Isoler LacZ cellules exprimant des tissus de la souris oreille interne par cytométrie en flux

L’objectif global de l’expérience suivante est d’isoler les cellules Z positives laxistes de la cochlée de souris néonatale à l’aide de la cytométrie en flux. Ceci est réalisé en isolant d’abord un grand nombre de cochlées de souris dans un laps de temps relativement court pour maintenir les cellules viables et avoir un tissu de départ adéquat. Dans un deuxième temps, les cellules positives de LAX Z sont dissociées puis marquées pour préparer le tissu au tri.

Les cellules sont ensuite triées par cytométrie en flux. Les populations LAX Z élevées et basses qui en résultent peuvent ensuite être utilisées pour d’autres expérimentations. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur l’oreille, telles que les profils génétiques ou les populations cellulaires spécifiques de l’oreille interne.

La démonstration de la procédure sera faite par Taha Gen, un étudiant en médecine de notre laboratoire. Tout d’abord, remplissez des boîtes de Pétri de 35 millimètres avec HBSS et placez-les sur un bloc de glace. Puis, après avoir utilisé des ciseaux à iris pour décapiter 12 à 15 souris postnatales euthanasiées, axones âgées de zéro à trois jours, deux souris rapporteures lâches et sauvages.

Placez les têtes sur une boîte de Pétri de 60 millimètres sur un bloc de glace. Ensuite, utilisez la pince Dumont numéro cinq et des ciseaux à iris pour exciser la mandibule et la langue des têtes, puis coupez à travers la base du crâne au niveau de la palette. Retirez maintenant la peau sus-jacente du vil et transectez la base du crâne en insérant les ciseaux dans la partie inférieure du foramen magnum jusqu’au milieu du palais.

Faites une autre incision avec les ciseaux du bord coupé du palais jusqu’à l’aspect supérieur du vil des deux côtés. Veiller à ne pas endommager la capsule otique. Complétez ensuite l’isolement de l’os temporal en faisant 2 incisions inclinées à 45 degrés, en commençant par l’aspect supérieur du cadre et du magnum s’étendant jusqu’à la coupe coronale au palais dur.

Ensuite, placez les os temporaux isolés dans les boîtes de Pétri de 35 millimètres contenant HBSS sur le bloc de glace et transférez le bloc de glace dans une hotte de dissection stérile. Ensuite, remplissez une autre boîte de Pétri de 35 millimètres, cette fois avec du PBS et placez-la sur le bloc de glace. À l’aide de deux pinces numéro 55.

Commencez la microdissection en retirant doucement le cortex, le tronc cérébral et le cervelet de l’os temporal recouvrant la capsule otique. Ensuite, sans retirer la capsule otique, écaillez des parties de la capsule cochléaire en commençant à l’entrée du nerf cochléaire vestibulaire et en continuant dans la capsule otique. Suite à l’exposition de la base de la cochlée, retirez doucement l’organe du corti et les tissus environnants.

Ensuite, en commençant par la base, retirez le ganglion spiralé et la strie restants et transférez la cochlée dans la boîte de Pétri remplie de la première pipette PBS. 50 microlitres de PBS stérile au centre d’un à deux puits d’une boîte de culture non enrobée à six puits. Ensuite, ne transférez pas plus de 20 axin, deux cochlées lâches dans chaque gouttelette de PBS.

Ensuite, préchauffez 50 microlitres d’aliquotes de 0,125 % de trypsine pendant environ deux minutes dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Et puis ajoutez la trypsine à la cochlée. En prenant soin de ne pas secouer le plat.

Incuber la cochlée à 37 degrés Celsius pendant huit minutes. Terminez la trypsine en ajoutant 50 microlitres d’inhibiteur de tripsine de soja à chaque gouttelette, puis ajoutez 50 microlitres supplémentaires de milieu complet après avoir réglé une pipette P 200 à 125 microlitres. Utilisez une pointe de pipette émoussée de 300 microlitres pour tâter doucement les cellules 80 fois, en faisant attention de ne pas créer de bulles.

Ensuite, après que chaque gouttelette a été triturée, ajoutez 200 microlitres supplémentaires de milieu complet à chacune. Eh bien, passez maintenant les cellules à travers une passoire de cellules de 40 microns dans un nouveau puits. Dans la même plaque à six puits, puis transférez les cellules de chaque puits vers des tubes de fax standard individuels.

Ensuite, ajoutez 100 microlitres de cellules de type sauvage dans chacun des trois tubes, suivi d’une dilution avec 300 microlitres de milieu complet pour le CUG uniquement. Contrôle dilué 10 microlitres d’axone, deux cellules LAX Z dans 390 microlitres de milieu plein. Transférez les deux cellules Z laxistes restantes dans des tubes de fax en OT de 400 microlitres.

Ensuite, après avoir incubé les tubes dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes, ajoutez 200 microlitres de CUG dilué dans chaque tube de fax approprié. Ensuite, en protégeant tous les tubes de la lumière, incubez les cellules dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius pendant 25 minutes. Pour la coloration pendant l’incubation des cellules, placez 10 millilitres de tas fraîchement préparés plus FBS dans un tube de 15 millilitres et placez le tube sur de la glace.

Ajoutez ensuite 1,8 millilitre de la solution de tas glacée à chacun des tubes de télécopie sous le capot stérile avec les lumières éteintes pour minimiser l’exposition à la lumière. Ensuite, centrifugez les cellules à 1200 tr/min pendant cinq minutes à température ambiante. Retirez ensuite le surnageant et remettez les granulés en suspension dans 300 microlitres de milieu plein.

Regrouper toutes les aliquotes pour le tri de l’échantillon, puis ajouter de l’iodure de propidium dans chaque tube approprié jusqu’à une concentration finale d’un microgramme par millilitre. Enfin, après avoir recouvert les cellules, une fois de plus, placez-les sur de la glace. Configurez les portes de tri en collectant d’abord 1000 événements des cellules de type sauvage non colorées pour déterminer la distribution des cellules sur le graphique de dispersion avant ou latéral.

Ajustez les paramètres de diffusion avant et latérale si nécessaire. Compensez ensuite avec l’axone de type sauvage non coloré, le type sauvage coloré PI et l’axone coloré CUG. Deux cellules LAX Z.

Remplissez deux tubes de télécopie avec 500 microlitres de support complet. Ensuite, commencez l’analyse avec la porte des cellules colorées PI de type sauvage et de l’axone deux Lae CUG pour exclure les débris sur la base du graphique de dispersion avant par rapport au graphique latéral. Excluez les doublets et les amas à l’aide du tracé de la hauteur de diffusion vers l’avant par rapport à la zone de diffusion vers l’avant.

Ensuite, excluez les cellules mortes PI positives en fonction de l’aire de diffusion directe par rapport au graphique à cinq aires PE sci. Pour chaque emplacement de marche, établissez un tracé de la zone de diffusion vers l’avant par rapport à la zone en cascade ou à la zone bleue du Pacifique. Analysez 10 000 événements à partir du tube d’échantillon de tri contenant deux cellules colorées à l’axone, à l’AP laxiste et au CUG en utilisant toutes les portes définies avec les cellules de type sauvage, à l’aide de tracés à partir des cellules de type sauvage.

Créez des portes pour les cellules hautes bleues en cascade qui représentent moins de 1 % du nombre total d’événements. La cascade Blue High Gates devrait maintenant contenir environ 15 à 20 % des cellules de l’échantillon lâche d’Axon Two. Faire en sorte que ces cellules élevées de l’axone deux à l’aide du graphique d’analyse des cellules laxistes d’Axon two crée maintenant une porte pour le moins de grippe, 15 à 20 % des cellules utilisant la stratégie de porte susmentionnée.

Triez les cellules dans les tubes de télécopie contenant le support plein, en gardant les tubes de collecte dans une chambre refroidie à quatre degrés Celsius pendant le tri. Enregistrez le nombre de cellules comptées par le cytomètre en flux pour chaque population dans ces deux figures. Les zones de diffusion latérales par rapport aux zones de diffusion vers l’avant du type wild dissocié à gauche et de l’axone deux LA Z à droite.

Les cellules cochléaires sont représentées. Notez le déclenchement des groupes distincts d’événements d’une taille beaucoup plus grande que les événements plus proches de l’axe Y désignés comme la population négative pour les débris. Généralement, 40 à 45 % de cellules exemptes de débris sont récupérées à la fois de type sauvage et de deux cochlées LAX Z dans ces deux panneaux.

La hauteur de diffusion vers l’avant par rapport à la zone de diffusion vers l’avant est utilisée pour exclure les doublets des débris précédemment bloqués. Les événements démographiques négatifs qui s’écartent de la nature linéaire attendue de la parcelle sont exclus. Cette préparation produit généralement 71,1 % d’événements à l’intérieur de la porte désignée. Ici.

L’iodure de propidium, détecté par le canal PE SCI à cinq, est utilisé pour exclure les cellules mortes observées dans ces nuages de points. Environ 95 % des cellules triées étaient viables et n’occupaient pas de PI PI dans ces panneaux. Le canal bleu Cascade a été utilisé pour détecter le substrat fluorescent CUG, comme le montre la figure de droite.

En moyenne, les cellules positives les plus élevées, soit environ 20 % de CUG, sont des cellules hautes qui correspondent à environ 15 000 axones, soit deux cellules élevées pour 10 à 12 animaux. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer et d’isoler les cellules hautes laxistes à l’aide de la cytométrie en flux des tissus de l’oreille interne pour les expériences de Turing cellulaire et les expériences telles que le profilage génétique.