Analyses morphométriques des sections rétiniennes
19 février 2012
Cette vidéo montre trois types d'analyses morphométriques de la rétine, qui comprennent la mesure de l'épaisseur de couche nucléaire interne, de quantifier le nombre de cellules ganglionnaires de la rétine (CGR) et de mesurer les tailles de CGR. La technique peut offrir une plate-forme simple mais scientifique pour analyses morphométriques.
Bonjour, je suis Regina du laboratoire des maladies neurodégénératives du Département d'anatomie de l'Université de Hong Kong. Aujourd'hui, je vais vous montrer comment réaliser l'analyse de progression de la section rétinienne. Commençons. Avant d'effectuer toute analyse, un recul de l'échantillon rétinien et quatre coupes de MyFitness doivent subir une coloration H&E.
Ensuite, la séance rétinienne est divisée en quatre régions : la région périphérique supérieure, la région centrale supérieure, la région centrale inférieure et la région périphérique inférieure. Après avoir défini ces régions, une image de chaque région est acquise avec un grossissement de 10 fois 40 sous le microscope à faisceau clair de decor.
Maintenant, nous sommes prêts à analyser les informations morphologiques de la rétine. Cette séance montrera comment mesurer l'épaisseur de la couche nucléaire interne. Ouvrez le logiciel appelé thorough investigator.
Choisissez parmi les 40 types, puis dans la barre principale à deux onglets, sélectionnez « ouvrir une image ». Sous l'onglet « fichier », choisissez une image d'une région rétinienne que vous souhaitez analyser. Sélectionnez le type de ligne de contour dans le menu déroulant de la barre principale à deux onglets.
Veillez à ce que le déplacement automatique soit activé. Vous pouvez agrandir l'image en cliquant sur le bouton d'agrandissement. Vous pouvez utiliser le bouton de réduction pour diminuer la taille de l'affichage de l'image.
Le tracé et l'échantillon peuvent être déplacés selon quatre directions différentes en actionnant les boutons de mouvement. Clic droit dans la fenêtre de tracé et sélectionnez le tracé de fissure simple. Dessinez la ligne de contour le long de la bordure intérieure de la couche interne.
Si une erreur est commise, interrompez-la dans la fenêtre de traçage et appuyez sur le bouton d'annulation pour effacer le dernier point tracé. Poursuivez le traçage jusqu'au dernier point de la ligne. Une fois le dessin terminé, interrompez-le dans la fenêtre de traçage, choisissez un contour ouvert et lancez l'image en cliquant sur zoomer.
Cliquez sur le bouton gauche dans la fenêtre de traçage. Pour agrandir l'image, sélectionnez un marqueur sur la barre de marqueurs deux à Marcus. Au point de jonction.
Après avoir ajouté tous les marqueurs, sélectionnez l'icône de marqueur à la position du curseur sur la barre du marqueur deux. Au centre de l'un des marqueurs, sélectionnez « mesurer rapidement les angles » sous l'onglet deux en cliquant avec le bouton droit dans la fenêtre de tracé, puis choisissez l'option continue. Mesurez l'angle en cliquant d'abord au centre d'un marqueur adjacent au marqueur sélectionné.
Pour une extrémité du segment de ligne, déplacez-vous le plus près possible du centre de la zone concernée. Marqueur et fissure. Étendez à nouveau la ligne élastique jusqu'à la bordure externe de la couche inia et ajustez l'angle jusqu'à 90 degrés.
Atteindre la fissure gauche au niveau du souhait. Positionnez une boîte de dialogue affichant simultanément la mesure de l'angle qui apparaîtra juste après le clic. Appuyez sur la touche Entrée tout en maintenant la souris immobile vers la gauche.
Cliquez sur la fenêtre de traçage afin que la ligne soit dessinée d'une extrémité à la nouvelle extrémité sélectionnée. Rompez-la dans la fenêtre de traçage et choisissez un contrôle ouvert. Nous devons effectuer quatre mesures des doigts de la couche nucléaire interne dans chaque région, où quatre lignes seront tracées.
Perpendiculairement à la base de contrôle de la nuit jusqu'à la bordure externe de la couche nucléaire interne, et lancez l'image afin de pouvoir voir clairement la bordure. Si l'extrémité de la ligne ne se trouve pas à l'extérieur de la couche nucléaire interne, vous pouvez soit les relier, soit raccourcir la ligne en mode édition. Sélectionnez le mode édition et choisissez la ligne.
Cliquez ensuite sur la fenêtre de traçage et sélectionnez un point de recherche dans le contrôle électrique ; ajoutez un point sur la bordure extérieure, tout en veillant à ce que la modification du point s'effectue le long de la même ligne. Supprimez le point d'origine. Un nouvel alignement peut alors être obtenu.
Réduisez la taille de l'image en cliquant sur le bouton de zoom arrière. Désélectionnez le mode édition et tracez le dernier segment de ligne. Après avoir dessiné les lignes dans l'ordre, sélectionnez le mode édition.
Cliquez avec le bouton droit sur la fenêtre de traçage et nous positionnons ainsi les quatre segments de droite. Nous pouvons maintenant obtenir les quatre mesures en appuyant sur le bouton de mesure CONT. Sélectionnez ces quatre mesures et collez-les dans un logiciel spécialisé en cliquant sur copier.
Pour cliquer sur la balle, sélectionnez « Enregistrer sous » dans l'onglet Fichier. Les données de traçage peuvent être enregistrées sous forme de fichier de données. Dans cette partie, nous quantifierons le nombre de cellules rouges à queue de gagan ; sélectionnez l'image à ouvrir.
Sous l'onglet fichier, choisissez une image d'une région rétinienne que vous souhaitez analyser. Tout d'abord, nous devons identifier les cellules vivantes et les cellules mortes. Ces cellules présentant une forme allongée avec un cytoplasme fin et un noyau clairement visible sont considérées comme des cellules ganglionnaires rétiniennes vivantes.
Ces cellules petites et condensées sont considérées comme cette cellule. Choisissez le type de ligne de contour dans le menu déroulant de la barre principale. Tracez une ligne le long de la bordure de la couche de fibres gauche et suivez à l’aide de l’option et d’un contour ouvert.
Ajoutez à chaque extrémité, placez un marqueur à l'extrémité de la ligne et l'autre à la position près de l'équipe. Vous sélectionnez l'icône de marqueur dans la barre de marqueur deux. Positionnez le curseur au centre des marqueurs.
Au niveau de l'extrémité, sélectionnez la mesure rapide d'angles dans l'onglet. Effectuez un clic droit dans la fenêtre de traçage, choisissez l'option continue, puis les lignes élastiques et mesurez un angle de 19 degrés. Appuyez sur la touche Entrée juste après que la zone de saisie soit remplie.
Mais souvenez-vous que la souris est toujours en même temps restée sur place. Rompez la fenêtre de traçage afin qu'une nouvelle ligne puisse être particulièrement prolongée à partir de l'extrémité. Rompez dans la fenêtre de traçage et choisissez un contrôle ouvert.
Tracez une autre nouvelle ligne exactement de la même manière qu'à l'autre extrémité. Nous avons ainsi créé deux limites entre lesquelles on dénombre les cellules de ratin gagan. Sélectionnez un type de marqueur et fixez-en un à chaque groupe de cinq cellules.
Choisissez une limite comme ligne d'exclusion, que la cellule touche mais qui n'est pas active. Sélectionnez un autre type de marqueur pour les cellules mortes. Le nombre de chaque type d'espace de marqueur sera affiché à côté de l'icône du marqueur. En conséquence.
Sur le marqueur à deux barres, sélectionnez le mode d'édition et sélectionnez la ligne de base du contour. Rompez-la dans la fenêtre de traçage et terminez à nouveau la ligne. Le nom de la ligne de base du contour peut être obtenu en appuyant sur le bouton de mesure du contour.
Le nombre de cellules peut ensuite être exprimé par millimètre du nom. Enregistrons donc sous l'onglet fichier. Les données de traçage et de marqueur peuvent être enregistrées sous forme de fichier de données.
Cette partie montrera comment mesurer le côté cellulaire d'une image ouverte de cellule ganglionnaire rétinienne. Sous l'onglet fichier, sélectionnez une image d'une région rétinienne souhaitée que vous souhaitez analyser. Choisissez une cellule ganglionnaire vivante selon les critères décrits dans la partie précédente.
Ainsi, dans la cellule vivante, choisissez le type de ligne de contour à partir du point noté des deux barres principales. Tracez une ligne de contour le long de la circonférence de la cellule, puis cliquez sur la touche de fin située à droite de la fenêtre de traçage et sélectionnez « terminer le contour fermé ». La surface de la cellule s'affichera sous l'élément « surface » dans la boîte de dialogue de mesure de contrôle.
Cette vidéo a démontré trois méthodes simples permettant d'analyser objectivement la rétine. Espérons que cette vidéo sera utile.
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Aperçu
Cette vidéo démontre trois types d'analyses morphométriques de la rétine, notamment la mesure de l'épaisseur de la couche nucléaire interne, la quantification du nombre de cellules ganglionnaires de la rétine (RGC) et la mesure de la taille des RGC. La technique offre une plateforme scientifique pour ces analyses.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Morphométrie rétinienne
- Quantification cellulaire
Contexte
- La santé de la rétine est essentielle à la vision.
- Les analyses morphométriques permettent de mieux comprendre les maladies rétiniennes.
- Les cellules ganglionnaires de la rétine sont essentielles à la transmission de l'information visuelle.
- La mesure des CGR peut fournir des informations sur les affections neurodégénératives.
Objectif de l'étude
- Démontrer les techniques morphométriques pour l'analyse rétinienne.
- Quantifier les cellules ganglionnaires de la rétine et leur taille.
- Mesurer l'épaisseur de la couche nucléaire interne.
Méthodes utilisées
- Préparation des échantillons de rétine.
- Coloration par l'hématoxyline et l'éosine (H&E).
- Division de la rétine en régions définies pour l'analyse.
- Acquisition d'images à divers agrandissements.
Résultats principaux
- Mesure réussie de l'épaisseur de la couche nucléaire interne.
- Quantification des cellules ganglionnaires de la rétine.
- Évaluation de la taille des CGR dans différentes régions rétiniennes.
- Mise en évidence d'une approche systématique de la morphométrie rétinienne.
Conclusions
- Les techniques présentées sont efficaces pour l'analyse de la rétine.
- Ces méthodes peuvent contribuer à la compréhension des pathologies rétiniennes.
- De futures études pourront s'appuyer sur ce cadre pour des recherches supplémentaires.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
L'analyse morphométrique objective des sections rétiniennes permet une quantification précise de la perte neuronale et des modifications structurelles, soutenant ainsi la validation des cibles dans les modèles de maladies neurodégénératives. En réduisant la variabilité des mesures et en augmentant la sensibilité aux changements minimes, cette approche renforce la confiance prédictive dans l'évaluation de l'efficacité thérapeutique. Elle fournit une plateforme transposable pour évaluer les pathologies rétiniennes à travers les différentes étapes de la découverte de médicaments.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en quantifiant les modifications de la densité des cellules ganglionnaires rétiniennes et de la taille de leur corps cellulaire dans des modèles de maladie.
- Valeur opérationnelle : Soutient la réduction des risques biologiques grâce à la mesure reproductible de l'épaisseur de la couche nucléaire interne et des morphométries des couches cellulaires.
- Valeur prédictive : Facilite le tri des portefeuilles de projets en fournissant des données morphométriques absolues et reproductibles permettant des comparaisons entre études.
Développement de tests et criblage
- Prêt de l'essai : Prépare des systèmes biologiques validés pour des flux de travail en aval grâce à des protocoles normalisés d'acquisition d'images par régions et de traçage.
- Production quantitative : Génère des mesures absolues de longueur et de taille directement exportables vers des fichiers analytiques, améliorant ainsi la cohérence des données.
- Extensibilité : Permet une évaluation fiable des composés grâce à une variabilité observateur réduite et une sensibilité accrue pour la détection de modifications rétiniennes minimes.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour la maladie : S'aligne sur les stratégies translationnelles de biomarqueurs en associant la perte de cellules ganglionnaires rétiniennes et les modifications de l'épaisseur des couches aux résultats thérapeutiques dans les modèles de glaucome et d'excitotoxicité.
- Continuité préclinique : Soutient les décisions d'advancement ajustées au risque grâce à des critères morphométriques objectifs et reproductibles à travers différentes régions rétiniennes.
- Réduction des risques mécanistiques : Se concentre sur l'évaluation prédictive en isolant les modifications structurelles indépendamment des tests fonctionnels.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette méthode s'intègre dans la continuité de la découverte, de la validation précoce de cibles jusqu'à l'identification de composés candidats et à l'évaluation préclinique, en fournissant des lectures structurales qui complètent les évaluations fonctionnelles dans les modèles de maladies rétiniennes.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses et la clarification des voies biologiques en quantifiant le nombre de cellules, leur taille et l'épaisseur des couches dans des régions rétiniennes définies.
- Écrans biologiques : Assure la préparation et la reproductibilité des tests grâce à l'analyse normalisée de coupes colorées à l'hématoxyline-éosine et au tracé assisté par logiciel.
- Analytique : Fournit des mesures quantitatives de variables dépendantes (nombre de cellules, taille du soma, épaisseur des couches) permettant des comparaisons statistiques entre groupes traités.
- Recherche translationnelle : S'inscrit dans la continuité préclinique par l'utilisation de paramètres structuraux pertinents pour la maladie dans des modèles d'excitotoxicité induite par le NMDA, d'ischémie-reperfusion et de glaucome.
- Réutilisation institutionnelle : Met en place une capacité réutilisable de morphométrie rétinienne applicable à divers modèles de maladies et interventions thérapeutiques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive dans la validation des cibles grâce à la réduction de l'ambiguïté mécanistique dans la neurodégénérescence rétinienne.
- Valeur opérationnelle : Normalisation, reproductibilité et évolutivité des mesures morphométriques entre opérateurs et sites.
- Valeur stratégique : Décisions d'orientation plus pertinentes, efficacité accrue du capital et réduction des risques biologiques en phase avancée par la détection précoce de biomarqueurs structuraux.
- Impact sur le portefeuille : Priorisation et décisions d'avancement ajustées au risque, fondées sur des modifications structurelles rétiniennes quantifiables.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Des compétences spécialisées en histologie, microscopie et utilisation de logiciels de morphométrie (Stereo Investigator) sont requises.
- Le matériel nécessaire comprend un microscope en champ clair, un système de traçage informatisé et un logiciel d'analyse d'images.
- La standardisation entre équipes exige le respect du protocole concernant la définition des régions, la technique de traçage et la réplication des mesures.
- Les adaptations selon les systèmes modèles impliquent l'ajustement du grossissement, de l'échantillonnage des régions et des critères d'identification cellulaire.
- Les limites pratiques incluent la dépendance à la qualité des sections tissulaires et à la constance de la coloration pour une délimitation précise des contours.
