Réalisé cellulaire auto-assemblage pour fabriquer des anneaux de tissus dérivés de cellules pour l'analyse biomécanique et génie tissulaire

L'objectif général de cette procédure est de créer des constructions tissulaires tridimensionnelles à partir de cellules agrégées et de matrice dérivée de cellules, pouvant être utilisées pour des analyses fonctionnelles. Cela est réalisé en usinant d'abord un moule en polycarbonate afin de créer des puits annulaires à fond rond. Ensuite, le polydiméthylsiloxane ou PDMS est coulé sur le moule en polycarbonate pour former un gabarit.

Ensuite, le modèle en PDMS est utilisé pour former des puits aros. La dernière étape consiste à ensemencer des cellules dans les puits aros afin de permettre leur agrégation et la formation d'anneaux tissulaires cohésifs. En définitive, cette méthode peut être utilisée pour obtenir l'auto-assemblage cellulaire et l'ingénierie tissulaire à l'aide de différents types cellulaires, et permet d'analyser la contribution des cellules et de la matrice extracellulaire qu'elles produisent à la structure et à la fonction du tissu.

L'avantage principal de cette technique par rapport à d'autres approches en ingénierie tissulaire est qu'elle permet de générer des constructions tissulaires entièrement constituées de cellules et de la matrice extracellulaire qu'elles produisent plus rapidement qu'auparavant, et sous un format adapté à l'analyse mécanique. Commencez par fraiser un morceau de polycarbonate d'un demi-pouce d'épaisseur afin de créer 15 puits annulaires à fond rond munis d'un axe central de deux millimètres de diamètre. Nettoyez le moule en polycarbonate pour éliminer tous les débris plastiques générés lors du fraisage, puis laissez-le sécher. Ensuite, mélangez le PDMS selon un rapport de 10 à 1 entre la base et l'agent de durcissement. Débarrassez la solution de ses bulles d'air par dégazage, puis versez-la dans le moule en polycarbonate.

Ensuite, dégazer une nouvelle fois le mélange sur le moule afin d'éliminer les bulles d'air résiduelles et polymériser le PDMS dans une étuve à 60 degrés Celsius pendant quatre heures. Pendant la polymérisation du PDMS, dissoudre 2 %AROS dans du DMEM. Une fois la polymérisation terminée, retirer délicatement le gabarit en PDMS en le décollant lentement du polycarbonate, puis laver le PDMS à l'eau savonneuse et l'autoclaver conjointement avec la solution de DMEM contenant l'AROS. Placer ensuite le gabarit en PDMS autoclavé sur une surface plane et le remplir d'AROS fondu en pipetant d'abord l'AROS dans chacun des moules correspondant aux piliers centraux, puis en ajoutant de l'AROS par pipetage dans l'espace environnant.

Laisser durcir les aros pendant environ 15 minutes. Ensuite, retourner le moule pour extraire les aros du PDMS. Couper l'excédent d'aros autour de chaque puits, puis placer un puits d'aros dans chaque puits d'une plaque de 12 puits. Maintenant.

Ajouter du milieu de culture cellulaire autour de l'extérieur du puits aros sans recouvrir le dessus du puits. Ensuite, placer les plaques dans l'incubateur pour permettre leur équilibration pendant la préparation des cellules. À une confluence de 90 %, trypsiner les cellules musculaires lisses aortiques du rat et les resuspendre.

Suspendre les cellules à une concentration de 5 × 10⁶ cellules par millilitre. Ensuite, pipeter 100 microlitres de la suspension cellulaire resuspendue dans chaque puits d'aros équilibrés. Appliquer les cellules dans chaque puits à l'aide d'un mouvement circulaire.

Placer les plaques dans l'incubateur pendant 24 heures sans les déranger. Changer le milieu tous les deux jours en aspirant le milieu autour du puits, puis en remplissant à nouveau chaque puits jusqu'à ce que le moule aros soit complètement submergé. À la fin de la culture, remplir une petite boîte de Pétri avec du PBS.

Retirez chaque anneau de son moule aros en le faisant glisser par-dessus le haut du poteau central. Placez les anneaux dans les boîtes de Pétri avec le PBS Center, un anneau sous le système d'imagerie numérique. Utilisez un logiciel de détection des bords pour mesurer l'épaisseur de l'anneau à quatre positions : en haut, en bas, à gauche et à droite, tout autour de sa circonférence.

Pour effectuer un essai de traction uniaxial, monter un échantillon en forme d'anneau sur deux pinces en fil fin. Étirer les pinces jusqu'à ce qu'une charge de déchirure de cinq milli Newtons soit appliquée à l'anneau.

Ensuite, saisissez la surface transversale calculée à partir des mesures d'épaisseur et enregistrez la longueur de jauge. Effectuez huit cycles préliminaires de l'anneau entre la charge de déchirure et 50 kilopascals. Appliquez une contrainte à une vitesse de 10 millimètres par minute après le huitième cycle préliminaire, puis tirez jusqu'à la rupture à 10 millimètres par minute.

Pour chaque anneau, mesurez la contrainte ultime en traction et la déformation à la rupture, puis calculez le module tangent maximal à partir des données obtenues. En complément des études fonctionnelles in vitro, ces anneaux cellulaires vivants peuvent également fusionner pour former des tubes de tissu. Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour couper les extrémités des tubes en silicone en biais afin de créer des bords biseautés, puis stérilisez les tubes en silicone en autoclave pendant que les tubes subissent l'autoclavage.

Remplissez une boîte de Pétri avec du milieu, transférez les supports personnalisés en silicone stérilisés pour tubes dans une cabine de sécurité biologique et placez-les dans une boîte de Pétri vide. Ensuite, retirez les anneaux des puits aros et placez-les dans la boîte de Pétri remplie de milieu. Disposez les tubes en silicone dans la même boîte de Pétri afin de les humidifier avant utilisation.

Utilisez une pince pour placer l'extrémité d'un tube en silicone au centre d'un anneau, puis faites glisser délicatement l'anneau sur le tube en silicone. Faites glisser les anneaux en les mettant en contact les uns avec les autres en les poussant successivement dans les deux sens le long du tube. Une fois les anneaux montés, alignez les tubes en silicone dans les supports en polycarbonate et vissez les deux parties du support ensemble.

Ajoutez 55 millilitres de milieu dans la boîte de Pétri. Renouvelez le milieu tous les trois jours pendant toute la durée de la culture afin d'éliminer les tubes de tissu. Commencez par remplir une boîte de Pétri avec du PBS.

Ensuite, retirez les tubes en silicone du support en polycarbonate et utilisez une pince pour faire glisser les tubes de tissu hors du tube en silicone et les placer dans la boîte. Lorsque l'opération est correctement réalisée, les cellules se déposent au fond des puits d'Aros et se contractent dans les 24 heures suivant leur positionnement, formant un anneau de tissu autour du poteau central dans le puits d'Agarro. Voici un tracé représentatif d'une courbe contrainte-déformation obtenue à partir d'un essai de traction uniaxiale sur un anneau de tissu de deux millimètres généré à partir de cellules musculaires lisses de rat. La résistance à la traction, le module de traction maximal et les valeurs de déformation à la rupture sont ensuite utilisés pour comparer les propriétés mécaniques d'échantillons d'anneaux de tissu cultivés selon différents paramètres de culture.

Les propriétés mécaniques des anneaux de tissu peuvent être contrôlées en modifiant les paramètres de culture, notamment le nombre de cellules ensemencées, la durée de culture, le milieu de culture et le type cellulaire utilisé. Outre les cellules musculaires lisses de rat, les cellules musculaires lisses primaires humaines forment des anneaux de tissu présentant une résistance à la traction similaire.

Les cellules souches mésenchymateuses humaines s'agrègent également en formant des anneaux, mais ceux-ci n'étaient pas assez résistants pour des tests mécaniques. Notre système permet la fabrication de constructions tissulaires ingénierisés entièrement à partir de cellules, simplement en semant des cellules dans nos puits aros personnalisés. Une fois le moule initial en polycarbonate usiné, nous pouvons fabriquer un nombre illimité de gabarits en PDMS qui pourront ensuite être utilisés pour réaliser les moules, sans nécessiter d'équipement supplémentaire.

Le système est polyvalent, car nous avons utilisé plusieurs types cellulaires différents dans ce système pour fabriquer des anneaux de tissus, et il pourrait donc être utilisé potentiellement tant pour des applications en ingénierie tissulaire que pour des études in vitro sur les contributions des cellules et de la matrice extracellulaire à la structure et à la fonction des tissus.