L'extraction des lipides cellulaires pour ciblées dilution isotopique stable analyse de spectrométrie de masse chromatographie liquide-

La méthode vise à quantifier avec précision les métabolites lipidiques bioactifs cellulaires en combinant la dilution des isotopes stables, la phase CNR, la chromatographie liquide, la capture d’électrons, la pression atmosphérique, l’ionisation chimique et la spectrométrie de masse. Commencez par prélever des échantillons de milieux et de cellules et ajoutez un mélange d’étalons internes marqués à l’isotope lourd. Extraire les lipides bioactifs avec un solvant organique, puis dériver les lipides bioactifs avec un réactif de capture d’électrons procéder à la quantification précise des lipides bioactifs par chromatographie liquide.

La spectrométrie de masse par analyse LCMS des résultats des lysats cellulaires et des milieux détermine avec précision la concentration des lipides bioactifs ciblés et les niveaux de RE Anant individuels. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la chromatographie liquide en phase inverse, la spectrométrie de masse et d’autres méthodes LCMS est que les individus et les antres sont quantifiés avec précision grâce à l’utilisation de la chromatographie en phase normale car et de la dilution isotopique stabilisée. Les données qui en résultent peuvent fournir des informations précieuses sur les voies enzymatiques qui fonctionnent dans la cellule.

Pour chaque plaque de 10 centimètres d’un adhérent, les cellules collectent trois millilitres de milieu dans un tube à centrifuger en verre de 10 millilitres. Ensuite, lavez les cellules deux fois avec du PBS. Ajoutez ensuite un millilitre de PBS, grattez les cellules de la plaque et transférez l’échantillon dans un second tube à centrifuger en verre de 10 millilitres.

Préparez huit tubes supplémentaires avec trois millilitres de PBS pour une courbe d’étalonnage. Ajoutez ensuite 10 microlitres de l’étalon d’étalonnage approprié dans chaque tube. Alignez chaque échantillon de test du milieu de culture cellulaire de trois millilitres collecté pour l’extraction des lipides bioactifs libres.

Ajoutez 10 microlitres de mélange d’étalon interne à chaque étalon et équilibrez l’échantillon pendant 10 minutes à température ambiante pour traiter les échantillons à cinq millilitres d’éther dathylique et placez-le sur un agitateur pendant 30 minutes. Centrifugez les échantillons et transférez la phase organique supérieure dans des tubes à centrifuger en verre de 10 millilitres. Continuez à sécher les échantillons sous azote Tout d’abord, collectez les échantillons cellulaires récoltés par centrifugation et remettez en suspension chaque palette dans deux millilitres de PBS par Vortex Reserve 25 microlitres de chaque échantillon pour la normalisation du lysat cellulaire.

Maintenant, divisez également chaque lysat dans des tubes à centrifuger en verre de 10 millilitres. Ajoutez deux millilitres supplémentaires de PBS et 10 microlitres d’ISM à chaque échantillon afin de mesurer les lipides cellulaires libres et d’éviter la dégradation alcaline des lipides tels que les prostaglandines, utilisez un duplicata de chaque échantillon pour effectuer des extractions d’éther dathylique comme indiqué précédemment. Pour extraire les lipides estérifiés, ajoutez cinq millilitres de mélange de chloroforme et de méthanol à chacun des échantillons restants.

Placer sur un agitateur à basse vitesse pendant 30 minutes, puis centrifuger pendant 10 minutes. Maintenant, collectez la couche organique inférieure et séchez les échantillons sous azote pour ficeler les lipides estérifiés. Ajouter 0,5 millilitre d’hydroxyde de potassium normal 0,4 dans du méthanol à 80 % dans chaque tube.

Incuber des échantillons à 60 degrés Celsius pendant une heure. Ajoutez ensuite deux millilitres de PBS et ajustez le pH deux six avec de l’acide chlorhydrique concentré. Enfin, ajoutez 10 microlitres d’ISM à chaque échantillon et procédez à l’extraction à l’éther dathylique des échantillons séchés et des étalons d’étalonnage.

Ajoutez les réactifs de dérivitation dans l’ordre spécifié. Ensuite, vortex les échantillons et incubation à 60 degrés Celsius pendant une heure. Maintenant, séchez les échantillons sous azote avant de les stocker et de les analyser.

Cette méthode utilise une combinaison de dilution d’isotopes stables, de chii, de chromatographie liquide, de capture d’électrons, de pression atmosphérique, d’ionisation chimique et d’analyse par spectrométrie de masse. Reconstituez les échantillons et les étalons dans 100 microlitres d’éthanol hexane, et transférez les échantillons entiers dans des flacons HPLC avec insert placez les échantillons dans l’échantillonneur automatique réfrigéré. Créez une liste d’exemples à analyser.

Ensuite, configurez les méthodes HPLC et MS à l’aide des paramètres décrits dans le tableau un et le tableau deux dans le protocole écrit ci-joint pour la séparation de phase normale. Un pack chiral, une colonne DH à 30 degrés Celsius, injecte l’échantillon et commence la course. Réglez maintenant le MS en mode ions négatifs à l’aide de la source PCI A.

Commencez par une ébauche d’hexane pour équilibrer la colonne. Ensuite, analysez les échantillons de l’étalon d’étalonnage dans l’ordre d’augmentation de la concentration de SM. Continuer à traiter les échantillons d’essai des milieux de culture après la séparation HBLC.

Ajouter du méthanol pour éviter le dépôt sur l’aiguille corona. Utilisation des données générées à partir des normes. Créez une courbe d’étalonnage traçant la surface de l’échantillon sur l’axe Y, et la concentration standard sur l’axe des x dérivez l’équation Y est égal à MX plus B.

Enfin, déterminez les concentrations de lipides bioactifs de l’échantillon d’essai pour la cellule. Lysates. Normalisez ces valeurs en divisant la concentration déterminée de lipides bioactifs par le nombre de cellules par plaque ou la protéine totale normalisée lors des étapes précédentes. Les données de surveillance de réactions multiples indiquent plusieurs acides linoléique et arachidonique.

Les métabolites oxydés. 13 et neuf, tiennent avec les 13 et neuf Oxo ode correspondants sont dérivés de l’acide linoléique. De plus, les métabolites de la chaleur de l’acide arachidonique et leurs produits oxydés sont également présents comme prévu.

Il y a un léger décalage dans le temps de rétention de l’étalon interne déclassé par rapport à l’étalon non étiqueté. Il est important de noter que ce protocole sépare également la chaleur et les bois et détermine des transitions uniques pour les isomères stéréo qui peuvent résulter de l’oxydation enzymatique d’un acide arachidonique ou d’une réaction avec des espèces réactives de l’oxygène. Par exemple, ce chromatogramme montre la séparation entre les isomères stéréo r et s de cinq.

L’analyse lipidomique thermique est une technique puissante pour l’analyse de nombreuses espèces de lipides. Par exemple, cette expérience évalue et quantifie les prostaglandines, les isop sènes et les leucotriènes B quatre. En plus des chaleurs consommées par Oxo et des métabolites oméga-hydroxylés, cette méthode peut être optimisée pour l’extraction de lipides bioactifs à partir d’autres matrices biologiques telles que le plasma, l’urine et les tissus.

Dans certains cas, des lipides bioactifs ont été utilisés comme biomarqueurs de réponse au stress oxydatif.