Cultures organotypique de mésencéphale ventral embryonnaire: Un système pour étudier le développement neuronal dopaminergique In vitro

L’objectif global de cette procédure est de générer des coupes organotypiques du mésencéphale embryonnaire du neurone E 12.5 pour l’analyse des neurones dopaminergiques en développement. Ceci est accompli en disséquant d’abord le cerveau embryonnaire. Ensuite, le cerveau est intégré dans des aéros à faible fusion.

La troisième étape consiste à sectionner les tranches de cerveau à l’aide d’un vibromasseur. La dernière étape consiste à choisir la bonne tranche de cerveau pour la culture et l’imagerie en accéléré. En fin de compte, l’imagerie time-lapse et la microscopie d’immunofluorescence sont utilisées pour montrer les premières étapes des neurones dopaminergiques, le comportement migratoire et la différenciation.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine neurodéveloppemental, telles que le suivi des neurones et le comportement migratoire au cours du développement du cerveau ventral. Un jour avant la dissection, préparez un tampon X Krebs et le milieu de culture selon le manuscrit accompagné environ deux heures avant la dissection. Préparez 100 millilitres d’aros à bas point de fusion à 4 % dans le tampon Krebs en passant la solution au micro-ondes jusqu’à ce que l’aros soit complètement dissous.

Placez ensuite les aros dans un bain-marie à 45 degrés Celsius. Ensuite, remplissez le bac à tampon Vibram avec un tampon Krebs glacé. Allumez l’élément de refroidissement et maintenez-le à quatre degrés Celsius.

Après cela, fixez une lame de rasoir dans le porte-lame. Préparez un scalpel, un pinceau fin et une mini cuillère perforée pour ramasser les tranches dans la zone du vibromasseur pour une section ultérieure. Ajoutez ensuite le tampon Krebs dans les boîtes de Pétri stériles et conservez-les sur de la glace.

Dans la zone de dissection, préparez trois grandes boîtes de Pétri stériles pour la dissection et deux petites boîtes de Pétri stériles pour l’enrobage : une paire de petits ciseaux, deux paires de pinces fines, une mini cuillère perforée, une pipette de pâturage en verre polie au feu avec une pointe ronde fermée et un litre de tampon Krebs sur glace. Essuyez tous les outils de dissection avec de l’éthanol à 70 %. Ensuite, ajoutez du milieu de culture dans les puits d’une plaque à six puits et incubez-le à 37 degrés Celsius pendant deux heures.

Ensuite, ajoutez 1,5 millilitre de tampon Krebs avec de la pénicilline streptomycine dans chaque puits d’une autre plaque à six puits dans des conditions stériles. Placez des inserts de membrane millicellulaire dans les puits. Placez la plaque à six puits à côté du vibrato afin que les tranches de cerveau puissent être transférées sur les membranes filtrantes.

Immédiatement après la section, sacrifiez une souris femelle enceinte avec des embryons au stade E 12.5 et retirez l’utérus en le soulevant avec une paire de pinces. Ensuite, utilisez une autre paire de pinces pour arracher le myomètre de l’utérus. Après cela, placez l’utérus dans un tampon Krebs glacé sous le microscope.

À l’aide d’une paire de pinces fines, séparez la paroi musculaire de l’utérus, la membrane du riker et le sac vitellin viscéral de l’embryon. Ensuite, retirez les embryons de l’utérus et déplacez-les dans une boîte de Pétri séparée avec un tampon Krebs stérile. Ensuite, coupez la tête de chacun des embryons.

Fixez la tête en la perçant au niveau des yeux à l’aide d’une pince fine. Utilisez une autre paire de pinces pour retirer soigneusement la peau et le crâne. Ensuite, soulevez soigneusement le cerveau et transférez-le dans une boîte de Pétri avec un tampon Krebs stérile.

Après cela, lavez les cerveaux à 4 % de point de fusion bas. Intégrez deux à trois cerveaux à la fois dans 4 % de sons frais à faible point de fusion. À l’aide d’une pipette Pasteur à pointe ronde polie au feu.

Placez ensuite les plats d’enrobage sur de la glace aussi uniformément que possible. Ensuite, soulevez les cerveaux jusqu’à ce que le bas de l’aros soit solidifié, afin que les cerveaux puissent se stabiliser uniformément et être parallèles au bas du bloc aros. Lorsque l’aros s’est complètement solidifié, coupez l’aros entourant le cerveau.

Après cette colle, l’aros se bloque sur l’étage de l’échantillon du vibromasseur. Lors du collage du bloc, assurez-vous que la face ventrale du cerveau est parallèle à la plate-forme. Section de coupes horizontales de 300 microns d’épaisseur à une fréquence de 50 hertz, amplitude de lame de 1,1 millimètre et vitesse de 25 millimètres par seconde.

Récupérez les tranches de cerveau en utilisant le pinceau fin pour pousser la tranche vers une mini cuillère perforée. Transférez-les ensuite dans une boîte avec un tampon Krebs stérile glacé au microscope. Choisissez la tranche qui contient du tissu médio-sencéphale ventral.

À cette étape, utilisez une mini cuillère perforée et un pinceau fin pour transférer les tranches de cerveau sur des inserts de membrane millicellulaire dans une plaque à six puits avec un tampon Krebs qui a été préparé précédemment. Ensuite, transférez les membranes avec les tranches à six autres. Bien plaquer avec du milieu de culture, garder le haut des membranes sec afin que les tranches de cerveau reçoivent le milieu par le bas et l’air par le haut.

Placez les tranches dans un incubateur avec 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius. Il est très important que les tranches soient placées dans l’incubateur dans les deux heures suivant la première étape de la dissection. Ces tranches peuvent être conservées in vitro pendant trois à quatre jours.

Après quatre à cinq heures de récupération. Les tranches peuvent être utilisées dans l’imagerie time-lapse juste avant l’imagerie. Ajoutez 1,5 microlitre, 200 millimolaires d’acide ascorbique dans le plat pour protéger les tranches contre la phototoxicité.

Incuber les tranches dans une chambre environnementale à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant l’imagerie en accéléré. Voici une coupe aiguë montrant la localisation normale des neurones dopaminergiques dans le mésencéphale ventral dans lequel les projections vers le cerveau antérieur ne se sont pas encore développées. Après une journée de culture, les projections vers le cerveau antérieur commencent à se former comme indiqué par la flèche jaune.

La pointe de flèche blanche indique l’emplacement des corps cellulaires illustrés par un grossissement plus élevé dans les encarts. Voici la racine migratrice des neurones marqués YFP. Dans une tranche horizontale aiguë, la position initiale des cellules est marquée d’une pointe de flèche rouge.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer des coupes génotypiques du mésencéphale embryonnaire marin E 12.5 pour obtenir des tranches viables et intactes. Il est important d’effectuer la dissection du cerveau embryonnaire avec soin et, après la section du vibrato, de choisir la bonne tranche de cerveau pour la culture et l’imagerie TimeLapse.