Name: Construire un petit budget laser axotomie système pour étudier la régénération des axones dans le C. elegans /em (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Découvrez comment assembler et aligner un système d'ablation laser à petit budget pour étudier la régénération des axones chez C. elegans. Cette méthode précise permet de couper les axones avec des dommages collatéraux minimaux.

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Cette recherche a été soutenue par la National Science Foundation, le Fonds de dotation McKnight for Neuroscience, le Christopher et Dana Reeve Foundation et Amerisure Charitable Foundation.

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</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Il ya plusieurs bonnes discussions sur la microchirurgie au laser avec des systèmes de laser différentes 3,5-11. Femtoseconde lasers IR sont le «gold standard» pour l&#39;ablation laser subcellulaire 12 et commode si associé à une installation d&#39;imagerie, mais ils sont souvent trop coûteux pour les utilisateurs individuels. Si vous avez besoin d&#39;un laser femtoseconde pour l&#39;imagerie infrarouge de votre échantillon en raison de la profondeur de l&#39;imagerie, alors vous aurez probablement besoin d&#39;une pour le laser axotomie. Tissus transparent avec les axones cible au sein de 30 à 50 um de la surface sont probablement faisable avec les lasers à impulsions bleu et vert dans les 20 UJ / impulsion fourchette cible à travers une lentille d&#39;immersion na élevé. Il n&#39;y aura plus de dommages collatéraux avec le nano et pico seconde lasers rapport avec le laser femtoseconde, d&#39;autant que la profondeur de l&#39;axone augmente cible. C. elegans est transparent et tous les axones sont à 20-30 um de la surface. Nous faisons régulièrement coupé axones moteurs qui sont dans les 5 um de la surface. Nous avons aussi facilement couper hacheons dans l&#39;anneau nerveux qui sont environ 20 um de la surface de la cuticule. Nous avons trouvé la limite pour la coupe des axones à environ 30-50 um par le diamètre d&#39;un ver adulte. Il est probable que le système d&#39;ablation laser décrit ici serait bien travailler avec de nombreuses préparations différentes qui répondent aux critères de transparence et de la profondeur des axones cible. Pourtant, il est un peu surprenant, étant donné les avantages théoriques des lasers femtoseconde IR, que 355 nano et picoseconde nm et 532 nm lasers exécuter si bien pour le laser axotomie en C. elegans 6,13. Nous ne voyons aucune différence dans la régénération des axones en réponse au laser nanoseconde avec axotomie 440 nm, 532 nm nanoseconde, et des lasers femtosecondes infrarouge. Solid state lasers UV 355 nm sont environ le même coût que la diode 532 nm pompé passivement Q-Switched laser à état solide, mais nécessitent des puissances supérieures ou optique qui passent efficacement ces longueurs d&#39;onde plus courtes. La plupart des optiques sont conçus pour bien performer avec 400 visibles -700 nm de lumière. 355 nm lasers offrirait certains avantages tels que six seuil de réduction du plasma, la taille plus petite place, et une longue passe dichroïque serait efficace à 100% directes de l&#39;ablation par laser à la cible et permettre l&#39;imagerie simultanée de la GFP sans perte de signal de l&#39;échantillon. Les lasers bleus nm 440 conserverait les avantages de travailler avec un laser de lumière visible (de bonnes performances avec des optiques standard et de sécurité). Malheureusement, le coût d&#39;un DPP Q-switched laser à état solide 440 nm est de 3 fois le coût d&#39;un laser 355nm ou 532 nm de puissance similaire à ce moment. Si nous devions concevoir un nouveau système pour C. elegans, où la profondeur des cibles est minime, nous opterions pour une lentille transparente aux UV (coût environ $ 3.000 pour une lentille d&#39;huile 1.3na 40x avec 50-70% de transmittance à 355nm) et un laser 355 nm produisant 50 à 10 UJ / impulsion à 1 -20 kHz. L&#39;ablation Axon est pensé pour être dû à la formation du plasma. Impulsions plus courtes produira seuils plasma à faible puissance et les volumes de plasma w<html> malades seront plus petits 6. L&#39;objectif est de produire le plasma et petit plus éphémère en ajustant l&#39;énergie d&#39;impulsion à la plus faible puissance. Agrandir les plasmas de longue durée va générer des bulles de cavitation que les dommages entourant les cellules. Nous avons généralement constaté que l&#39;ablation en utilisant environ 50-100 impulsions à la fréquence la plus élevée (c.-à 2.5kHz) donne les meilleurs résultats. Cela suggère que les dommages peuvent être progressivement intégrée sur une série d&#39;impulsions afin de mieux contrôler l&#39;étendue des dégâts. Le système d&#39;ablation laser décrite ici est très indulgent si le faisceau est aligné et élargi avec précision. Nous commençons la coupe des axones vers adultes à la puissance du laser à 10% (moyenne de 0,3 mW mesuré à 2500 Hz et environ 1 UJ / impulsion) et peut couper avec des dommages localisés limitée par la puissance de 14%. Vous pouvez observer plus grandes zones de dégâts de 15 à 39% la puissance du laser, mais seulement au-dessus 40% de puissance (environ 1 mW en moyenne mesurée à 2500 Hz) ne les vers exploser à cause de grandes bulles de cavitation et de dommages à la cuticule du ver. e_content &quot;&gt; Le Steinmeyer et al. 2010 2 papier est une excellente ressource pour construire un système d&#39;ablation laser. Leon Avery a aussi une belle description pratique d&#39;un système d&#39;ablation laser basé sur un laser à gaz N2 nm coûteux 337 et il fournit certaines pratiques très conseils (elegans.swmed.edu / Worm_labs / Avery /). Lorsque vous concevez votre propre système, vous devriez d&#39;abord parler avec votre représentant microscope afin de déterminer comment cibler le laser d&#39;ablation à l&#39;objectif du microscope. Votre microscope doit être monté sur une table anti-vibrations (Newport, TMI, Thor). Un haut breadboard est optimal, mais un top en acier massif peut toujours être utilisé avec positionneurs magnétiques. Un module dédié intermédiaires sur une portée verticale est agréable car tous les éléments optiques peut être laissé en place. Cependant, il peut être moins coûteux et plus commode d&#39;utiliser un port de la caméra (inversé) ou un «combinateur» attaché à un port epi-fluorescence. Vous avez besoin de connaître la taille de l&#39;ouverture arrière et la transmission (à l&#39;une<html> blation longueur d&#39;onde laser) de l&#39;objectif que vous comptez utiliser. Une fois que vous décidez sur un laser (par exemple, Crylas, TEEM, Cristal, ou CRC), vous devez contacter Thor ou de Newport pour aider à sélectionner les bons éléments d&#39;optique, matériel informatique et de sécurité. Nous avons décidé d&#39;un élargisseur de faisceau Galiléen double pour économiser l&#39;espace, mais une simple extension de Kepler est une option (F2/F1 = facteur d&#39;expansion). Un expanseur de faisceau personnalisé sera le moins cher, mais à Newport, Thor, et plusieurs des fabricants de lasers offrent une excellente qualité commerciale du faisceau extenseurs. Certains fabricants de lasers offrent également atténuateurs manuelle et à commande électronique qui peut être rentable et peu encombrant, mais pas aussi polyvalent que le polariseur de Glan-Thompson et la plaque demi-onde. Vous aurez également besoin de décider la façon de contrôler le laser. Vous pouvez concevoir un contrôleur de LabView, utilisez un générateur commerciaux TTL, ou les logiciels fournis par l&#39;entreprise au laser. Discutez des options avec le fabricant de laser spécifique. tente »&gt; Nous avons fourni une liste du matériel que nous avons utilisé seulement comme un guide général. Le système décrit ici a coûté environ $ 15 000 lorsqu&#39;elle est ajoutée à notre système d&#39;imagerie existants. Votre département Physique locales auront souvent quelqu&#39;un qui est prêt à fournir une introduction pratique à en toute sécurité travaillant avec des lasers faisceau libre. Méthodes alternatives pour l&#39;immobilisation et laps de temps d&#39;imagerie de C. elegans ont été récemment décrites. 14 Dépannage L&#39;étape la plus difficile et critique l&#39;alignement du faisceau centré étendu à l&#39;axe optique du microscope. Une fois que vous avez le faisceau centré et étendu à travers les lentilles de Galilée, vous devez travailler dur pour obtenir ce aligné à moins de 5 um de l&#39;axe optique du microscope avant d&#39;utiliser les miroirs de pilotage de l&#39;alignement final pour le centre. L&#39;utilisation excessive des miroirs de direction pour aligner le faisceau du microscope va l&#39;amener hors axe passant par le faisceauexpandeur. utilisant PRUDENCE EXTRÊME vous pouvez atténuer le faisceau laser avec le filtre ND approprié et visualiser directement le profil du faisceau laser sur une cible réfléchissante (miroir surface frontale). Vous pouvez doucement pousser le microscope avec précision le centre du faisceau dans le champ de l&#39;objectif 60X de vue (si elle ne peut pas être centré dans le haut / bas gamme dont vous avez besoin d&#39;ajuster la hauteur du rail). Le profil du faisceau peut être utilisé pour aligner avec précision l&#39;axe microscope optique pour donner un faisceau centré qu&#39;il est circulaire et «fusées» de façon symétrique. Une éruption asymétrique est une indication que l&#39;axe microscope n&#39;est pas parfaitement aligné (ou le rail n&#39;est pas de niveau). Enfin, vous devriez ajuster L3 et voir une expansion régulière et symétrique et la contraction de la poutre. Focus du microscope, précisément sur la surface cible et ensuite ajuster L3 à focaliser le faisceau laser pour la plus petite tache. Vous devriez maintenant constater que le faisceau laser est à 5 um du centre où imagé via LSCM ou CCD système et l&#39;endroit d&#39;ablation est dans1um de concentration Z. Si vous trouvez que vous &quot;sauter&quot; vers ou constamment générer de grandes bulles de cavitation à couper axones votre problème est plus probable l&#39;alignement amende de l&#39;ablation laser. Assurez-vous que le minimum (&lt;500nm) tache d&#39;ablation est localisée à la mise au point Z (ajuster la convergence avec lentille L3) et à l&#39;endroit XY fiduciaires (ajuster avec miroir cinématiquement montés dernière). Cibler les axones près de la surface, il faudra moins de puissance de laser. De même, les petits animaux (L1 et L2), il faudra moins de puissance laser pour axotomie rapport à cibler les axones même chez les adultes. Si votre axones de type sauvage ne se régénèrent pas ou l&#39;eau de Javel axones vous devriez essayer de réduire la puissance d&#39;imagerie laser ou en diminuant le taux d&#39;échantillonnage. Si vos vers meurent ou deviennent maladives essayez de réduire le Agarose pour cent dans les étapes 1%. Assurez-vous que vous ne bougez pas la lamelle, après les vers de montage comme ce sera souvent provoquent leur mort lors de l&#39;utilisation élevée parpourcentage d&#39;agarose et des microsphères. Si vos vers éclater ou meurent lors d&#39;une session time-lapse, il est dû à: 1. Pourcentage d&#39;agarose est trop élevé. 2. Dommages aux cuticules par ablation laser. 3. Mouvement de la lamelle après le montage. Si des dommages à la cuticule est en faute qu&#39;elle affectera seulement les vers montés qui ont été ciblés avec le laser d&#39;ablation. Si votre ver se déplace trop pendant une session time-lapse essayez d&#39;augmenter le pourcentage d&#39;agarose dans les étapes de 0,5%. Axones sains dans les vers sains sont toujours «actif» et d&#39;afficher un niveau homogène de la fluorescence. Si vous voyez une diminution soudaine de la fluorescence ou de l&#39;activité du ver est mourant ou mort. Plusieurs axones perlées ou fragmentées sont un signe certain d&#39;un ver mourant ou mort. Si vous avez du mal à garder votre axones se concentrer lors de la session laps de temps ensemble il peut y avoir plusieurs problèmes différents. Premièrement, vérifiez votre dérive scène par l&#39;imagerie d&#39;un échantillon inerte sur une lame de verre de plus de 10 hrs. Une dérive quelques microns peuvent être dus à l&#39;instabilité thermique, mais supérieure à 5 um est probablement dû à des problèmes mécaniques avec votre microscope. Problèmes avec le montage sont plus communs. Laissez vos vers montés s&#39;équilibrer avec votre platine de microscope pendant 30 minutes avant de commencer votre laps de temps. Vérifiez que votre sceau vaseline n&#39;ont pas développé de fuites au cours de votre session laps de temps.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> 535 nm laser </td><td> Crylas </td><td> FDSS532Q3 </td><td> (TEEM, Crystal, et CRC offrent également des lasers comparables) </td></tr><tr><td> Toutes les optiques et le matériel </td><td></td><td></td><td> (Thor offre optiques comparables et matériel) </td></tr><tr><td> SUPREMA optique Mount, 1,0 de diamètre </td><td> Newport </td><td> SS100-F2KN </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Une «post diamètre, 1&quot; de hauteur </td><td> Newport </td><td> PS-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Une «fourche de diamètre après </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Achromatique d&#39;ordre zéro Plate Wavel, Retardation vague ½, 400-700nm </td><td> Newport </td><td> 10RP52-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Stade de rotation, une &quot;Aperature </td><td> Newport </td><td> RSP-1T </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Une «post diamètre, 1&quot; de hauteur </td><td> Newport </td><td> PS-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Une «fourche de diamètre après </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Glan-Laser Polarisant calcite, 430-700nm </td><td> Newport </td><td> 10GL08AR.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Rotation Polarisant mont </td><td> Newport </td><td> RM25A </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ¼ &quot;entretoise pour une« post diamètre </td><td> Newport </td><td> PS-0.25 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ½ &quot;de hauteur, une« après Diamètre </td><td> Newport </td><td> PS-0.5 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Fork, 1 message &quot;de diamètre </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Décharge de faisceau </td><td> Newport </td><td> PL15 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Microscope Objectif Monture </td><td> Newport </td><td> LH-OBJ1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Une «post diamètre, 1&quot; de hauteur </td><td> Newport </td><td> PS-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Une «fourche de diamètre après </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> High-Energy Laser Nd: YAG miroir, 25,4 mm de diamètre, 45 °, 532 nm </td><td> Newport </td><td> 10Q20HE.2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> SUPREMA optique Mount, 1,0 pouces de diamètre, trou de passage de montage </td><td> Newport </td><td> SN100C-F </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Haute précision de réglage à vis Bouton, voyages 12.7mm, 100TPI </td><td> Newport </td><td> AJS100-0.5K </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Adaptateur fileté, ¼ -20 masculins, 8-32 femelles </td><td> Newport </td><td> SS-1-B </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Rod Clamp pour 1,5 cm de diamètre tige </td><td> Newport </td><td> 340-RC </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Rod, 14 pouces (35,5 cm) </td><td> Newport </td><td> 40 </td&gt; <td> 1 </td></tr><tr><td> Transporteur ferroviaire pour le X26, carré longueur 40mm </td><td> Newport </td><td> CN26-40 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Steel Rail, 384mm (15 &quot;) de longueur </td><td> Newport </td><td> X26-384 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Plate-forme de tige pour tige 1,5 cm de diamètre </td><td> Newport </td><td> 300-P </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Rod, 14 pouces (35,5 cm) </td><td> Newport </td><td> 40 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Plano-lentille concave, diamètre 12,7 mm, 25mm-EFL, 430-700nm </td><td> Newport </td><td> KPC025AR.14 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Lentille plan-convexe, diamètre 25,4 mm, 50.2mm EFL, 430-700nm </td><td> Newport </td><td> KPX082AR.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Lentille plan-convexe, diamètre 25,4 mm, 62.9mm EFL, 430-700nm </td><td> Newport </td><td> KPX085AR.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Monture fixe, 0,5 &quot;de diamètre, 1,0&quot; Hauteur d&#39;axe </td><td> Newport </td><td> LH-0.5 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Monture fixe, 1,0 &quot;de diamètre, 1,0&quot; Hauteur d&#39;axe </td><td> Newport </td><td> LH-1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Microsphères 0.1um </td><td> Polysciences </td><td> 00876 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> RPI </td><td> A20090 </td><td> Questions EEO </td></tr><tr><td> Muscimol </td><td> Sigma </td><td> M1523 </td><td></td></tr></tbody></table>

construire un petit budget laser axotomie système pour étudier la régénération des axones dans le c. elegans</em

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Laser axotomie suivie par microscopie time-lapse est un test sensible des phénotypes régénération des axones dans C. elegans 1. La principale difficulté de ce dosage est le coût perçu ($ 25-100K) et de l&#39;expertise technique nécessaire pour mettre en œuvre un système d&#39;ablation laser 2,3. Toutefois, les lasers à impulsions à l&#39;état solide des coûts modestes (&lt;$ 10K) peut fournir une performance robuste pour l&#39;ablation au laser dans des préparations transparentes où les axones cibles sont «proches» de la surface du tissu. Construction et de l&#39;alignement d&#39;un système qui peut être accompli en une journée. Le chemin optique fournie par la lumière du condenseur concentré à l&#39;ablation laser fournit un guide d&#39;alignement commode. Un module intermédiaire avec toutes les optiques retiré peut être dédié à l&#39;ablation laser et assure qu&#39;aucun des éléments optiques doivent être déplacés lors d&#39;une séance d&#39;ablation laser. Un dichroïque dans le module intermédiaire permet l&#39;imagerie simultanée et l&#39;ablation laser. Centrer le faisceau laser to le faisceau sortant de la lentille de condenseur de microscope concentré guides de l&#39;alignement initial du système. Une variété de lentilles sont utilisés pour conditionner et d&#39;élargir le faisceau laser pour remplir l&#39;ouverture arrière de la lentille de l&#39;objectif choisi. L&#39;alignement final et les essais sont effectués avec une cible de surface miroir glisser façade en verre. Puissance du laser est ajustée pour donner une place de taille minimale d&#39;ablation (&lt;1um). Le spot d&#39;ablation est centré par des ajustements précis du miroir dernière cinématiquement montée en réticule fixe dans la fenêtre d&#39;imagerie. Laser de puissance pour axotomie sera d&#39;environ 10 fois plus élevée que celle nécessaire pour la tache d&#39;ablation minimale sur la diapositive cible (cela peut varier avec la cible que vous utilisez). Les vers peuvent être immobilisés pour le laser axotomie et imagerie time-lapse en montant sur ​​des patins d&#39;agarose (ou en microfluidique chambres 4). Coussinets Agarose sont facilement faites avec 10% d&#39;agarose dans une solution saline équilibrée fondu dans un four micro-ondes. Une goutte d&#39;agarose fondu est placé sur une lame de verre et aplatie avec un autrelame de verre dans un pavé d&#39;environ 200 um d&#39;épaisseur (une seule couche de ruban de temps sur des lames adjacentes est utilisé comme une entretoise). Un &quot;Sharpie&quot; bouchon est utilisé pour découper un bloc de diamètre uniforme circulaire de 13mm. Anesthésique (1UL Muscimol 20mm) et des microsphères (Chris Fang-yen communication personnelle) (1UL 2,65% polystyrène 0,1 um dans l&#39;eau) sont ajoutés au centre du pavé suivie par 3-5 vers orienté de sorte qu&#39;ils sont couchés sur leurs côtés gauche. Une lamelle de verre est appliquée et ensuite la vaseline est utilisé pour sceller la lamelle et d&#39;empêcher l&#39;évaporation de l&#39;échantillon.

Laser axotomie suivie par imagerie time-lapse est une manière sensible pour doser les effets des mutations dans<em&gt; C. elegans</em&gt; Sur la régénération axonale. Une haute qualité, mais peu coûteux, le système d&#39;ablation laser peut facilement être ajouté à la plupart des microscopes. Laps de temps d&#39;imagerie plus de 15 heures nécessite une immobilisation attention du ver.

Construire un petit budget laser axotomie système pour étudier la régénération des axones dans le C. elegans</em

L'axotomie laser suivie d'une microscopie en accéléré constitue un essai sensible pour l'étude des phénotypes de régénération axonale chez C. elegans1. La principale difficulté de cet essai...

L'objectif général de cette procédure est de montrer comment assembler et aligner un système d'ablation laser pour l'étude de la régénération des axones chez les CL gans. Cela s'accomplit tout d'abord en montant sur une platine optique un miroir tournant, une lame à demi-onde, un polariseur, un miroir de périscope et un rail avec miroir. L'étape suivante de la procédure consiste à aligner le faisceau laser avec le faisceau sortant provenant de l'objectif condenseur du microscope.Ensuite, l'objectif agrandisseur du faisceau laser est monté, aligné et positionné afin de centrer le faisceau laser et de le rendre non divergent. La dernière étape de la procédure consiste à rendre le point d'ablation laser congruent avec le foyer de l'image en effectuant des réglages fins. En définitive, il est possible de sectionner précisément des axones d'une demi-micron avec un dommage tissulaire collatéral minimal à l'aide d'un faisceau laser limité par la diffraction, lorsque l'alignement NC XY est imparfait.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme les lasers femtosecondes, est qu'elle est relativement peu coûteuse, à 15 000. Elle nécessite peu d'entretien et permet une coupe très précise des axones. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la régénération des axones chez la méduse *Aurelia*, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, tels que les mouches, le poisson zèbre, la souris, le système nerveux périphérique et les cellules en culture in vitro.Fondamentalement, toute cellule située à moins de 30 à 50 micromètres de la surface. Commencez par positionner les composants sur la platine d'essai, puis fixez à l'aide de vis le support du périscope laser et les supports surélevés du rail. Ce système utilise un laser de classe 3B, qui peut facilement endommager les yeux ; veuillez donc prendre très au sérieux les consignes de sécurité relatives au laser.Parlez à quelqu’un de votre département de physique local de la manière de manipuler en toute sécurité les lasers à faisceau libre. Pendant tout le processus d’alignement, réglez toujours le laser à la puissance la plus basse. Lorsque vous regardez à travers les oculaires, assurez-vous que le laser est obturé mécaniquement et qu’il est éteint.Maintenant, positionnez d'abord le microscope, en l'alignant sur l'axe du rail. Deuxièmement, alignez-le avec le faisceau lumineux transmis provenant de l'objectif condenseur du microscope. Troisièmement, alignez les deux extrémités du rail avec le faisceau du condenseur à l'aide d'un diaphragme réglable ou d'une lentille fixée au rail.Utilisez un niveau et des cales de laboratoire pour ajuster la hauteur du rail avant de poursuivre. Assurez-vous que les deux extrémités du rail sont alignées. Vérifiez maintenant que le faisceau laser traverse la glande, le polariseur de Thompson et la lame demi-onde, sans toucher leurs bords en rotation.La plaque à demi-hauteur ajustera la puissance du laser une fois tous les composants fixés sur la platine optique. Allumez le laser, réglez la fréquence d'impulsion sur 100 en mode continu et réduisez la puissance au minimum à l'aide de la plaque à demi-hauteur. Utilisez un papier autocollant ou du papier pour lentilles afin de visualiser le faisceau laser.À présent, dirigez le faisceau laser depuis la platine optique. Réglez et fixez successivement les miroirs montés de manière cinématique, en partant du laser, afin de guider le faisceau jusqu’au miroir fixé à l’extrémité du rail surélevé. Une fois terminé, le faisceau laser doit être approximativement aligné sur le centre des miroirs, et les miroirs doivent être orientés à environ 45 degrés par rapport à l’axe du faisceau laser, avant d’aligner ce dernier avec le faisceau lumineux transmis du microscope.Retirez ou ouvrez tous les filtres ND et diaphragmes présents dans le module intermédiaire. Nous allons maintenant commencer l'étape la plus critique, qui consiste à réaliser une coupe précise des axones sans dommages collatéraux excessifs. Nous allons aligner précisément le laser selon les axes x, y et z, avec la puissance laser la plus faible possible afin d'obtenir le plus petit spot d'ablation.Le faisceau laser et les faisceaux lumineux transmis peuvent être observés simultanément sur du papier. Placez le papier près de l'oculaire du microscope pour commencer. Procédez maintenant à l'alignement du laser à l'aide des réglages grossiers du miroir situé en haut du périscope et de celui situé à l'extrémité du rail.Placer une feuille de papier entre la lentille condensatrice alignée et la tourelle d'objectifs ouverte. Continuer à utiliser les réglages fins du miroir sur le rail pour aligner le faisceau laser au centre du faisceau lumineux transmis plus large. Fixer maintenant le microscope en place à l'aide de pinces.Des étapes supplémentaires concernant l'évaluation de l'alignement du laser sont disponibles dans le manuscrit écrit. Des dilatateurs de faisceau galiléens doubles doivent être installés afin d'élargir le faisceau laser de 300 microns de 33 fois pour remplir l'ouverture arrière de l'objectif de 10 millimètres. Commencez par monter les quatre lentilles sur des supports.Ensuite, fixez les lentilles sur le rail de manière à ce qu'elles soient toutes alignées sur le même axe optique et parfaitement orthogonales au faisceau laser. Allumez le laser et réglez-le à la puissance minimale et en mode continu. Ajustez grossièrement l'alignement du faisceau à travers chaque lentille.Utilisez du papier pour visualiser le faisceau. Éteignez maintenant le laser. Appliquez un obturateur de sécurité sur le laser et retirez le microscope du trajet du faisceau laser.Réallumez le laser et visualisez-le sur un mur voisin. Utilisez le réglage fin des lentilles pour élargir le faisceau. Ajustez ensuite les deux derniers miroirs montés cinématiquement afin d’aligner le faisceau en un cercle de luminosité uniforme à la position estimée de l’ouverture arrière de l’objectif.Observer la taille et l'uniformité du faisceau sur du papier. Ensuite, régler le faisceau à une convergence nulle en notant comment la taille du faisceau change lorsque l'on éloigne le papier de la lentille. Éteindre le laser et fermer l'obturateur mécanique.Faites glisser le microscope dans le trajet du faisceau laser à l'aide des pinces fixes pour définir l'alignement correct. Remettez en place les pinces du côté libre du microscope, mais ne les serrez pas complètement. Allumez maintenant le laser.Retirer le volet de sécurité et faire tourner le tourelle d'objectif vers une position ouverte à l'aide d'une feuille de papier sur la platine ; un faisceau laser élargi et uniforme, centré sur le faisceau lumineux transmis provenant du condenseur, doit être visible. Si le faisceau n'est pas centré, ajuster le centrage en desserrant les pinces du microscope et en déplaçant délicatement le microscope. Ensuite, refermer le volet de sécurité et régler le laser en mode déclenchement.Placer l'objectif de 60 fois en position. Observer maintenant l'image des rayures de surface sur une lame cible. Retirer le volet de sécurité, déclencher le laser d'ablation et régler la puissance du laser pour obtenir le spot d'ablation minimal.La tache doit être circulaire et située à cinq à 10 micromètres du centre de l'image, c'est-à-dire du centre de la tache d'ablation. En utilisant les réglages fins du miroir de rail monté cinématiquement pour maintenir la tache centrée et le profil du faisceau uniforme, il sera nécessaire de régler de manière itérative le miroir monté sur le rail et le miroir supérieur du périscope. Évaluer la mise au point Z du laser en déplaçant systématiquement la mise au point vers le haut et vers le bas par paliers d'un micron, en déclenchant le laser d'ablation à chaque étape.Si le faisceau est correctement agrandi, aligné et que sa convergence est correctement ajustée, alors il devrait ablater de manière maximale au foyer de l’image et faiblement, voire pas du tout, à un micron au-dessus ou au-dessous du foyer. Si le point d’ablation maximal se trouve au-dessus ou au-dessous du foyer de l’image, effectuez les réglages finaux du focus Z du faisceau élargi en déplaçant la lentille L3 du télescope galiléen jusqu’à ce que l’ablation laser coïncide avec le foyer de l’image. Des nématodes ont été montés sur une lame personnalisée et des axones ont été ablatés à l’aide du système construit. La laser exo somie et l’imagerie en enregistrement temporel de la régénération des axones étaient très robustes.À l’aide d’un dispositif motorisé, il était possible de couper et d’imager de manière routinière et précise cinq axones chez cinq animaux différents sur une même lame. Le temps d’imagerie des axones constituait le facteur limitant.Environ 10 % des expériences ont produit des films en prise de vue instantanée de haute qualité. Les expériences restantes ont toutes fourni des données satisfaisantes, mais étaient moins esthétiques en raison de légers mouvements saccadés du ver, qui commençaient généralement après cinq à huit heures d'immobilisation. Lors de la réalisation de cette procédure, il est toujours essentiel d'évaluer précisément l'alignement du laser selon les axes x, y et Z.Le problème le plus fréquent que rencontrent les personnes tentant de sectionner un axone est les dommages collatéraux ou l'incapacité totale de sectioner les axones, et ceci est presque toujours dû à un laser mal aligné. Ce système d'ablation laser et cette technique de visualisation de la régénération axonale chez C. elegans vous permettront d'analyser systématiquement l'effet de toute mutation génétique sur la régénération axonale. NCL C. elegans.

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