Name: Mediante genética inversa para manipular el gen de Sociedades Nacionales del virus de la fiebre de Rift Valley MP-12 Cepa para mejorar la seguridad de la vacuna y la eficacia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Aprende a generar mutantes del virus de la fiebre de Rift Valley cepa MP-12 mediante genética inversa para desarrollar vacunas atenuadas más seguras y eficaces.

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Este trabajo fue financiado por la Subvención Número 5 U54 AI057156-07 a través del Centro Regional del Oeste de Excelencia (WRCE), 1 R01-A1 AI08764301 del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas, y un financiamiento interno del Centro Sealy para el Desarrollo de Vacunas de la Universidad de Texas Medical Branch.

<ol><li>Bird, B. H., Ksiazek, T. G., Nichol, S. T., Maclachlan, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Vet.+Med.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus.</a> J. Am. Vet. Med. Assoc. 234, 883-893 (2009).</li>
<li>Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+infectious+rift+valley+fever+virus+entirely+from+cDNA%2C+analysis+of+virus+lacking+the+NSs+gene%2C+and+expression+of+a+foreign+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rescue of infectious rift valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene.</a> J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).</li>
<li>Billecocq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+I-mediated+expression+of+viral+RNA+for+the+rescue+of+infectious+virulent+and+avirulent+Rift+Valley+fever+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase I-mediated expression of viral RNA for the rescue of infectious virulent and avirulent Rift Valley fever viruses.</a> Virology. 378, 377-384 (2008).</li>
<li>Habjan, M., Penski, N., Spiegel, M., Weber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T7+RNA+polymerase-dependent+and+-independent+systems+for+cDNA-based+rescue+of+Rift+Valley+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">T7 RNA polymerase-dependent and -independent systems for cDNA-based rescue of Rift Valley fever virus.</a> J. Gen. Virol. 89, 2157-2166 (2008).</li>
<li>Gerrard, S. R., Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NSm+proteins+of+Rift+Valley+fever+virus+are+dispensable+for+maturation%2C+replication+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The NSm proteins of Rift Valley fever virus are dispensable for maturation, replication and infection.</a> Virology. 359, 459-465 (2007).</li>
<li>Billecocq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSs+protein+of+Rift+Valley+fever+virus+blocks+interferon+production+by+inhibiting+host+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">NSs protein of Rift Valley fever virus blocks interferon production by inhibiting host gene transcription.</a> J. Virol. 78, 9798-9806 (2004).</li>
<li>May, N. L. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TFIIH+transcription+factor%2C+a+target+for+the+Rift+Valley+hemorrhagic+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus.</a> Cell. 116, 541-550 (2004).</li>
<li>Ikegami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+NSs+protein+promotes+post-transcriptional+downregulation+of+protein+kinase+PKR+and+inhibits+eIF2alpha+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation.</a> PLoS Pathog. 5, e1000287-e1000287 (2009).</li>
<li>Habjan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSs+protein+of+Rift+valley+fever+virus+induces+the+specific+degradation+of+the+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">NSs protein of Rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase.</a> J. Virol. 83, 4365-4375 (2009).</li>
<li>Garcia-Sastre, A., Biron, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+interferons+and+the+virus-host+relationship%3A+a+lesson+in+detente%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Type 1 interferons and the virus-host relationship: a lesson in detente.</a> Science. 312, 879-882 (2006).</li>
<li>Bon, A. L. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+i+interferons+potently+enhance+humoral+immunity+and+can+promote+isotype+switching+by+stimulating+dendritic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Type i interferons potently enhance humoral immunity and can promote isotype switching by stimulating dendritic cells in vivo.</a> Immunity. 14, 461-470 (2001).</li>
<li>Le Bon, A., Tough, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Links+between+innate+and+adaptive+immunity+via+type+I+interferon%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Links between innate and adaptive immunity via type I interferon.</a> Curr. Opin. Immunol. 14, 432-436 (2002).</li>
<li>Tough, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+interferon+as+a+link+between+innate+and+adaptive+immunity+through+dendritic+cell+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Leuk.+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Type I interferon as a link between innate and adaptive immunity through dendritic cell stimulation.</a> Leuk. Lymphoma. 45, 257-264 (2004).</li>
<li>Ito, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+recovery+of+rabies+virus+from+cloned+cDNA+using+a+vaccinia+virus-free+reverse+genetics+system%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Improved recovery of rabies virus from cloned cDNA using a vaccinia virus-free reverse genetics system.</a> Microbiol. Immunol. 47, 613-617 (2003).</li>
<li>Terasaki, K., Murakami, S., Lokugamage, K. G., Makino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+tripartite+RNA+genome+packaging+in+Rift+Valley+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of tripartite RNA genome packaging in Rift Valley fever virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 804-809 (2010).</li>
<li>Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+bovine+respiratory+syncytial+virus+%28BRSV%29+from+cDNA%3A+BRSV+NS2+is+not+essential+for+virus+replication+in+tissue+culture%2C+and+the+human+RSV+leader+region+acts+as+a+functional+BRSV+genome+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter.</a> J. Virol. 73, 251-259 (1999).</li>
<li>Diaz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homozygous+deletion+of+the+alpha-+and+beta+1-interferon+genes+in+human+leukemia+and+derived+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Homozygous deletion of the alpha- and beta 1-interferon genes in human leukemia and derived cell lines.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5259-5263 (1988).</li>
<li>Mosca, J. D., Pitha, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+and+posttranscriptional+regulation+of+exogenous+human+beta+interferon+gene+in+simian+cells+defective+in+interferon+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis.</a> Mol. Cell. Biol. 6, 2279-2283 (1986).</li>
<li>Constantinescu, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+signaling+specificity+of+the+IFNAR+chain+of+the+type+I+interferon+receptor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Expression and signaling specificity of the IFNAR chain of the type I interferon receptor complex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10487-10491 (1995).</li>
<li>Kumar, K. G., Tang, W., Ravindranath, A. K., Clark, W. A., Croze, E., Fuchs, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF%28HOS%29+ubiquitin+ligase+mediates+the+ligand-induced+down-regulation+of+the+interferon-alpha+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">SCF(HOS) ubiquitin ligase mediates the ligand-induced down-regulation of the interferon-alpha receptor.</a> EMBO J. 22, 5480-5490 (2003).</li>
<li>Kakach, L. T., Suzich, J. A., Collett, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+M+segment%3A+phlebovirus+expression+strategy+and+protein+glycosylation.+Virology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus M segment: phlebovirus expression strategy and protein glycosylation. Virology.</a> 170, 505-510 (1989).</li>
<li>Kakach, L. T., Wasmoen, T. L., Collett, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+M+segment%3A+use+of+recombinant+vaccinia+viruses+to+study+Phlebovirus+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus M segment: use of recombinant vaccinia viruses to study Phlebovirus gene expression.</a> J. Virol. 62, 826-833 (1988).</li>
<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li>
<li>Muller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+clone+13%2C+a+naturally+attenuated+avirulent+isolate+of+Rift+Valley+fever+virus%2C+which+is+altered+in+the+small+segment%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 53, 405-411 (1995).</li>
<li>Le May, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SAP30+complex+inhibits+IFN-beta+expression+in+Rift+Valley+fever+virus+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">A SAP30 complex inhibits IFN-beta expression in Rift Valley fever virus infected cells.</a> PLoS Pathog. 4, e13-e13 (2008).</li>
<li>Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSs+Protein+of+Rift+Valley+Fever+Virus+Promotes+Post-Translational+Downregulation+of+the+TFIIH+Subunit+p62%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">NSs Protein of Rift Valley Fever Virus Promotes Post-Translational Downregulation of the TFIIH Subunit p62.</a> J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).</li>
<li>Taniguchi, T., Ogasawara, K., Takaoka, A., Tanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF+family+of+transcription+factors+as+regulators+of+host+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IRF family of transcription factors as regulators of host defense.</a> Annu. Rev. Immunol. 19, 623-655 (2001).</li>
<li>Marie, I., Durbin, J. E., Levy, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+viral+induction+of+distinct+interferon-alpha+genes+by+positive+feedback+through+interferon+regulatory+factor-7%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Differential viral induction of distinct interferon-alpha genes by positive feedback through interferon regulatory factor-7.</a> EMBO J. 17, 6660-6669 (1998).</li>
<li>Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+NSs+mRNA+is+transcribed+from+an+incoming+anti-viral-sense+S+RNA+segment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus NSs mRNA is transcribed from an incoming anti-viral-sense S RNA segment.</a> J. Virol. 79, 12106-12111 (2005).</li>
<li>Mims, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+Fever+virus+in+mice.+I.+General+features+of+the+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Exp.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Rift Valley Fever virus in mice. I. General features of the infection.</a> Br. J. Exp. Pathol. 37, 99-109 (1956).</li>
<li>Bouloy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+evidence+for+an+interferon-antagonistic+function+of+rift+valley+fever+virus+nonstructural+protein+NSs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs.</a> J. Virol. 75, 1371-1377 (2001).</li>
<li>Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+lacking+NSm+proteins+retains+high+virulence+in+vivo+and+may+provide+a+model+of+human+delayed+onset+neurologic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus lacking NSm proteins retains high virulence in vivo and may provide a model of human delayed onset neurologic disease.</a> Virology. 362, 10-15 (2007).</li>
</ol>

No tenemos nada que revelar.

Invertir los sistemas de la genética para RVFV han sido desarrollados por varios grupos mediante la utilización de promotor T7 2,4,5 o ratón de 3 o 4 humanos promotor de Pol-i. En este artículo, se describe un protocolo para generar recombinantes RVFV MP-12 cepas mediante el uso de células BHK/T7-9 15 que expresan establemente T7 ARN polimerasa. La eficiencia de la recuperación viral variado dependiendo de la condición de BHK/T7-9 las células, la cantidad de plásmidos, el núme...

<table border="1"><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Medio esencial mínimo (MEM)-alfa </td><td> Invitrogen </td><td> 32561037 </td><td></td></tr><tr><td> Medio esencial modificado de Dulbecco mínimo </td><td> Invitrogen </td><td> 11965092 </td><td></td></tr><tr><td> Modificado Medio Eagle (MEM 2x) </td><td> Invitrogen </td><td> 11935046 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina-estreptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td><td></td></tr><tr><td> Higromicina B </td><td> Cellgro </td><td> 30 a 240-CR </td><td></td></tr><tr><td> Triptosa fosfato de caldo </td><td> MP Biomedicals </td><td> 1682149 </td><td></td></tr><tr><td> Agar Noble </td><td> VWR </td><td> 101170-362 </td><td></td></tr><tr><td> Transit-LT1 </td><td> Mirus </td><td> MIR2300</td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985070 </td><td></td></tr><tr><td> Tapa hermética de aerosol </td><td> Eppendorf </td><td> C-2223-25 </td><td></td></tr><tr><td> 0,33% de solución de rojo neutro </td><td> Sigma Aldrich </td><td> N2889-100ML </td><td></td></tr><tr><td> C57/WT MEF células </td><td> Invivogen </td><td> MEF-c57wt </td><td></td></tr><tr><td> Blasticidin S </td><td> Invivogen </td><td> Ant-V-1 </td><td></td></tr><tr><td> Zeocin </td><td> Invivogen </td><td> ant-Zn-1 </td><td></td></tr><tr><td> Quanti-Blue </td><td> Invivogen </td><td> rep-QB1 </td><td></td></tr><tr><td> BHK/T7-9 células 15 </td><td> Universidad de Gifu, Japón </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Células Vero E6 </td><td> ATCC </td><td> CRL-1586 </td><td></td></tr></table>

mediante genética inversa para manipular el gen de sociedades nacionales del virus de la fiebre de rift valley mp-12 cepa para mejorar la seguridad de la vacuna y la eficacia

Using Reverse Genetics to Manipulate the NSs Gene of the Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain to Improve Vaccine Safety and Efficacy

Valle del Rift virus de la fiebre (RVFV), que causa la fiebre hemorrágica, trastornos neurológicos o ceguera en los seres humanos, y una alta tasa de aborto y de malformaciones fetales en los rumiantes 1, ha sido clasificado como HHS / USDA se superponen agente de seleccionar un agente patógeno y el nivel 3. Pertenece al género Phlebovirus de la familia Bunyaviridae, y es uno de los miembros más virulenta de esta familia. Varios sistemas de genética inversa para la cepa RVFV MP-12 2,3 vacuna, así como las cepas salvajes RVFV 4-6, incluyendo ZH548 y ZH501, se han desarrollado desde el año 2006. El MP-12 cepa (que es un grupo de riesgo 2 y un agente patógeno no seleccionar) está muy atenuado por varias mutaciones en su M y L-segmentos, pero todavía lleva virulenta S-segmento de ARN 3, que codifica una virulencia funcional factor, NSS. El rMP12-C13type (C13type) la realización de 69% en el marco de la eliminación de Sociedades Nacionales ORF carece de todas las funciones conocidas Sociedades Nacionales, al mismo tiempo que se replica como eficient al igual que el MP-12 en células que carecen de VeroE6 tipo I IFN. Sociedades Nacionales induce una desconexión de la transcripción de host, entre ellos el interferón (IFN) beta-ARNm 7,8 y promueve la degradación de la doble hélice de proteína quinasa dependiente de ARN (PKR) en el nivel post-traduccional 9,10. IFN-beta es transcripcionalmente regulado al alza por el interferón factor regulador 3 (IRF-3), NF-kB y la proteína activadora-1 (AP-1), y la unión de IFN-beta de IFN-alpha/beta receptor (IFNAR) estimula la transcripción de IFN-alfa genes u otros genes de interferón estimulado (ISGs) 11, lo que induce a las actividades de acogida antiviral, mientras que la supresión de acogida transcripción incluyendo IFN-beta de genes por Sociedades Nacionales evita que el gen de los upregulations ISGs en respuesta a la replicación viral a pesar de la FIC-3, NF-kB y activador proteína-1 (AP-1) puede ser activada por RVFV7. . Por lo tanto, NSS es un excelente objetivo para atenuar aún más MP-12, y para mejorar las respuestas inmunitarias del huésped natural por la abolición de la función de supresión de IFN-beta. Aquí, Se describe un protocolo para la generación de una proteína recombinante MP-12 Sociedades Nacionales de codificación mutado, y proporcionar un ejemplo de un método de cribado para identificar mutantes que carecen de Sociedades Nacionales de la función de reprimir IFN-beta síntesis de ARNm. Además de su papel esencial en la inmunidad innata, el tipo de IFN-I es importante para la maduración de las células dendríticas y la inducción de una respuesta adaptativa inmune 12-14. Por lo tanto, la inducción de mutantes Sociedades Nacionales de tipo I IFN son más atenuados, pero al mismo tiempo son más eficientes para estimular respuestas inmunes del huésped de tipo salvaje MP-12, que los convierte en candidatos ideales para los enfoques de vacunación.

A la inversa sistema de genética de la cepa del virus de la fiebre del Valle del Rift MP-12 vacuna es una herramienta útil para la creación de nuevas MP-12 mutantes con mayor atenuación e inmunogenicidad. Se describe el protocolo para la generación y caracterización de cepas mutantes Sociedades Nacionales.

Mediante genética inversa para manipular el gen de Sociedades Nacionales del virus de la fiebre de Rift Valley MP-12 Cepa para mejorar la seguridad de la vacuna y la eficacia

El virus de la fiebre del valle del Rift (RVFV), que provoca fiebre hemorrágica, trastornos neurológicos o ceguera en humanos, y una elevada tasa de abortos y muerte fetal...

Este procedimiento genera el virus recombinante del Nilo Occidental cepa MP 12 que expresa NSS mutado mediante genética inversa y tiene como objetivo caracterizar los fenotipos para el desarrollo de vacunas. Primero, utilizando un sistema de transfección en células Bhk T seven nine, que expresan establemente la ARN polimerasa T seven, se recuperan mutantes recombinantes de la cepa MP 12; luego se amplifica el mutante recombinante recuperado de la cepa MP 12 en células Vero E six y se titran los mutantes MP 12 amplificados mediante ensayo de placas. El paso final del procedimiento consiste en analizar la ausencia de supresión de interferón alfa o beta por las proteínas NS mutantes.En última instancia, los resultados pueden facilitar la preparación de una vacuna viva atenuada candidata para la fiebre del Valle de Rift mediante un sistema de genética inversa. La principal ventaja de esta técnica frente al método existente, como la introducción aleatoria de mutaciones en el genoma viral mediante nitrógeno químico o pasajes seriados, es la capacidad de introducir mutaciones específicas en el genoma viral utilizando un sistema genético. Este método puede ayudar a responder preguntas clav

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Los norovirus son la causa principal de gastroenteritis sin embargo, las técnicas moleculares para su caracterización son todavía relativamente nuevos. Aquí mostramos dos diferentes enfoques genética inversa para la recuperación eficiente de los norovirus murino (MNV), el único miembro de este género, que puede ser propagado en cultivos celulares.

Recuperación Genética inversa mediada por norovirus murino Infecciosas

Rescate de arenavirus recombinantes a partir de ADNc clonado, un enfoque conocido como la genética inversa, permite a los investigadores estudiar la función de los productos específicos de genes virales, así como la contribución de los diferentes dominios y residuos específicos, a diferentes aspectos de la biología de los arenavirus . Del mismo modo, las técnicas de genética inversa en líneas celulares aprobados por la FDA (Vero) para el desarrollo de vacunas ofrece nuevas posibilidades para la...

Generación de Arenavirus recombinante para el Desarrollo de Vacunas de la FDA aprobados células Vero

Virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) se ha estudiado ampliamente en los últimos años con el fin de desarrollar nuevos vectores para la vacunación y la terapia, entre otros. Estos estudios han sido posible debido a las técnicas para rescatar virus recombinante a partir de cDNA, tales como las que se describen aquí.

Rescate del virus de la enfermedad de Newcastle recombinante a partir de cDNA

Aquí, se presenta un protocolo para crear un cromosoma artificial bacteriano infeccioso que contiene un ADNc de longitud completa del ARN genómico de cadena positiva del virus de la encefalitis japonesa. Este protocolo se puede utilizar para construir un ADNc funcional de otros virus de ARN de cadena positiva, lo que lo convierte en una poderosa herramienta genómica para estudiar la biología del virus.

Cromosomas artificiales bacterianos: una herramienta de Genómica Funcional para el Estudio de cadena positiva virus de ARN

virus Vaccinia (VV) se ha utilizado ampliamente en la investigación biomédica y la mejora de la salud humana. Este artículo describe un método simple, altamente eficiente para editar el genoma VV usando un sistema de CRISPR-Cas9.

Un enfoque simple y eficiente de construcción de mutantes de virus vaccinia Vectores

Nos informe utilizando una artificial pequeño intronic RNA expresión estrategia para desarrollar un recombinante defectuoso no Aedes aegypti densovirus (AaeDV) en vivo el sistema de entrega. Se describe un procedimiento detallado para la construcción, envases y análisis cuantitativo de los vectores rAaeDV, así como por infección larval.

Uso de un Mosquito recombinante Densovirus como un Vector de la entrega de genes para el análisis funcional de Genes en larvas de mosquitos

Herpesvirus de pavos (HVT) es ampliamente utilizado como una plataforma de vector para la generación de vacunas recombinantes contra enfermedades aviar. Este artículo describe un método simple y rápido para la generación de vacunas vectorizadas HVT recombinantes usando un sistema Cre-Lox y NHEJ-CRISPR/Cas9 integrado.

Generación de vectores recombinantes Herpesvirus aviar con CRISPR/Cas9 Gene edición

Se describe un método para generar y amplificar genéticamente modificados virus sincitiales respiratorios (RSVs) y un ensayo de placa optimizada para RSVs. Ilustramos este protocolo mediante la creación de dos virus recombinantes que respectivamente permiten cuantificación de replicación RSV y análisis de cuerpos de inclusión de RSV y gránulos asociada a cuerpos de inclusión dinámica en vivo.

Generación, amplificación y titulación de virus sincitiales respiratorios recombinantes

La generación de rotavirus recombinantes a partir del ADN plásmido proporciona una herramienta esencial para el estudio de la replicación del rotavirus y la patogénesis, y el desarrollo de vectores de expresión de rotavirus y vacunas. En este documento, describimos un enfoque de genética inversa simplificado para generar rotavirus recombinantes, incluyendo cepas que expresan proteínas fluorescentes de reportero.

Método de Genética Inversa Simplificada para Recuperar Rotavirus Recombinantes Expresando Proteínas Reportero

Este es un método para generar virus de vacuna recombinante "sin cicatrices" utilizando la selección del rango de host y la identificación visual de virus recombinantes.

Generación rápida y sin fisuras de poxvirus recombinantes utilizando el rango de host y la selección visual

El protocolo describe un método para introducir una diversidad genética controlable en el genoma del virus de la hepatitis C mediante la combinación de la síntesis de ARN mutante de longitud completa mediante PCR propensa a errores y genética inversa. El método proporciona un modelo para la selección del fenotipo y se puede utilizar para genomas de virus de ARN de sentido positivo de 10 kb de largo.

Genética inversa para diseñar variantes de virus de ARN de sentido positivo

Aprende a generar mutantes del virus de la fiebre de Rift Valley cepa MP-12 mediante genética inversa para desarrollar vacunas atenuadas más seguras y eficaces.

Mediante genética inversa para manipular el gen de Sociedades Nacionales del virus de la fiebre de Rift Valley MP-12 Cepa para mejorar la seguridad de la vacuna y la eficacia (Video) | JoVE Journal

Mediante genética inversa para manipular el gen de Sociedades Nacionales del virus de la fiebre de Rift Valley MP-12 Cepa para mejorar la seguridad de la vacuna y la eficacia

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