Cultures organotypique de mésencéphale ventral embryonnaire: Un système pour étudier le développement neuronal dopaminergique In vitro

L'objectif général de cette procédure est de produire des tranches organotypiques issues du mésencéphale embryonnaire de souris à E 12,5 afin d'analyser le développement des neurones dopaminergiques. Cette étape est réalisée en commençant par disséquer le cerveau embryonnaire, puis en incluant ce dernier dans de l'agarose à bas point de fusion.

La troisième étape consiste à découper les tranches de cerveau à l’aide d’un vibrosome. L’étape finale est de choisir la tranche de cerveau appropriée pour la culture et l’imagerie en temps réel. En fin de compte, l’imagerie en temps réel et la microscopie en immunofluorescence sont utilisées pour observer les premières étapes des neurones dopaminergiques, leur comportement migratoire et leur différenciation.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du développement neuronal, telles que le suivi du comportement des neurones et de leur migration au cours du développement du cerveau ventral. Un jour avant la dissection, préparez un tampon Krebs X et le milieu de culture selon le manuscrit accompagnant, environ deux heures avant la dissection. Préparez 100 millilitres d'agarose à bas point de fusion à 4 % dans le tampon Krebs en chauffant la solution au micro-ondes jusqu'à ce que l'agarose soit complètement dissoute.

Ensuite, placez les aros dans un bain-marie à 45 degrés Celsius. Puis, remplissez le plateau de tampon Vibram avec du tampon de Krebs glacé. Allumez l'élément de refroidissement et maintenez-le à quatre degrés Celsius.

Ensuite, fixez une lame de rasoir dans le porte-lame. Préparez un scalpel, un pinceau fin et une petite cuillère perforée pour ramasser les tranches dans la zone du vibrosectionneur en vue de la coupe ultérieure. Puis ajoutez du tampon de Krebs dans les boîtes de Pétri stériles et maintenez-les sur de la glace.

Dans la zone de dissection, préparez trois grandes boîtes de Petri stériles pour la dissection et deux petites boîtes de Petri stériles pour y placer une paire de ciseaux, deux paires de pinces fines, une petite cuillère perforée, une pipette Pasteur en verre à extrémité ronde fermée et polie à la flamme, ainsi qu'un litre de tampon Krebs sur de la glace. Essuyez tous les instruments de dissection avec de l'éthanol à 70 %. Ensuite, ajoutez du milieu de culture dans les puits d'une plaque à six puits et incubez-la à 37 degrés Celsius pendant deux heures.

Ensuite, ajoutez 1,5 millilitre de tampon de Krebs contenant de la pénicilline et de la streptomycine dans chaque puits d'une autre plaque de six puits, en conditions stériles. Placez les inserts à membrane dans les puits. Positionnez la plaque de six puits à proximité du vibrotome afin que les tranches de cerveau puissent être transférées sur les membranes filtrantes.

Immédiatement après la section, sacrifier une souris femelle gravide ayant des embryons au stade E 12,5 et retirer l'utérus en le soulevant à l'aide d'une pince. Ensuite, utiliser une autre paire de pinces pour déchirer le myomètre et le séparer de l'utérus. Puis, placer l'utérus dans du tampon de Krebs glacé sous le microscope.

Utilisez une paire de forceps fins pour séparer la paroi musculaire de l'utérus, la membrane de Reichert et le sac vitellin viscéral de l'embryon. Ensuite, retirez les embryons de l'utérus et transférez l'embryon dans une boîte de Pétri séparée contenant du tampon Krebs stérile. Puis, sectionnez la tête de chacun des embryons.

Fixez la tête en la transperçant au niveau des yeux à l'aide d'une pince fine. Utilisez une autre paire de pinces pour retirer soigneusement la peau et le crâne. Ensuite, soulevez délicatement le cerveau et transférez-le dans une boîte de Pétri contenant du tampon de Krebs stérile.

Après cela, lavez les cerveaux dans de l'agarose à bas point de fusion à 4 %. Incorporez deux à trois cerveaux à la fois dans de l'agarose à bas point de fusion fraîche à 4 %, à l’aide d’une pipette Pasteur à embout rond poli à la flamme.

Ensuite, placer les boîtes de congélation sur de la glace de manière aussi horizontale que possible. Puis soulever délicatement les cerveaux jusqu'à ce que le fond de l'agarose soit solidifié, afin que les cerveaux s'installent uniformément et soient parallèles au fond du bloc d'agarose. Lorsque l'agarose est complètement solidifiée, tailler l'agarose entourant les cerveaux.

Ensuite, fixez le bloc d'agarose sur la platine porte-objet du vibrotome. Lors de la fixation du bloc, veillez à ce que la face ventrale du cerveau soit parallèle à la plateforme. Sectionnez des tranches horizontales de 300 micromètres d'épaisseur à une fréquence de 50 hertz, une amplitude de lame de 1,1 millimètre et une vitesse de 25 millimètres par seconde.

Prélève les tranches de cerveau en utilisant un pinceau fin pour pousser la tranche vers une petite cuillère perforée. Transfère-les ensuite dans une boîte contenant du tampon de Krebs stérile et glacé sous le microscope. Sélectionne la tranche contenant le tissu du mésencéphale ventral.

À cette étape, utilisez une petite cuillère perforée et un pinceau fin pour transférer les tranches de cerveau sur des inserts de membrane Milli Cell placés dans une plaque à six puits contenant du tampon Krebs préparé au préalable. Ensuite, transférez les membranes avec les tranches dans une autre plaque à six puits contenant du milieu de culture, en veillant à maintenir la partie supérieure des membranes sèche afin que les tranches de cerveau reçoivent le milieu par en dessous et l'air par au-dessus.

Placer les tranches dans un incubateur avec 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius. Il est très important que les tranches soient placées dans l'incubateur dans les deux heures suivant l'étape initiale de la dissection. Ces tranches peuvent être maintenues in vitro pendant trois à quatre jours.

Après quatre à cinq heures de récupération, les tranches peuvent être utilisées pour l'imagerie en temps réel juste avant l'acquisition. Ajoutez 1,5 microlitres d'acide ascorbique 200 millimolaire dans la boîte pour protéger les tranches contre la phototoxicité.

Incuber les tranches dans une chambre d'incubation à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant l'acquisition d'images en temps réel. Voici une tranche aiguë montrant la localisation normale des neurones dopaminergiques dans le mésencéphale ventral, où les projections vers le prosencéphale ne se sont pas encore développées. Après un jour en culture, les projections vers les prosencéphales commencent à se former, comme indiqué par la flèche jaune.

La flèche blanche indique l'emplacement des corps cellulaires montrés à plus forte grossissement dans les encarts. Voici la racine migratoire des neurones marqués avec la protéine fluorescente jaune (YFP). Dans une coupe horizontale aiguë, la position initiale des cellules est marquée par une flèche rouge.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer des tranches génétiques à partir du mésencéphale embryonnaire de souris au stade E 12,5 afin d'obtenir des tranches viables et intactes. Il est important de réaliser la dissection du cerveau embryonnaire avec soin et, après la section au vibratome, de choisir la tranche cérébrale appropriée pour la culture et l'imagerie en temps réel.