Patch-clamp mesures de capacité et de Ca ^{2 +} Imagerie à terminaisons nerveuses rétiniennes unique en tranches

L'objectif général de cette procédure est de préparer des tranches de rétine incluses dans de l'agar afin d'étudier les microcircuits situés dans les terminaisons nerveuses présynaptiques des cellules bipolaires. Cette opération s'effectue en prélevant d'abord la rétine d'un œil de poisson rouge adapté à l'obscurité, puis en découpant un petit morceau rectangulaire de cette rétine. Ce fragment rétinien est ensuite immergé dans une solution d'agar transparente à point de fusion bas, qui est ensuite solidifiée dans une solution de coupe fraîche et froide.

L'étape suivante consiste à découper le bloc d'agar solide contenant le fragment rectangulaire de rétine à l'aide d'un vibrotome. L'étape finale consiste à visualiser, identifier et réaliser le patch. Bloquer électriquement la terminaison nerveuse d'une cellule bipolaire.

En définitive, les résultats montrent le courant calcique pré-synaptique et l'exocytose synaptique physique avec des mesures de la capacité membranaire provenant de terminaisons de cellules bipolaires atomisées et intactes. Bonjour, je m'appelle Han Kim. Je suis postdoctorant au sein du laboratoire PCO de l'Institut Burham.

Aujourd'hui, je vais présenter la préparation de tranches intégrées dans de l'AGA à partir de rétine froide de poisson rouge et démontrer la mesure de la capacité par enregistrement en mode patch clamp sur un seul canal. Pour commencer cette procédure, hémisecter chaque œil d'un poisson rouge en coupant uniformément autour de la partie antérieure de l'œil à l'aide de ciseaux à ressort. Ensuite, placer les cupules oculaires dans une solution de tranchage refroidie sans calcium.

Si nécessaire, retirez la lentille à l'aide de pinces. Ensuite, retirez l'épithélium pigmentaire attaché à la rétine en détachant la rétine de la cupule oculaire à l'aide d'une pince fine à extrémité angulée à 45 degrés. Après cela, sectionnez le nerf optique à l'aide d'une pince fine ou de ciseaux à ressort.

Ensuite, appliquez une aspiration à l’aide d’une pipette à pâtes modifiée ou d’une pipette de transfert à embout large. Pour retirer la rétine, éliminez délicatement le reste de l’épithélium pigmentaire attaché à la rétine. La surface de la rétine propre et saine doit apparaître lisse.

Ensuite, traiter la rétine isolée avec environ 0,03 % d'IDE plus élevé pendant 15 à 30 minutes à température ambiante. Pour éliminer l'humeur vitrée, noter que la procédure doit être réalisée dans une lumière faible. À l'étape suivante, découper un morceau rectangulaire de rétine d'environ deux sur deux millimètres, contenant l'épaisseur totale de la rétine, en retirant les bords incurvés à l'aide d'une lame de rasoir.

Ensuite, transférez le fragment rétinien dans un petit récipient rempli de solution d'agar et tentez de minimiser la quantité de solution autour de la rétine lorsqu'elle est placée dans l'agar liquide. Plongez ensuite directement la rétine avec l'agar dans la solution de coupe glacée afin de solidifier l'agar. Puis, découpez le bloc d'agar solide contenant le fragment rectangulaire de rétine en un cube de un centimètre sur un centimètre sur un centimètre.

Collez le bloc sur la surface de la plaque de découpe dans la chambre de découpe prérefroidie. Ensuite, découpez le bloc en tranches d'une épaisseur de 200 à 250 micromètres dans la solution de découpe glacée. À l'aide d'un vibratome, un total de cinq à dix tranches peut être obtenu, qui restent viables environ cinq à six heures.

Ensuite, transférez une des tranches dans la chambre d’enregistrement. Placez un cadre en platine en forme de U muni d'une grille de fils de nylon par-dessus la tranche. Perfusez continuellement la tranche à raison d’un à deux millilitres par minute avec une solution d’enregistrement saturée au carbogène.

À cette étape, utilisez une seringue munie d'une pointe filtrante de 0,2 micron pour remplir la pipette de patch en verre avec la solution interne jusqu'à un niveau situé à un ou deux centimètres de l'extrémité arrière de la pipette. Ensuite, éliminez les bulles d'air présentes dans la pointe par la suite. Fixez fermement la pipette dans son support.

Appliquez une pression positive sur la pipette et déplacez-la vers la terminaison ciblée à l'aide d'un micromanipulateur, tout en faisant descendre la pointe à travers la coupe. Déplacez la pipette dans une direction latérale en balayant pour vous assurer que la coupe ne soit pas entraînée avec la pointe. Ensuite, déplacez la pointe de la pipette autour de la terminaison pour nettoyer la surface de la membrane.

Appuyez vers le bas avec la pointe contre le bord du terminal pour créer une déformation et relâcher la pression positive. Si un scellement gigaohm n'est pas obtenu immédiatement, appliquez une légère pression négative à la pipette. Une fois le scellement gigaohm formé, passez l'amplificateur de patch-clamp E PC nine en mode d'enregistrement sur cellule et modifiez le potentiel de maintien à moins 60 ou moins 70 millivolts.

Appliquez la correction rapide de la capacité et attendez que le scellement se stabilise entre cinq et dix gigaohms. Ensuite, rompez la membrane par une aspiration brève et douce. Pour établir la configuration d'enregistrement en mode cellule entière.

Vous pouvez également utiliser une aspiration buccale au lieu d'une seringue. Une fois la configuration en mode cellule entière établie sur une terminaison MB atomisée, appliquez une dépoliarisation en échelon de 200 millisecondes, allant de moins 70 à zéro millivolt. N'oubliez pas qu'une onde sinusoïdale de deux kilohertz est appliquée en mode blocage de tension avant et après cette dépoliarisation afin de mesurer la capacité membranaire ; cette dépoliarisation permet la mesure directe des courants calciques entrants activés par l'ouverture des canaux calciques de type L sensibles au voltage, en utilisant une solution interne à base de césium.

Parallèlement, il est possible de surveiller le saut de capacité provoqué par l'exocytose dépendante du calcium des vésicules synaptiques, laquelle augmente la surface membranaire. Si une cellule bipolaire MB intacte est enregistrée avec la pipette placée sur la terminaison synaptique, aucun courant calcique discernable ne sera observé en raison des courants de fuite importants dus au couplage par jonctions gap dans les réseaux des cellules bipolaires MB. Ce que l'on observe est un courant de fuite sortant important.

Cependant, on peut toujours surveiller le saut de capacité à l’aide d’un stimulus sinusoïdal à haute fréquence activé avant et après l’étape de dépolarisation illustrée. Voici des exemples de I-R-D-I-C, des images de terminaisons de cellules bipolaires M. Les terminaisons intactes ont tendance à apparaître elliptiques, comme illustré dans A et B, tandis que C montre la terminaison mixte, qui apparaît ronde et circulaire.

La méthode de remplissage au colorant peut également être utilisée pour classer les terminaisons cellulaires. Voici des exemples d'images de fluorescence de terminaisons de cellules bipolaires MBI avec un axone intact en D, un axone partiellement sectionné en E et un axone complètement retiré en F. Leurs teria sont indiqués par les flèches bleues. On montre ici les mesures directes des signaux d'imagerie calcique, de l'exocytose et de la rétroaction inhibitrice.

Dans un terminal de cellule bipolaire MB, une augmentation transitoire de la concentration en calcium dans les télérions d'un terminal MB a été activée par un déplacement de déclenchement en tension. L'image de fluorescence correspondante des télérions MB peut être observée en B. Des exemples de dépression synaptique à court terme de la libération de neurotransmetteurs sont présentés en C. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de minimiser la quantité de solution autour de la rétine lorsqu'elle est placée dans l'agarose du kit. Cela améliorera l'attachement de la structure issue du bloc d'agarose.