Construire un petit budget laser axotomie système pour étudier la régénération des axones dans le C. elegans

L'objectif général de cette procédure est de montrer comment monter et aligner un système d'ablation laser pour l'étude de la régénération des axones chez les CL gans. Cela est réalisé en fixant d'abord un laser, une glande, un polariseur Thompson, une lame demi-onde, un miroir de renvoi, un rail de périscope et un miroir de rail sur une platine optique. L'étape suivante de la procédure consiste à aligner le faisceau laser avec le faisceau sortant de la lentille condenseur du microscope.

Ensuite, l'objectif agrandisseur du faisceau laser est monté, aligné et positionné afin de centrer le faisceau laser et de le rendre non divergent. La dernière étape de la procédure consiste à rendre le point d'ablation laser congruent avec le foyer de l'image en effectuant des réglages fins. En définitive, il est possible de sectionner précisément des axones d'une demi-micron avec des dommages minimes aux tissus adjacents à l'aide d'un faisceau laser limité par la diffraction, lorsque l'alignement NC XY est imparfait.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme les lasers femtosecondes, est qu'elle est relativement peu coûteuse, à 15 000. Elle nécessite peu d'entretien et permet une coupe très précise des axones. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la régénération des axones chez *C. elegans*, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, tels que les mouches, le poisson zèbre, la souris, le système nerveux périphérique et les cellules en culture.

Fondamentalement, toute cellule située à 30 à 50 micromètres de la surface. Commencez par positionner les composants sur la platine d'essai, puis fixez par boulonnage le support du périscope laser et les supports surélevés du rail. Ce système utilise un laser de classe 3B, capable de provoquer facilement des lésions oculaires ; veuillez donc prendre très au sérieux la sécurité liée à l'utilisation du laser.

Parlez à quelqu’un de votre département de physique local pour savoir comment manipuler en toute sécurité les lasers à faisceau libre. Pendant tout le processus d’alignement, réglez toujours le laser à la puissance la plus basse. Lorsque vous regardez à travers les oculaires, assurez-vous que le laser est mécaniquement obturé et que le laser est éteint.

Maintenant, positionnez d'abord le microscope en l'alignant sur l'axe du rail. Deuxièmement, alignez-le avec le faisceau lumineux transmis provenant de l'objectif condenseur du microscope. Troisièmement, alignez les deux extrémités du rail avec le faisceau du condenseur à l'aide d'un diaphragme réglable ou d'une lentille fixée au rail.

Utilisez un niveau et des cales de laboratoire pour ajuster la hauteur du rail avant de poursuivre. Assurez-vous que les deux extrémités du rail sont alignées. Vérifiez maintenant que le faisceau laser traverse la glande, le polariseur de Thompson et la lame demi-onde, sans toucher leurs bords en rotation.

La lame demi-réfléchissante réglera la puissance du laser une fois tous les composants fixés sur la platine optique. Allumez le laser, réglez la fréquence d'impulsion à 100 en mode continu et réduisez la puissance au minimum à l'aide de la lame demi-réfléchissante. Utilisez un petit morceau de papier ou du papier pour lentilles afin de visualiser le faisceau laser.

À présent, dirigez le faisceau laser depuis la platine optique. Réglez et fixez successivement les miroirs montés de manière cinématique, en partant du laser, afin de guider le faisceau jusqu’au miroir fixé à l’extrémité du rail surélevé. Une fois terminé, le faisceau laser doit être approximativement aligné sur le centre des miroirs, et les miroirs doivent être orientés à environ 45 degrés par rapport à l’axe du faisceau laser, avant d’aligner ce dernier avec le faisceau lumineux transmis du microscope.

Retirez ou ouvrez tous les filtres neutres (ND) et diaphragmes du module intermédiaire. Nous allons maintenant commencer l'étape la plus critique afin d'obtenir une coupe précise des axones sans dommages collatéraux excessifs. Nous allons aligner précisément le laser selon les axes x, y et z, à la puissance laser la plus faible, afin d'obtenir un spot d'ablation minimal.

Le faisceau laser et les faisceaux lumineux transmis peuvent être observés simultanément sur une feuille de papier. Placez la feuille près de l'oculaire du microscope pour commencer. Procédez maintenant à l'alignement du laser à l'aide des réglages grossiers du miroir situé en haut du périscope et de celui fixé à l'extrémité du rail.

Placer une feuille de papier entre la lentille condensatrice alignée et la tourelle d'objectifs ouverte. Continuer à utiliser les réglages fins du miroir sur le rail pour aligner le faisceau laser au centre du faisceau lumineux transmis plus large. Fixer maintenant le microscope en place à l'aide de pinces.

Des étapes supplémentaires concernant l'évaluation de l'alignement du laser sont disponibles dans le manuscrit écrit. Des dilatateurs de faisceau galiléens doubles doivent être installés afin d'élargir le faisceau laser de 300 microns de 33 fois pour remplir l'ouverture arrière de l'objectif de 10 millimètres. Commencez par monter les quatre lentilles sur des porte-lentilles.

Ensuite, fixez les lentilles sur le rail de manière à ce qu'elles soient toutes alignées sur le même axe optique et parfaitement orthogonales au faisceau laser. Allumez le laser et réglez-le à puissance minimale et en mode continu. Ajustez grossièrement l'alignement du faisceau à travers chaque lentille.

Utilisez du papier pour visualiser le faisceau. Éteignez maintenant le laser. Appliquez un obturateur de sécurité sur le laser et retirez le microscope du trajet du faisceau laser.

Réallumez le laser et visualisez-le sur un mur voisin. Utilisez le réglage fin des lentilles pour élargir le faisceau. Ajustez ensuite les deux derniers miroirs montés cinématiquement afin d'aligner le faisceau en un cercle de luminosité uniforme à la position estimée de l'ouverture arrière de l'objectif.

Observez la taille et l'uniformité du faisceau sur le papier. Réglez ensuite le faisceau à une convergence nulle en notant comment la taille du faisceau change lorsque le papier est éloigné de la lentille. Éteignez le laser et activez l'obturateur mécanique.

Faites glisser le microscope dans le trajet du faisceau laser à l'aide des pinces fixes pour définir l'alignement correct. Remettez les pinces sur le côté libre du microscope, mais ne les serrez pas complètement. Allumez maintenant le laser.

Retirer le volet de sécurité et faire tourner le touret d'objectifs vers une position ouverte à l'aide d'une feuille de papier sur la platine ; un faisceau laser élargi et uniforme, centré sur le faisceau lumineux transmis provenant du condenseur, doit être visible. Si le faisceau n'est pas centré, ajuster le centrage en desserrant les pinces du microscope et en déplaçant délicatement le microscope. Réengager ensuite le volet de sécurité et régler le laser en mode déclenchement.

Placer l'objectif de 60 fois en position. Observer maintenant les rayures de surface sur une lame cible. Retirer le volet de sécurité, déclencher le laser d'ablation et régler la puissance du laser pour obtenir la taille minimale du spot d'ablation.

La tache doit être circulaire et située à cinq à 10 microns du centre de l'image, c'est-à-dire du point d'ablation. En utilisant les réglages fins du miroir de rail monté cinématiquement afin de maintenir la tache centrée et le profil du faisceau uniforme, il sera nécessaire de régler de manière itérative le miroir monté sur le rail et le miroir supérieur du périscope. Évaluez la mise au point axiale (Z) du laser en déplaçant systématiquement la mise au point vers le haut et vers le bas par incréments d'un micron, en déclenchant le laser d'ablation à chaque étape.

Si le faisceau est correctement élargi et aligné, avec une convergence correctement ajustée, alors il devrait ablater de manière maximale au foyer de l'image et faiblement, voire pas du tout, à un micron au-dessus ou au-dessous du foyer. Si le point d'ablation maximal se situe au-dessus ou au-dessous du foyer de l'image, effectuez les réglages finaux du foyer Z du faisceau élargi en déplaçant la lentille L3 du télescope galiléen jusqu'à ce que l'ablation laser coïncide avec le foyer de l'image. Des nématodes ont été montés sur une lame personnalisée et des axones ont été ablatés à l'aide du système construit. L'ablation laser et l'imagerie en prise de vue instantanée de la régénération axonale étaient très robustes.

À l’aide d’un plateau motorisé, il était possible de couper et d’imager de manière routinière et précise cinq axones chez cinq animaux différents sur une seule lame. Le temps d’imagerie des axones constituait le facteur limitant.

Environ 10 % des expériences ont produit des films enregistrés en lapso-temporel de haute qualité. Les expériences restantes ont toutes fourni de bonnes données, mais étaient moins esthétiques en raison de légers mouvements saccadés du ver, qui commençaient généralement après cinq à huit heures d'immobilisation. Lors de la réalisation de cette procédure, il est toujours essentiel d'évaluer précisément l'alignement du laser selon les axes x, y et z.

Le problème le plus fréquent que rencontrent les personnes tentant de sectionner un axone est les dommages collatéraux ou l'incapacité totale à couper les axones, ce qui est presque toujours dû à un laser mal aligné. Ce système d'ablation laser et cette technique de visualisation de la régénération axonale chez C. elegans vous permettront d'analyser systématiquement l'effet de toute mutation génétique sur la régénération axonale. NCL Agains.