Construire un petit budget laser axotomie système pour étudier la régénération des axones dans le C. elegans

L’objectif général de cette procédure est de montrer comment assembler et aligner un système d’ablation laser pour étudier la régénération axonale dans les CL gans. Ceci est accompli en montant d’abord un presse-étoupe laser, un polariseur Thompson, une plaque demi-onde, un miroir tournant, un rail de périscope et un miroir de rail sur une planche à pain. L’étape suivante de la procédure consiste à aligner le faisceau laser sur le faisceau sortant de la lentille du condenseur du microscope.

Ensuite, la lentille d’expansion du faisceau laser est montée, alignée et positionnée pour centrer le faisceau laser et le rendre à zéro divergent. La dernière étape de la procédure consiste à faire en sorte que le point d’ablation laser corresponde à la mise au point de l’image en effectuant des ajustements fins. En fin de compte, il est possible de couper avec précision des axones d’un demi-micron avec des dommages tissulaires collatéraux minimes en utilisant le faisceau laser à diffraction limitée lorsqu’il s’agit d’un alignement XY NC imparfait.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme les lasers femtosecondes, est qu’elle est relativement peu coûteuse (15 000). Il est relativement sans entretien et permet une coupe axonale très précise. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la régénération de l’axone de l’éléphant de mer, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que les mouches, la souris poisson-zèbre, le système nerveux périphérique et les cellules in vitro.

En gros, n’importe quelle cellule qui se trouve à moins de 30 à 50 micromètres de la surface. Commencez par positionner les composants sur la planche d’essai et boulonnez le poteau du périscope laser et les supports de rail surélevés. Ce système utilise un laser de classe trois B qui peut facilement endommager vos yeux, veuillez donc prendre au sérieux la sécurité des lasers.

Discutez avec quelqu’un de votre département de physique local sur la façon de travailler avec des lasers à faisceau libre en toute sécurité. Toujours pendant le processus d’alignement, réglez le laser à la puissance la plus basse. Lorsque vous regardez à travers les oculaires, assurez-vous que le laser est à obturation mécanique et que le laser est éteint.

Maintenant, positionnez d’abord le microscope, alignez-le avec l’axe du rail. Deuxièmement, alignez-le avec le faisceau de lumière transmise de la lentille du condensateur du microscope. Troisièmement, alignez les deux extrémités du rail sur le faisceau du condenseur à l’aide d’une ouverture réglable ou d’une lentille fixée au rail.

Utilisez un niveau et des vérins de laboratoire pour ajuster la hauteur du rail avant de continuer. Assurez-vous que les deux extrémités du rail sont alignées. Maintenant, assurez-vous que le faisceau laser passe à travers le presse-étoupe, le polariseur Thompson et la plaque à mi-chemin, et qu’il ne frappe pas leurs bords en rotation.

La plaque à mi-chemin ajustera la puissance du laser avec tous les composants fixés à la plaque d’essai. Allumez le laser, réglez la fréquence d’impulsion sur 100 en mode continu et réduisez la puissance au minimum à l’aide de la plaque à mi-chemin. Utilisez un post-it ou du papier à lentille pour visualiser le faisceau laser.

Maintenant, pour faire remonter le faisceau laser de la planche à pain. Ajustez et fixez les miroirs montés cinématiquement en séquence à partir du laser pour amener le faisceau jusqu’au miroir monté à l’extrémité du rail surélevé. Une fois terminé, le faisceau laser doit être aligné à peu près au centre des miroirs, et les miroirs doivent être orientés à environ 45 degrés par rapport à l’axe du faisceau laser avant d’aligner le faisceau laser avec le faisceau de lumière transmise du microscope.

Retirez ou ouvrez les filtres ND et les ouvertures dans le module intermédiaire. Nous commençons maintenant l’étape la plus critique pour donner une coupe précise des axones sans dommages collatéraux excessifs. Nous allons aligner le laser avec précision sur les axes x, y et z à la puissance laser la plus faible pour donner le plus petit point d’ablation.

Le laser et les faisceaux lumineux transmis peuvent être vus simultanément sur le papier. Placez le papier près du port du microscope pour commencer. Commencez maintenant à aligner le laser à l’aide des réglages de trajectoire sur le miroir au-dessus du périscope et le miroir à l’extrémité du rail.

Placez un papier entre la lentille du condenseur alignée et la tourelle d’objectif ouverte. Continuez à utiliser les réglages fins sur le miroir du rail pour aligner le faisceau laser au centre du faisceau de lumière transmise plus grand. Maintenant, fixez le microscope en place avec des pinces.

Des étapes supplémentaires pour évaluer l’alignement du laser peuvent être trouvées dans le manuscrit écrit. Des extenseurs de faisceau galiléen doubles doivent être installés pour étendre le faisceau laser de 300 microns 33 fois afin de remplir l’ouverture arrière de l’objectif de 10 millimètres. Commencez par monter les quatre objectifs sur des supports.

Fixez ensuite les lentilles au rail de manière à ce qu’elles soient toutes dans le même axe optique et exactement orthogonales au faisceau laser. Allumez le laser et réglez-le à la puissance minimale et en mode continu. Ajustez grossièrement l’alignement du faisceau à travers chaque lentille.

Utilisez du papier pour voir le faisceau. Éteignez maintenant le laser. Appliquez un obturateur de sécurité sur le laser et retirez le microscope de la trajectoire du faisceau laser.

Rallumez le laser et visualisez-le contre un mur à proximité. Utilisez le réglage fin des lentilles pour élargir le faisceau. Ajustez ensuite les deux derniers miroirs montés cinématiquement pour aligner le faisceau dans un cercle de luminosité uniforme à la position estimée de l’ouverture arrière de l’objectif.

Visualisez la taille et l’uniformité du faisceau par rapport au papier. Ajustez ensuite le faisceau à la convergence zéro en notant comment la taille du faisceau change à mesure que le papier s’éloigne de l’objectif. Éteignez le laser et engagez l’obturateur mécanique.

Faites glisser le microscope dans la trajectoire du faisceau laser à l’aide des pinces fixes pour définir l’alignement correct. Replacez les pinces du côté libre du microscope, mais ne les serrez pas. Allumez maintenant le laser.

Retirez l’obturateur de sécurité et tournez la tourelle de l’objectif en position ouverte à l’aide de papier sur la platine et un faisceau laser étendu et uniforme centré sur le faisceau de lumière transmise par le condenseur doit être visible. S’ils ne sont pas centrés, centrez les faisceaux en desserrant les pinces du microscope et en poussant soigneusement le microscope. Enclenchez maintenant l’obturateur de sécurité et réglez le laser en mode de déclenchement.

Tournez l’objectif 60 fois en place. Maintenant, l’image de la surface se raye sur une diapositive cible. Retirez l’obturateur de sécurité, déclenchez le laser d’ablation et ajustez la puissance du laser pour le point d’ablation minimum.

Le point doit être circulaire et à moins de cinq à 10 microns du centre de l’image, au centre, du point d’ablation. En utilisant les réglages fins du miroir de rail monté cinématiquement pour maintenir le point centré et le profil du faisceau uniforme, il sera nécessaire d’ajuster de manière itérative le miroir monté sur rail et le miroir de périscope supérieur. Évaluez la focale Z du laser en déplaçant systématiquement la focale vers le haut et vers le bas par incréments d’un micron, déclenchez le laser d’ablation à chaque étape.

Si le faisceau est correctement élargi et aligné et avec une convergence correctement ajustée, il devrait s’ablater au maximum à la mise au point de l’image et être faible ou pas du tout, un micron au-dessus ou en dessous de la mise au point. Si le point d’ablation maximal se trouve au-dessus ou en dessous de la mise au point de l’image, effectuez les derniers ajustements de la mise au point Z du faisceau élargi en déplaçant la lentille L trois du télescope galiléen jusqu’à ce que l’ablation laser soit congruente avec la mise au point de l’image. Les nématodes ont été montés sur une lame personnalisée et les axones ont été ablatés à l’aide du système construit L’exosomy laser et l’imagerie en accéléré de la régénération axonale étaient très robustes.

À l’aide d’une platine motorisée, il a été possible de découper et d’imager régulièrement et précisément cinq axones chez cinq animaux différents. Sur une seule diapositive. Le temps d’imagerie des axones était le facteur limitant.

Environ 10 % des expériences ont produit des films en accéléré de haute qualité. Les expériences restantes ont toutes fourni de bonnes données, mais étaient moins attrayantes sur le plan esthétique en raison de petits mouvements de tremblement du ver qui commençaient généralement après cinq à huit heures d’immobilisation. Lors de cette procédure, il est toujours important d’évaluer avec précision l’alignement du laser sur les axes x, y et z.

Le problème le plus courant que les gens rencontrent en essayant de couper l’axone est un dommage collatéral ou l’incapacité totale de couper les axones, et cela est presque toujours dû à un laser mal aligné. Ce système d’ablation au laser et cette technique de visualisation de la régénération axonale dans le sud vous permettront de tester régulièrement l’effet de toute mutation génétique sur la régénération axonale. NCL contre.