Name: Patch-clamp mesures de capacité et de Ca 2 + Imagerie à terminaisons nerveuses rétiniennes unique en tranches (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Découvrez la préparation de tranches rétiniennes en agar pour l'étude des microcircuits des terminaisons nerveuses présynaptiques des cellules bipolaires. Cette méthode permet des enregistrements patch-clamp directs et l'analyse des synapses en ruban.

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Nous remercions le Dr Fred Rieke pour son explication sorte de l&#39;agar-embedded préparation de tranches rétine lorsque nous avons commencé en utilisant le protocole dans notre laboratoire. Nous remercions aussi Lori Vaskalis pour l&#39;illustration de schéma aperçu, et les Drs. Veeramuthu Balakrishnan et Soyoun Cho pour leurs précieux commentaires sur le texte et la vidéo. Ce travail a été soutenu par une subvention du NIH RO1 IEN-, et a également été partiellement financé par une subvention Korea Research Foundation financée par le gouvernement coréen [KRF-2008-357-E00032].

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</ol>

Nous n&#39;avons pas d&#39;intérêts opposés à divulguer.

Une étape cruciale et difficile dans notre protocole est le transfert de la pièce de la rétine dans la solution d&#39;agar (protocole 3.4). Il est nécessaire de retirer délicatement le corps vitré et la solution tranche résiduelle de la pièce de la rétine et le transférer sans distorsion ou de flexion. Afin d&#39;accomplir cela, nous utilisons une petite spatule (21-401-25B, Fisherbrand) avec une pointe recourbée pour former une angle de 90 °, avec une pince la pointe inclinée (11251-35, Outils Fine Sci...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Basse température gélifiant agar </td><td> Sigma </td><td> A0701 </td><td> Agarose de type VII-A </td></tr><tr><td> Patch pipette </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> 1B150F-4 </td><td> Paroi épaisse (1,5 mm de diamètre extérieur) en verre borosilicate </td></tr><tr><td> Extracteur vertical </td><td> Narishige </td><td> PP830 </td><td></td></tr><tr><td> Cire dentaire </td><td> Cavex </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ciseaux de printemps </td><td> Outils Fine Science </td><td> 15003-08 </td><td></td></tr><tr><td> Coudée à 45 ° pince à pointe fine </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11251-35 </td><td></td></tr><tr><td> Lame de rasoir </td><td> Personna </td><td></td><td> À double tranchant, nettoyés avec de l&#39;éthanol 70% et H 2 O </td></tr><tr><td> Tube cylindrique </td><td> Fisherbrand </td><td> 03 à 338-1B </td><td> Flacons en polyéthylène de 2,5 ml </td></tr><tr><td> Hyaluronidase </td><td> Sigma </td><td> H6254 </td><td></td></tr><tr><td> Vibratome trancheuse </td><td> Leica </td><td> VT1000S ou VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> Microscope droit </td><td> Olympus </td><td> BX51WI </td><td></td></tr><tr><td> 60x eau objectif à immersion </td><td> Olympus </td><td> LUMPlanFl </td><td> NA 0.90 </td></tr><tr><td> La caméra CCD </td><td> Sony </td><td> XC-75 </td><td></td></tr><tr><td> Caméra de contrôleur </td><td> Hamamatsu </td><td> C2400 </td><td></td></tr><tr><td> Moniteur &lt;/ Td&gt; <td> Sony </td><td></td><td> 13 &quot;moniteur noir et blanc </td></tr><tr><td> Filtre seringue </td><td> Nalgene </td><td></td><td> 0,2 um </td></tr><tr><td> Micromanipulateur </td><td> Instrument Sutter </td><td> MPC-200 </td><td></td></tr><tr><td> Amplificateur lock-in </td><td> HEKA </td><td></td><td> EPC-9/10 amplificateurs ont un logiciel d&#39;émulation </td></tr><tr><td> Spinning microscope confocal à disque laser </td><td> Yokogawa </td><td> CSU-X1 </td><td> Imagerie des cellules vivantes, après l&#39;enregistrement patch clamp de cellules entières </td></tr><tr><td> Slidebook logiciels </td><td> Intelligent Imaging Instruments (3i) </td><td></td><td> Imagerie d&#39;acquisition de données et d&#39;analyse </td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> Solution tampon de phosphate </td><td> IGBCO </td><td> 70013 </td><td></td></tr><tr><td> Glisser Superfrost </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td> Lame de verre </td></tr><tr><td> Des agents anti-décoloration </td><td> Biomeda corp. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Confocale à balayage laser Microscope </td><td> Carl Zeiss </td><td> LSM 710 </td><td> L&#39;imagerie de tissus fixés </td></tr><tr><td> Spatule </td><td> Fisherbrand </td><td> 21 à 401-25B </td><td></td></tr><tr><td> Manuel verticales trancheuse </td><td> Narishige </td><td> ST-20 </td><td></td></tr><tr><td> Oregon Green 488 BAPTA-1 </td><td> Invitrogen </td><td> O-6806 </td><td> Ca 2 + colorant sensible fluorescents </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 555 hydrazide </td><td> Invitrogen </td><td> Un 20501MP- </td><td> Colorant fluorescent </td></tr></tbody></table>

patch-clamp mesures de capacité et de ca 2 + imagerie à terminaisons nerveuses rétiniennes unique en tranches

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Les stimuli visuels sont détectés et transporté sur une large plage dynamique des intensités de lumière et les variations de fréquence par des neurones spécialisés dans la rétine des vertébrés. Deux classes de neurones rétiniens, les photorécepteurs et les cellules bipolaires, accomplir ceci en utilisant un ruban de type zones actives, qui permettent la libération des neurotransmetteurs soutenue et à haut débit sur de longues périodes. SUR-type mixte bipolaire cellule (Mo) de terminaux dans la rétine des poissons rouges, qui dépolarise à des stimuli lumineux et recevoir tige mixtes et l&#39;entrée des photorécepteurs cônes, sont appropriés pour l&#39;étude de ruban de type synapses tant en raison de leur grande taille (~ 10-12 um de diamètre) et à leurs nombreuses latéraux et réciproque connexions synaptiques avec les dendrites des cellules amacrines. L&#39;accès direct aux terminaux Mb cellule bipolaire en tranches le poisson rouge de la rétine avec la technique de patch-clamp permet la mesure de Ca 2 + présynaptiques courants, les changements de capacitance de membrane, et la rétro-inhibition réciproque synaptique médiée par le GABA &lt;sub&gt; A et récepteurs GABA C exprimée sur les bornes. Présynaptiques mesures capacitance membranaire de l&#39;exocytose permettent d&#39;étudier la plasticité à court terme de la libération des neurotransmetteurs excitateurs 14,15. De plus, la plasticité à court terme et à long terme de la libération du neurotransmetteur inhibiteur des cellules amacrines peut aussi être étudiée par les enregistrements de la rétro-inhibition réciproque arrivant au terminal Mb 21. Plus de courtes périodes de temps (par exemple, ~ 10 s), la rétro-inhibition GABAergique réciproque de cellules amacrines subit double choc de dépression à travers l&#39;épuisement des vésicules piscine GABA 11. La dynamique de microcircuits synaptique rétinienne dans la couche plexiforme interne de la rétine peut donc être étudiées directement. La technique du cerveau-tranche a été introduit plus de 40 ans mais est encore très utile pour les enquêtes sur les propriétés électriques des neurones, à la fois au corps cellulaire unique, simple ou dendrite axone, et microcircuit niveau synaptique 19. Les tissus qui sont trop petits pour être collé directement sur ​​la chambre de tranchage sont souvent les premiers embarqués dans l&#39;agar (ou placé sur un papier filtre), puis en tranches 20, 23, 18, ​​9. Dans cette vidéo, nous employons la technique agar pré-enrobage en utilisant la rétine des poissons rouges. Certaines des bornes géantes cellules bipolaires dans nos tranches de la rétine poissons rouges sont axotomisés (axone-cut) pendant la procédure de découpage. Cela nous permet d&#39;isoler seule terminaison nerveuse présynaptique entrées, parce que l&#39;enregistrement à partir de terminaux axotomisés exclut les signaux à partir du compartiment soma-dendritique. Alternativement, on peut également enregistrer à partir intactes les cellules bipolaires Mb, en enregistrant à partir de terminaux attachés à axones qui n&#39;ont pas été coupés lors de la procédure de trancher. Globalement, l&#39;utilisation de ce protocole expérimental d&#39;aide dans les études de la physiologie synaptique rétinienne, microcircuit analyse fonctionnelle, et la transmission synaptique dans les synapses de ruban.

Nous décrivons ici un protocole pour la préparation de l&#39;agar-intégrés tranches rétiniennes qui sont appropriés pour l&#39;électrophysiologie et d&#39;imagerie de Ca2 +. Cette méthode permet d&#39;étudier un ruban de type synapses dans la rétine à l&#39;aide de microcircuits directe de patch-clamp des enregistrements de simples terminaisons nerveuses présynaptiques.

Patch-clamp mesures de capacité et de Ca 2 + Imagerie à terminaisons nerveuses rétiniennes unique en tranches

Les stimuli visuels sont détectés et transmis sur une large gamme dynamique d'intensités lumineuses et de changements de fréquence par des neurones spécialisés chez le vertébré...

L'objectif général de cette procédure est de préparer des tranches de rétine incluses dans de l'agar afin d'étudier les microcircuits situés dans les terminaisons nerveuses présynaptiques des cellules bipolaires. Cette opération est réalisée en prélevant d'abord la rétine d'un œil de poisson rouge adapté à l'obscurité, puis en découpant un petit morceau rectangulaire de cette rétine. Ce fragment rétinien est ensuite immergé dans une solution d'agar transparente à point de fusion bas, qui est ensuite solidifiée dans une solution de coupe agréablement froide.L'étape suivante consiste à découper le bloc d'agar solide contenant le fragment rectangulaire de rétine à l'aide d'un vibrotome. L'étape finale consiste à visualiser, identifier et réaliser le patch. Bloquer un terminal nerveux de cellule bipolaire.En définitive, les résultats montrent le courant calcique pré-synaptique et l'exocytose synaptique physique, mesurés par la capacitance membranaire, provenant de terminaisons de cellules bipolaires atomisées et intactes. Bonjour, je m'appelle Han Kim. Je suis post-doctorant au sein du PCO du laboratoire de l'Institut Burham.Aujourd'hui, je vais présenter la préparation de tranches int

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Méthodes pour les enregistrements patch clamp Capacité du calice

Nous décrivons ici une procédure pour générer adaptés à l'obscurité des tranches de la rétine de souris pour les enregistrements électrophysiologiques.

Enregistrements Patch Clamp à partir de neurones rétiniens souris dans une préparation adaptés à l&#39;obscurité Slice

Cette vidéo présente une technique de patch-clamp à cellules entières pour l’enregistrement électrophysiologique à partir d’une rétine de souris à montage plat. Une fine pipette en verre avec une électrode est utilisée pour approcher les cellules amacrines en étoile (SAC) dans la rétine. Après avoir formé un joint, une aspiration est appliquée pour rompre la membrane et former la configuration patch-clamp à cellules entières. Enfin, le flux d’ions à travers les récepteurs synaptiques SAC est...

Mise en place d’une pince de patch à cellules entières pour l’enregistrement électrophysiologique à partir d’une rétine de souris à montage plat

Cette vidéo montre la procédure de cartographie des connexions synaptiques en sécurisant une tranche de cerveau, en positionnant des pipettes pour obtenir des configurations de cellules entières et en stimulant les neurones présynaptiques pour enregistrer les réponses postsynaptiques, élucidant ainsi la connectivité neuronale.

Enregistrement par patch clamp apparié des connexions neuronales dans des coupes cérébrales aiguës

Cet article de la vidéo illustre la mise en place, les procédures de patcher les corps cellulaires et la façon de mettre en œuvre les enregistrements de serrage dynamiques à partir de cellules ganglionnaires dans l'ensemble du montage souris rétines. Cette technique permet l'étude de la contribution précise des entrées synaptiques excitateurs et inhibiteurs, et leur importance relative et le calendrier de dopage neuronale.

La mise en œuvre Clamp dynamique avec conductances synaptiques et artificielle chez la souris cellules ganglionnaires rétiniennes

Ce protocole montre comment effectuer des cellules entières d'enregistrement patch clamp sur les neurones de la rétine à partir d'une préparation plate-montage.

Patch Clamp Enregistrement de cellules amacrines Starburst dans un plat de montage Préparation de Deafferentated Souris Retina

Une fois sorti du corps, le tissu neuronal est fortement influencée par les conditions environnementales, ce qui conduit à une dégradation éventuelle du tissu après 6 à 8 heures. En utilisant une méthode d'incubation unique, qui surveille de près et régule l'environnement extracellulaire du tissu, la viabilité des tissus peut être considérablement prolongée pour&gt; 24 h.

L&#39;incubation prolongée de aiguë Neuronal tissus pour électrophysiologie et Calcium-imagerie

Nous présentons une méthode combinant les enregistrements de patch-clamp de la cellule entière et deux photons d’imagerie pour enregistrer des transitoires de Ca2 + en dendrites neuronales dans des tranches de cerveau aiguë.

Imagerie biphotonique Calcium en Dendrites neuronales dans des tranches de cerveau

Ici, nous présentons des protocoles pour la préparation des tranches aigues de cerveau contenant le noyau génuulé latéral et l'investigation électrophysiologique de la fonction de synapses de rétinogeniculate et de corticogeniculate. Ce protocole fournit un moyen efficace d'étudier les synapses avec la probabilité de libération élevée et faible dans les mêmes tranches de cerveau aigus.

Investigations électrophysiologiques de la fonction de synapse de rétinogeniculate et de Corticogeniculate

Les prothèses rétiniennes ont la capacité de générer des perceptions visuelles. Pour faire progresser le développement de nouvelles prothèses, des méthodes ex vivo sont nécessaires pour tester les dispositifs avant l’implantation. Cet article fournit un protocole complet pour étudier l’activité du calcium dans la couche de cellules ganglionnaires de la rétine lorsqu’elle est soumise à une stimulation électrique.

Imagerie calcique dans les rétines à montage plat stimulées électriquement

L’électrophysiologie à pince dynamique peut établir des liens de causalité entre les déficits de décharge neuronale et le dysfonctionnement des canaux ioniques. Nous décrivons des méthodes et des protocoles de clamp dynamique dans les neurones cérébelleux de Purkinje de souris, en notant les ressources utiles et les considérations techniques. Dans une étude représentative, nous ajoutons une conductance sodique modélisée aux neurones de Purkinje Tsc1-/- pour sauver les décharges répétitives.

Méthodes de clamp dynamique pour étudier l’excitabilité neuronale altérée associée à l’autisme

Découvrez la préparation de tranches rétiniennes en agar pour l'étude des microcircuits des terminaisons nerveuses présynaptiques des cellules bipolaires. Cette méthode permet des enregistrements patch-clamp directs et l'analyse des synapses en ruban.

Patch-clamp mesures de capacité et de Ca^{2 +} Imagerie à terminaisons nerveuses rétiniennes unique en tranches

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