Suivi de l'activité ubiquitine-protéasome dans les cellules vivantes aide d'un Degron (dgn)-déstabilisé Green Fluorescent Protein Reporter Protéines (GFP) à base de

L'objectif général de cette procédure est de mesurer l'activité du protéasome dans des cellules vivantes à l'aide d'une protéine de fusion A GFP Deron. Commencez par cloner les oligonucléotides personnalisés pour Deron et le décalage du cadre de lecture de Deron. Insérez-les dans le vecteur P-E-G-F-P-C un, puis poursuivez avec les protocoles du système Gateway fourni par Vitrogen. Ensuite, produisez des virus pour chaque construction en utilisant des cellules HEK 2 93 FT. Après avoir déterminé le titre, transduisez les cellules avec le virus et appliquez une sélection antibiotique, puis étendez les cellules stables résultantes exprimant GFP DRON ou GFP Dron avec décalage du cadre de lecture.

Cette technique facilite les expériences qui surveillent la réponse cellulaire à des traitements donnés par le biais de mesures de signaux fluorescents. Par exemple, l'activité du protéasome peut être facilement évaluée à l'aide de la microscopie à fluorescence épifluorescente ou de la cytométrie en flux. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les dosages luminescents ou fluorogéniques utilisant des acides entiers de cellules, est que l'activité du protéasome est mesurée dans des cellules vivantes. Pour la transfection, diluez 36 microlitres du réactif lipo 2000 dans 1,5 millilitre de DMEM ; dans un autre tube Falcon de 15 millilitres, diluez les constructions d'ADN dans 1,5 millilitre de DMEM.

Après cinq minutes, mélanger les deux solutions et incuber pendant 20 minutes à température ambiante. Remplacer ensuite le milieu d'une culture confluente de cellules HEK 2 93 FT dans un flacon T 75 par sept millilitres de DMEM. Ajouter alors le mélange ADN-lipo au flacon et mélanger en inclinant doucement le flacon en avant et en arrière.

Incuber le flacon toute la nuit à 37 degrés Celsius dans un incubateur avec 5 % de CO2. Le jour suivant, remplacer le milieu par 10 millilitres de DMEM. Après 48 heures, récolter le surnageant. Filtrer le surnageant contenant le virus à travers un filtre en PVDF de 0,45 micromètre.

Pour concentrer le virus, ajoutez un volume de solution de PEG à quatre volumes de surnageant et incubez pendant deux heures à quatre degrés Celsius avec des mélanges périodiques par retournement. Récoltez le virus par centrifugation après avoir aspiré le surnageant ; centrifugez à nouveau le culot blanc pour éliminer toute trace de solution de PEG. Resuspendez le culot final dans du PBS à l’aide d’une pipette, puis vortexez énergiquement pendant 20 à 30 secondes.

Conserver des aliquotes de 100 microlitres de virus à moins 80 degrés Celsius. Ensemencer des cellules U2 OS dans des plaques à six puits et incuber toute la nuit. Pour la transfection, remplacer le milieu de culture par un millilitre de DMEM contenant huit microgrammes par millilitre. Poly cerveau réserver un puits comme témoin positif et tester une série de concentrations virales dans les puits restants.

Incuber toute la nuit le jour suivant. Remplacer le milieu par deux millilitres de DMEM et incuber pendant 24 heures. Commencer la sélection avec 10 microgrammes par millilitre de blasticidine, et continuer à remplacer le milieu contenant l'antibiotique tous les deux jours.

Environ six à sept jours plus tard, vérifier la mort cellulaire des cellules non transduites. Laver ensuite les cellules trois fois avec du PBS pour les colorer. Recouvrir de violet de crésyl et incuber de cinq à dix minutes à température ambiante, puis aspirer le colorant, rincer la plaque deux fois avec de l’eau doublement distillée et laisser sécher à l’air libre.

Enfin, compter les colonies pour calculer les unités de transfection du virus par millilitre. Séminer des fibroblastes diploïdes humains dans des plaques de six puits avec huit microgrammes par millilitre de polybrene comme agent d'amélioration de la transduction.

Utilisez une multiplicité d'infection de deux dans un volume total d'un millilitre. Changez le milieu. Le jour suivant, lorsque la culture est à 70 à 80 % confluente.

Commencez la sélection chronique avec 10 microgrammes par millilitre. Au fil des jours, surveillez la mort cellulaire complète, indiquant que la sélection est terminée. Étendez les cellules transduites de manière stable afin de générer une lignée cellulaire exprimant les protéines de fusion GFP DERON ou GFP Deron avec décalage du cadre de lecture. Commencez par ensemencer les cellules portant soit GFP DRON, soit GFP DRON avec décalage du cadre de lecture, le jour suivant, trois heures avant les faits.

Traitez les cellules témoins avec un inhibiteur de protéasome. Lavez deux fois avec du PBS et récoltez les cellules en utilisant 0,5 millilitre de trypsine. Pour arrêter la trypsine.

Utilisez 4,5 millilitres de milieu de culture et transférez les cellules dans un tube Falcon de 15 millilitres. Réalisez la récolte des cellules par centrifugation. Après un lavage avec du PBS, resuspendez le culot dans 400 microlitres de tampon fax. Transférez les cellules dans des tubes fax et placez-les sur de la glace.

Mesurez maintenant les échantillons par cytométrie en flux. La protéine de fusion GFP Deron porte une séquence qui cible le protéasome pour une dégradation immédiate. En revanche, le mutant par décalage du cadre de lecture GFP Deron FS n'est pas dégradé par les protéasomes.

Par conséquent, lorsqu'elles sont transduites avec GFP Deron, les fibroblastes humains jeunes activés, qui présentent une activité protéasomale élevée attendue, montrent un signal fluorescent faible en microscopie à fluorescence épiscopique. Les mêmes cellules transduites avec le cadre de lecture décalé GFP Deron affichent 39,7 % de cellules positives. Le traitement des cellules avec les inhibiteurs du protéasome II et L entraîne une augmentation des signaux jusqu'à un maximum d'environ 63 %, tant dans les cellules GFP Dron que dans les cellules GFP Dron à cadre de lecture décalé.

Des mesures similaires effectuées sur des fibroblastes dermiques, isolés de donneurs jeunes, d'âge moyen et âgés, révèlent une augmentation nette du signal GFP entre les individus jeunes et les donneurs d'âge moyen, indiquant une diminution de l'activité du protéasome dans les échantillons provenant de donneurs âgés. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la production de particules rétrovirales lentivirales, de la transfection des cellules et de la détermination de l'activité du protéasome dans des cellules vivantes.