Après Cell-sort

L'objectif général de cette procédure est d'utiliser un microscope à fluorescence pour suivre en temps réel le sulfate chez E. coli après infection par le bactériophage lambda. Commencez par préparer un lysat brut de phage lambda. Ensuite, purifiez le phage et infectez E. coli avec le phage lambda dans un tube.

Continuer à suivre le destin des cellules bactériennes au microscope. En fin de compte, les résultats peuvent montrer en temps réel les différents destins cellulaires chez E. coli grâce à l'expression de différentes protéines fluorescentes associées à la croissance ou à la mort cellulaire. En général, un point critique de cette méthode réside dans la préparation d'un front purifié et d'un stock de FI marqué.

Pour éviter le partage de fige pendant la préparation et la purification, optimisez également les paramètres d'imagerie au microscope afin de permettre une croissance cellulaire saine. Inoculez une culture de 24 heures de E 3 92 Lambda LZ un PPL étoile D dans du milieu LBM à une densité cellulaire de DO 600 d'environ 0,6, puis induisez la lyse dans un bain-marie agité à 42 degrés Celsius.

Poursuivre l'incubation à 37 degrés Celsius jusqu'à ce que la lyse soit évidente. La culture devient limpide. Ajouter maintenant 2 % de chloroforme, puis incuber pendant 15 minutes à température ambiante.

Ensuite, transférez le lysat de bactériophages dans des bouteilles de 250 millilitres et centrifugez la culture. Récupérez ensuite le surnageant contenant les particules de bactériophages et effectuez une deuxième centrifugation pour éliminer les débris visibles selon les protocoles standards de titrage des bactériophages. Mesurez la concentration en bactériophages, puis purifiez les bactériophages par gradient de chlorure de césium et analysez l'activité par DPI en vue de la préparation de géloses aro.

Nettoyez six lames de microscope avec de l'éthanol à 70 %. Disposez cinq lames comme indiqué et fixez-les avec du ruban adhésif. Versez ensuite une solution d'aros à 1,5 % dans le milieu sur les lames fixées.

Placer la dernière lame par-dessus, en évitant soigneusement les bulles d'air. Déposer un poids dessus et laisser refroidir l'AROS pendant environ 30 minutes. Retirer les quatre lames situées sur les côtés et emballer le bloc de lames avec du film étirable.

En utilisant une culture bactérienne transformée de 24 heures comme inoculum, faire croître une culture dans le milieu LBMM, prélever un millilitre de bactéries et resuspendre. Suspendre les cellules dans 20 microlitres de LBMM glacé à l’aide d’une pipette à embout large.

Ajouter 20 microlitres de bactériophages purifiés. Mélanger doucement et incuber d'abord sur de la glace pendant 30 minutes pour permettre l'absorption des bactériophages. Ensuite, placer dans un bain-marie à 35 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Pour déclencher l'injection de l'ADN du bactériophage, séparer les agrégats cellulaires par agitation. Diluer le mélange d'un dixième dans du LBMM. Placer maintenant une boîte de gélose LBM.

Sur un lamelle, ajoutez un microlitre du mélange de cellules phagiques. Une fois absorbé, placez délicatement une autre lamelle par-dessus. Commencez par acquérir un jeu d'images à travers le canal YFP pour le laps de temps initial.

Prenez une série de 15 images à des intervalles de 200 nanomètres sur l'axe Z. En outre, prenez une seule image nette à travers les canaux de contraste de phase et m-cherry. Ensuite, acquérez un film en laps de temps du destin cellulaire post-infection.

Pour minimiser la décoloration et la phototoxicité pendant l'enregistrement de la vidéo en laps de temps, utilisez une seule image en position Z par canal et par point temporel, en acquérant l'échantillon en contraste de phase, ainsi que dans les canaux YFP et mCherry, à des intervalles de 10 minutes pendant environ quatre heures. Commencez l'analyse des images par un décompte manuel des phages, et enregistrez également la localisation des phages et la longueur des cellules. Dans le cadre du premier intervalle temporel, notez les destinées cellulaires : lytique, lysogénique ou non infectée.

Documentez également la durée de lyse et toute autre information souhaitée en lisant le film en accéléré, et extrayez davantage d'informations quantitatives, telles que le niveau de fluorescence au fil du temps dans des cellules individuelles, en utilisant des algorithmes automatisés de reconnaissance cellulaire et de traçage de lignée. Généralement, les plaques des phages marqués par fluorescence sont nettement plus petites que celles du type sauvage, et les signaux YFP et DAPI d'un phage correctement purifié co-localisent. Ces données combinent des séries d'images en contraste de phase, des canaux YFP et mCherry, ainsi que les images superposées correspondantes provenant d'un film en accéléré.

Les phages individuels sont clairement visibles au moment initial. Ici, deux cellules sont observées, chacune infectée par un seul phage, et une cellule est infectée par trois phages. Généralement, un certain nombre de phages sont observés à la surface des cellules, tandis que d'autres phages ne sont pas absorbés.

Au fil du temps, le résultat de l'infection devient discernable. Quatre-vingts minutes plus tard, les deux cellules infectées par des phages uniques ont chacune entamé la voie lytique. Grâce à la production intracellulaire de nouveaux phages, la cellule infectée par trois phages est entrée dans la voie lysogène, marquée par la production de mCherry à partir du pré-moteur.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer un stock purifié de phage destiné à infecter des bactéries E. coli à l’aide du phage lambda, et réaliser un examen en temps réel du mode de vie sous microscope.