel coûteux / réactifs. Pour contourner cela, purifiant les OPC à partir de tissus murins avec une adaptation de la méthode initialement décrite par McCarthy &amp; de Vellis 2 est préféré. Cette méthode implique physiquement OPC séparant d&#39;une culture mixte gliales provenant cortex des rongeurs nouveau-nés. Le résultat est une population purifiée OPC qui peuvent être différenciées en une culture de l&#39;OL enrichi. Cette approche est attrayante en raison de ses temps de culture relativement courtes et l&#39;exigence inutile pour les facteurs de croissance ou des anticorps immunopanning. Tout en explorant les mécanismes du développement de LO dans une culture purifiée est informatif, il ne fournit pas l&#39;environnement le plus physiologiquement pertinents pour évaluer la formation gaine de myéline. Co-culture avec des neurones LO donnerait un aperçu des fondements moléculaires régulant l&#39;OL à médiation myélinisation des axones. Pour beaucoup de OL / neurone de co-culture des études, dorsale neurones ganglion de la racine (DRGNs) se sont révélés être le type de neurone de choix. Elles sont idéales pour la co-culture avec LO en raison de leur facilité d&#39;extraction, le montant minimal de cellules contaminantes, et la formation de neurites lits denses. Alors que les études utilisant rat / souris myélinisantes xenocultures ont été publiés 4-6, une méthode pour la dérivation d&#39;une telle OL / DRGN myélinisantes co-cultures de tissus post-natale murin n&#39;a pas été décrite. Nous présentons ici des méthodes détaillées sur la façon de produire efficacement de telles cultures, avec des exemples de résultats escomptés. Ces méthodes sont utiles pour aborder les questions pertinentes pour le développement de LO / fonction myélinisantes, et sont des outils utiles dans le domaine des neurosciences.

Cet article décrit les méthodes pour estimer la population enrichie des cellules précurseurs des oligodendrocytes murins (OPC) en culture primaire, qui se différencier pour produire des oligodendrocytes matures (MCO). En outre, ce rapport décrit des techniques pour produire murin myélinisantes co-cultures par semis OPC de la souris sur un lit de neurites de souris dorsale neurones ganglion de la racine (DRGNs).

Dérivation des cultures enrichies en oligodendrocytes et Oligodendrocyte / Neuron myélinisantes co-cultures de post-natal tissus murins

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Bonjour, je suis Ryan O'Mara, étudiant au doctorat à l'Université d'Ottawa et à l'Institut de recherche de l'Hôpital d'Ottawa. Ce protocole décrira les méthodes permettant d'obtenir des populations enrichies de cellules souches oligodendrocytaires provenant de souris, pouvant être différenciées seules ou en association avec des neurones du ganglion rachidien de souris afin de produire des cultures myélinisantes. Commençons par donner un bref aperçu de la procédure.Les cortes de souris néonatales sont dissociés et mis en culture dans des flacons T25. Après une période de culture de neuf jours, une monocouche d'astrocytes se forme à la base du flacon, sur laquelle prolifèrent les cellules précurseurs des oligodendrocytes. Ces cellules précurseurs sont ensuite récupérées, purifiées et peuvent ultérieurement être différenciées en oligodendrocytes matures dans une culture enrichie.Si l'on souhaite des cocultures myélinisantes, des neurones issus des ganglions rachidiens de souris P5 à P10 sont mis en culture conjointement avec les cultures mixtes de cellules gliales. Au cours d'une période de neuf jours, ces neurones forment un réseau dense de neurites sur lequel peuvent être ensemencées les cellules progénitrices d'oligodendrocytes.Cela permet l’enrobage des neurites par les oligodendrocytes, conduisant ainsi à une culture froide myélinisante. Tout d'abord, des cerveaux entiers de souris âgées de P0 à P2 sont placés dans du MEM glacé, puis transférés sous microscope de dissection. À l’aide d’un scalpel, incisez la couche méningée de chaque cortex de manière longitudinale, puis détachez délicatement les méninges du cortex sous-jacent. Ensuite, retirez les bulbes olfactifs avec le cerveau positionné côté ventral vers le haut.Effectuez des incisions longitudinales profondes là où les corticales rencontrent le céphalon ventral. Avec le cerveau côté dorsal vers le haut, détachez délicatement les corticales, puis taillez la cordeuse en environ quatre morceaux chacune. Transférez les corticales dans un tube conique de 15 millilitres contenant 350 microlitres de MEM froid sur glace par cerveau.Les cerveaux de même génotype sont regroupés dans le même tube, de sorte que quatre cerveaux nécessitent 1400 microlitres de MEM. Une fois la dissection terminée, transférez les cerveaux regroupés dans un bain-marie à 37 degrés pendant trois minutes. Ensuite, dans une hotte stérile de culture tissulaire, faites passer les morceaux de cerveau à travers une pipette P 1000 pour les fragmenter en éléments plus petits.Ajouter 75 microlitres de Pap pain OPC préchauffé par cerveau dans le tube conique. Incuber ensuite dans un bain-marie à 37 degrés pendant 20 minutes. Retourner le tube toutes les deux minutes afin d'éviter l'agrégation tissulaire.Une fois l'incubation terminée, ajouter deux millilitres de culture mixte de cellules gliales par cerveau au digestif, laisser reposer pendant 10 minutes. Après 10 minutes, aliquoter la suspension tissulaire dans des tubes en plastique de cinq millilitres.Le nombre de tubes doit correspondre au nombre de cerveaux dans la préparation. À l’aide d’une pipette Pasteur en verre polie à la flamme, agiter doucement au départ le contenu de chaque tube, puis de plus en plus intensément au fur et à mesure que les morceaux commencent à se dissocier. Arrêter l’agitation une fois qu’il ne reste plus de fragments visibles de tissu dans la suspension. Rassembler le contenu de chaque tube dans un tube conique de 50 millilitres contenant quatre millilitres de culture mixte de cellules gliales.Après avoir doucement retourné plusieurs fois le tube, répartir le milieu par cerveau en aliquotes dans des tubes coniques de 15 millilitres. Le nombre de tubes doit correspondre au nombre de cerveaux de la préparation. Centrifuger les tubes à 300 × g pendant cinq minutes et resuspendre les culots dans un millilitre de milieu de culture de gliocytes mixtes. Ajouter les cellules resuspendues provenant de chaque tube conique dans des flacons T25 revêtus de poly-L-lysine, prééquilibrés avec cinq millilitres de milieu de culture de gliocytes mixtes.Le nombre de flacons doit être égal au nombre de cerveaux disséqués. Incuber les flacons dans une étuve à 37 degrés et à 8,5 % de CO2. Après trois à quatre heures, les cellules doivent être adhérentes au substrat. Toutefois, de nombreux débris persistent dans le milieu, ce qui pourrait nuire à la viabilité cellulaire.Pour éviter cela, remplacez le milieu après trois à quatre heures par du milieu frais pour culture mixte de cellules gliales, si possible. Ce changement de milieu élimine une grande partie des débris cellulaires. Le jour suivant.De nombreuses cellules doivent être visibles à la base du flacon. Au troisième jour, une monocouche d'astrocytes devrait se former à la base du flacon. À ce stade, effectuez un changement des deux tiers du milieu en retirant quatre millilitres de milieu et en ajoutant quatre millilitres de milieu frais.Cette étape doit être répétée tous les trois jours. Au sixième jour, une monocouche d'astrocytes doit être clairement visible, sur laquelle prolifèrent les cellules souches d'oligodendrocytes. À ce stade, complétez le milieu de culture avec l'insuline à une concentration finale de cinq microgrammes par millilitre. Au neuvième jour, les cellules souches d'oligodendrocytes sont prêtes à être séparées de la monocouche d'astrocytes.Pour ce faire, placez les flacons sur un agitateur orbital et dans un incubateur avec 5 % de CO2. Laissez le flacon s'équilibrer dans cet incubateur pendant une heure. Agitez ensuite les cellules à 50 tr/min pendant 45 minutes.Cette étape élimine de nombreuses cellules contaminantes faiblement adhérentes. Effectuez un changement complet de milieu en retirant tout le milieu et en ajoutant à nouveau quatre millilitres de milieu de culture frais. Replacez le flacon dans un incubateur à 5 % de CO2 et laissez équilibrer pendant trois heures.Au bout de trois heures, vérifiez la coloration du milieu de culture. Le milieu de culture doit être rouge, ce qui indique un pH équilibré. Si la couleur tend vers l'orange ou le violet, ajustez en conséquence le taux de CO2 de l'incubateur.Le maintien d'un pH équilibré est important pour la survie des cellules progénitrices des oligodendrocytes pendant l'agitation nocturne. Une fois un pH équilibré obtenu, agiter le flacon à 220 tr/min pendant environ 16 heures. Le lendemain matin, retirer le flacon de l'agitateurs et transférer le milieu des flacons dans des boîtes de culture tissulaire de 10 centimètres.Ces boîtes serviront à purifier davantage les cellules progénitrices d'oligodendrocytes par adhérence différentielle. Chaque boîte doit recevoir le milieu de deux flacons ; incuber les boîtes à 5 % de CO2 pendant 30 minutes. Au bout de 15 minutes, secouer doucement chaque boîte afin d'empêcher les cellules progénitrices d'oligodendrocytes de s'adhérer au plastique.Après une incubation de 30 minutes, examiner les boîtes au contraste de phase. Les cellules progénitrices des oligodendrocytes apparaissent sous forme d'amas de petites cellules. Certaines de ces cellules peuvent s'être fixées au fond de la boîte.Relâchez délicatement les cellules progénitrices d'oligodendrocytes adhérentes à la boîte par agitation douce. Soyez prudent. Une agitation excessive peut entraîner le relâchement des types cellulaires contaminants.Transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15&nbsp;mL et centrifugez à 300&nbsp;×g pendant cinq minutes. Resuspendez délicatement le culot à l’aide d’une pipette P&nbsp;1000. Puis, à l’aide d’une pipette P&nbsp;200, comptez les cellules avec un hémocytomètre. Les oligodendrocytes purifiés peuvent ensuite être ensemencés sur des lamelles recouvertes d’un film adhésif pour leur différenciation en cultures enrichies en oligodendrocytes au jour un.Après la mise en culture, les cellules souches d'oligodendrocytes enrichies présentent une morphologie relativement simple, ne développant que quelques prolongements. Au troisième jour, les oligodendrocytes en différenciation ont émis de nombreux prolongements, rappelant ceux des oligodendrocytes immatures. Au sixième jour, les oligodendrocytes ont étendu des feuillets membranaires semblables à de la myéline à tout moment pendant cette période.Les lamelles de culture peuvent être fixées et traitées pour la cyto-immunochimie. Plutôt que de semer les précurseurs d'oligodendrocytes purifiés sur des lamelles recouvertes de laminine, ils peuvent être semés sur des réseaux de neurites de ganglions rachidiens pour produire des cocultures myélinisantes. Cette section suivante décrira les méthodes permettant d'obtenir ces cultures.Pour commencer, isoler les épines entières de souris P5 à P10 et les transférer sous un microscope de dissection avec des ciseaux de dissection. Inciser longitudinalement la région médiane ventrale de l'épine. Retirer soigneusement les ganglions de la racine dorsale ou GRD à l’aide de quatre étapes effectuées avec une pince fine.Transférez les ganglions dans une solution saline tamponnée de Hank dans une boîte de Pétri. Taillez les racines excessivement longues des GRD. À l’aide d’une pipette large pointe P 1000.Transférez les ganglions dans un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre. Conservez le tube sur de la glace jusqu'à ce que tous les souris aient été traitées. Une fois l'isolement des ganglions rachidiens terminé, centrifugez le tube à environ 300 ×g.Transférez le tube dans une hotte stérile de culture tissulaire et retirez le surnageant. Ajoutez 500 microlitres de papain DRG préchauffé dans le tube et incubez pendant 10 minutes dans un bain-marie à 37 degrés. Lorsque la digestion par la papaine est terminée, centrifugez, puis remplacez la solution de papaine.Avec 500 microlitres d'une solution de collagénase A, incuber à 37 degrés pendant 10 minutes. Répéter l'étape de centrifugation et remplacer la solution de collagénase A par un millilitre de milieu de culture DRGN. Après notre étape finale de centrifugation, ajouter un millilitre de milieu DRGN et trier à l’aide d’une pipette Pasteur en verre polie à la flamme.Agitez doucement au début, puis avec une intensité croissante au fur et à mesure que le tissu commence à se dissocier. Une fois qu'aucun fragment de tissu n'est plus visible, transférez la suspension cellulaire dans une boîte de Pétri contenant sept millilitres de milieu DRGN. Incubez la boîte dans un incubateur à 37 degrés à 8,5 % de CO2 pendant une heure et un quart.Après cette incubation, observer la boîte de Pétri. En contraste de phase, les neurones des ganglions rachidiens apparaissent comme des cellules à gros corps cellulaires. De nombreuses cellules indésirables doivent être fermement adhérentes à la boîte de Pétri.Transférez le milieu dans un tube conique de 15 millilitres et rincez la boîte avec quatre millilitres de milieu DRGN pour récupérer les neurones restants. Effectuez une centrifugation du tube conique à 300 ×g pendant cinq minutes. Remettez en suspension le culot obtenu dans 500 microlitres de milieu DRGN.Comptez les cellules à l'aide d'un cytomètre HEO. Veillez à ne compter que les neurones du ganglion racinaire dorsal ; semez entre 30 000 et 50 000 neurones par lamelle de 12 millimètres revêtue, dans un millilitre de milieu de culture DRGN. Incubez les cellules dans un incubateur à 8,5 % de CO₂.Le lendemain matin, effectuez un changement complet de milieu en rempla&ccedil;ant le milieu DRGN par du milieu ol suppl&eacute;ment&eacute; en FUD R &agrave; 10 micromolaire tous les deux jours. Par la suite, effectuez un changement des trois quarts du milieu avec du milieu ol suppl&eacute;ment&eacute; en FUD r. Lorsqu'on les observe au microscope &agrave; contraste de phase au jour 1, les neurones ont commenc&eacute; &agrave; &eacute;mettre quelques prolongements. Au jour 3, les prolongements neuronaux se sont allong&eacute;s.À J6, un réseau de neurites s'est développé, composé de nombreux prolongements entremêlés. À J9, ce réseau de neurites a augmenté en densité et est prêt à recevoir des oligodendrocytes provenant de cultures mixtes de cellules cérébrales en croissance. Parallèlement aux cultures neuronales, les cellules souches d'oligodendrocytes peuvent être purifiées au neuvième jour des cultures neuronales.Ils peuvent ensuite être mis en place sur les lits de neurites, en ajoutant 50 000 cellules à chaque puits d'une plaque de 24 puits. Au sixième jour de co-culture, des cellules rappelant les oligodendrocytes peuvent être observées en interaction avec les neurones du ganglion de la racine dorsale.Les cellules de ces cultures peuvent désormais être fixées et traitées pour l'immunocytochimie. Lorsque des cultures enrichies d'oligodendrocytes sont marquées par des anticorps dirigés contre les marqueurs spécifiques des oligodendrocytes, des cellules immunoréactives NG deux mag et MVP apparaissent, présentant des morphologies propres à chaque stade de développement. Ces cultures proviennent d'une population de précurseurs d'oligodendrocytes NG deux positifs, qui, au cours des six jours de différenciation, donnent naissance à des oligodendrocytes matures exprimant MAG.Lorsqu'une électrophorèse SDS-PAGE est réalisée sur des lysats obtenus à partir de cultures enrichies en oligodendrocytes, on observe que les oligodendrocytes expriment CNPP et MVP au cours des six jours. En examinant les neurones du ganglion rachidien avant l'ajout d'oligodendrocytes, des réseaux de neurites denses en Taj1 et positifs pour les neurofilaments sont visibles au neuvième jour. Au sixième jour de la co-culture d'oligodendrocytes et de neurones du ganglion rachidien, de nombreux oligodendrocytes positifs pour la MBP peuvent être observés en interaction avec les neurites neuronales à un grossissement plus élevé.On observe que les oligodendrocytes entourent ces neurites avec une membrane positive pour la protéine de base de la myéline (MBP), ce qui rappelle la myélinisation ; une vue agrandie numériquement montre l'importance du recouvrement de la membrane positive pour la MBP sur le prolongement positif pour les neurofilaments. Bonjour, je suis Scott Ryan, chercheur postdoctoral à l'Institut de recherche de l'Hôpital d'Ottawa. Ces techniques permettent de générer des systèmes de co-culture de ligaments, d'endocytes et de neurones du ganglion de la racine dorsale (DRG) provenant de souris.Cette technique est utile pour l'étude des modèles expérimentalement induits et des modèles transgéniques de maladies de la myélinisation. Elle est également efficace pour le criblage de nouveaux composés thérapeutiques.

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Neuroscience

Neurosciences

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