Un protocole pour la détection et de nettoyage en phase gazeuse des radicaux libres dans la fumée de cigarette Mainstream

L'objectif général de cette procédure est de mesurer la quantité de radicaux libres présents dans la fumée principale du tabac et d'évaluer la capacité de piégeage de plusieurs antioxydants. Cela est réalisé en préparant d'abord des filtres contenant plusieurs composés piégeurs différents ainsi que des témoins sans filtre piégeur. Cette préparation est suivie d'une simulation de fumage à l'aide de la fumée de cigarettes de recherche, qui traverse une solution de piégeage par résonance de spin.

La résonance paramagnétique électronique, abrégée en ESR, est ensuite utilisée pour enregistrer les spectres des radicaux piégés ainsi que ceux des échantillons de référence. Les spectres ESR obtenus sont ensuite soumis à une analyse de routine afin de séparer le signal des radicaux piégés en phase gazeuse du bruit de fond et de quantifier la concentration en radicaux à l’aide d’un échantillon de référence. Enfin, les résultats fournissent des informations quantitatives sur la teneur en radicaux libres de la fumée principale de cigarette et des estimations de la capacité de piégeage des antioxydants naturels par spectroscopie ESR avec piégeage de spins.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes d'analyse de la fumée de tabac, telles que la chromatographie en phase gazeuse, est que la RPE est spécifiquement sensible aux radicaux libres. Les implications de cette technique peuvent contribuer à réduire les effets nocifs de la fumée de tabac, car les radicaux libres constituent un groupe majeur de substances cancérigènes. Cette méthode peut fournir des informations précieuses pour l'étude des radicaux libres présents dans la fumée du tabac, et elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, tels que les gaz d'échappement industriels et la fumée de cannabis. Le Centre national de recherche biomédicale pour la technologie de résonance de spin électronique, également connu sous le nom de cert, est le fruit de notre vaste expérience dans le développement de technologies modernes de RPE.

Pour les chercheurs travaillant dans le domaine de la résonance paramagnétique électronique, nous proposons une grande variété de services à leur intention ainsi qu'à celle de la communauté biomédicale. Nous mettons régulièrement nos installations à disposition afin d'introduire des antioxydants dans le filtre des cigarettes. Dissolvez d'abord les antioxydants, le pycnogénol et l'extrait de raisin dans de l'éthanol à 95 %, puis dissolvez le lycopène dans de l'acétone.

Ajustez les volumes de solvant en fonction de la solubilité des antioxydants. Ensuite, mélangez les antioxydants dissous avec du carbone actif en agitant dans des conditions anaérobies pendant environ 12 heures. Les conditions anaérobies sont obtenues en faisant barboter de l'Argonne à travers le mélange pendant l'agitation.

Après l'incubation, filtrer la solution et sécher sous vide. Ensuite, introduire les antioxydants et le carbone dans un filtre en acétate classique en découpant d'abord le filtre en deux morceaux. Insérer les antioxydants végétaux enrobés entre deux morceaux du filtre afin de former un sandwich filtrant à base d'antioxydants, puis réinsérer l'ensemble dans le cylindre en papier de cigarette.

Préparez le filtre témoin de la même manière que le filtre antioxydant, sauf que vous ne devez pas ajouter l'antioxydant avant la mise en place de l'expérience. Les cigarettes de recherche doivent être déballées et conservées dans un environnement à humidité constante à l'aide d'une solution saturée de bromure de sodium pendant au moins deux jours. Récupérez les bâtonnets de cigarette contenant le tabac et fixez-les au filtre combiné.

Effectuer une simulation de fumage pour l'analyse de routine à température ambiante à l’aide d’un dispositif de fumage à un seul orifice, composé d’un aspirateur à eau ou d’une pompe à vide/compresseur d’air relié à l’ensemble de piégeage de spin par une jonction en T dont une extrémité est ouverte. Utiliser un débitmètre pour vérifier le débit de gaz et le régler à environ 2,2 pieds cubes normaux par heure en ajustant une vanne placée entre la pompe et l’échappement. Fumer les cigarettes de recherche avec un volume de bouffée intense de 35 millilitres pendant une durée de deux secondes, et répéter toutes les 60 secondes.

L'extrémité ouverte du dispositif de fumage doit être bouchée pendant l'aspiration et laissée ouverte entre les aspirations. Lorsque l'extrémité est débouchée, il y a peu de tirage à travers la cigarette, ce qui correspond aux conditions entre les aspirations. Effectuez 10 aspirations intenses pour chaque cigarette afin de recueillir les radicaux libres en phase gazeuse en faisant passer la fumée principale de la cigarette à travers un tampon filtre Cambridge, puis introduisez-les dans la solution piégeant les spins.

Le piège à azote liquide élimine la vapeur d'eau de la fumée principale, mais n'affecte pas de manière significative les radicaux en phase gazeuse. Après la dernière bouffée, transférez un aliquot de la solution de piégeage ayant barboté dans un tube à échantillon en verre d'environ 25 cm de long et de trois millimètres de diamètre intérieur. Étant donné que l'oxygène élargit les spectres de RPE et diminue la sensibilité de la méthode, désaérez la solution par la méthode de congélation-pompage-dégel en immergeant d'abord le tube dans de l'azote liquide, puis en évacuant la solution à l'aide d'une pompe à huile, avant de dégeler la solution sous argon.

Répétez plusieurs fois cette méthode de congélation, pompage et décongélation. Ensuite, scellez le tube sous vide. Le tube est désormais prêt.

Pour des mesures supplémentaires de RPE, enregistrez les spectres de RPE en bande X sur un spectromètre Bruker EMX à une fréquence de 9,34 gigahertz. Dans des conditions standard, consultez le protocole écrit pour connaître les réglages typiques du spectromètre utilisés. Pour ces expériences, effectuez 25 accumulations de RPE, ce qui prend généralement environ 20 minutes.

Bien que les pièges à spin soient relativement stables dans les conditions expérimentales après 12 heures, l'intensité des signaux de RPE en solution dans le benzène a diminué d'un facteur cinq. Pour quantifier la concentration de l'adduit piégé, intégrez le spectre initial de la dérivée première de RPE. Le spectre d'absorption obtenu présente un fond large sous forme de singulet, dû très probablement aux produits de suie et de goudron présents dans la fumée.

Après soustraction de ce fond, intégrer le triplet séparé du piège à radicaux. Une fois de plus afin d'obtenir la concentration en radicaux libres. Les valeurs des intégrales doubles pour la solution de piégeage de spins sont comparées à celles d'une solution d'un radical nitroxyde tempo de concentration connue provenant de l'expérience démontrée ici, ainsi qu'aux calculs supplémentaires indiqués dans le protocole écrit.

Une concentration en radicaux libres dans la phase gazeuse de la fumée principale de cigarette d'environ 7,1 fois 10 à la puissance moins neuf molaire a été obtenue. À partir de cela, on a déterminé que le nombre total de radicaux piégés à partir de la phase gazeuse d'une cigarette entière est d'environ 1,5 fois 10 à la puissance 15. Au cours de cette expérience, les mesures initiales ont conduit à des signaux de RPE faibles et à une faible reproductibilité en raison de l'humidité du flux de fumée.

Pour résoudre ce problème, un piège à azote liquide a été ajouté au dispositif de simulation de fumage entre le filtre Cambridge et la solution piège à spin. Le piège à azote liquide éliminait l'eau du flux de fumée principale de cigarette par congélation rapide et la capturait sur la paroi interne du tube en verre. Cela a grandement amélioré les signaux de RPE et permis d'obtenir des résultats hautement reproductibles.

Différents niveaux d'effet piégeant des antioxydants végétaux sur les radicaux libres en phase gazeuse présents dans la fumée principale de cigarette ont été observés, et leurs taux de piégeage sont présentés. Le lycopène et l'extrait de pépins de raisin ont montré les taux les plus élevés, tandis qu'un taux plus faible a été observé pour le pycnogénol. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins d'une heure si elle est effectuée correctement.

Lors de la réalisation de la procédure, il est important de faire passer la fumée à travers un piège à azote liquide. Cela améliore la qualité des spectres de SR et la reproductibilité une fois développés. La technique a aidé les chercheurs en santé et en environnement à explorer et à évaluer la présence de radicaux libres dangereux pour la santé dans divers composés volatils.

Après avoir visionné la vidéo, vous devriez bien comprendre comment quantifier les radicaux libres présents dans la fumée principale du tabac afin de réduire les effets nocifs du tabagisme.