Quantitatifs et automatisé à haut débit du génome à l'échelle écrans ARNi dans C. elegans

L'objectif global de cette procédure est d'évaluer la fonction des gènes de manière quantitative et d'observer l'élégance à l'échelle du génome. Cela est réalisé en premier lieu par la réduction de l'expression de chaque gène par RNA eye, dans des plaques de 96 puits.

Ensuite, le test pertinent pour la fonction du gène est effectué. Dans cet exemple, la capacité de l'élégance marine à répondre normalement à une infection fongique est évaluée en analysant l'expression d'un rapporteur fluorescent inductible. Puis une analyse quantitative automatisée est effectuée à l'aide du Coss bio sortt, finalement, l'analyse de traits quantifiables tels que l'expression d'un gène rapporteur fluorescent montre des sous-ensembles de gènes qui sont nécessaires pour moduler des voies particulières, régissant le développement, le comportement ou la physiologie.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans différents domaines où l'on observe l'élégance, tels que le développement, la neurobiologie, ainsi que les interactions hôte-pathogènes. Nous avons eu l'idée de cette méthode pour la première fois lorsque les premiers criblages RNA eye à grande échelle ont été publiés par le laboratoire Oranger. Il a fallu des efforts considérables pour développer les outils nécessaires et perfectionner l'automatisation.

Je vais démontrer la procédure avec Olivia ti, une scientifique stagiaire et une assistante de recherche du laboratoire Jonathan Eubanks Pour fabriquer 10 à 12 plaques de 96 puits. Commencez par préparer 100 millilitres de milieu de croissance de nématodes ou NGM dans de l'eau désionisée. Veuillez consulter le protocole écrit pour obtenir des instructions.

Pendant que le milieu est encore chaud, ajoutez 100 microgrammes par millilitre d'ampicilline, 12,5 microgrammes par millilitre de tétracycline quatre millimoles d'IPTG et répartissez rapidement 75 microlitres dans chaque puits d'une plaque à fond plat de 96 puits. Vérifiez et retirez immédiatement toutes les bulles d'air présentes dans les puits. Conservez les plaques dans une chambre humide à quatre degrés centigrades.

Ensuite, préparez 96 plaques à puits profonds en ajoutant 1,5 millilitre de LB contenant de l'ampicilline et de la tétracycline. Ajoutez à chaque puits une étiquette ou un code-barres unique. Couvrez chaque plaque et conservez-la à quatre degrés centigrades si elle est préparée à l'avance, agitez la plaque de stock LB à 96 puits contenant le RNAI.

Les clones bactériens avec ampicilline, tétracycline et glycérol, et répartissez trois microlitres de chaque clone bactérien dans le puits correspondant d'une plaque à 96 puits profonds préalablement préparée. Utilisez des puits vides pour les contrôles. Couvrez les 96 plaques à puits profonds avec un film adhésif et incubez-les toute la nuit à 37 degrés centigrades avec agitation. Placez la plaque réplicate à 96 puits utilisée à moins 80 degrés Celsius le matin suivant la culture nocturne.

Transférez les plaques NGM à 96 puits de quatre degrés centigrades à un cabinet de flux laminaire stérile et laissez-les se réchauffer et sécher pendant cinq à quinze minutes. Ensuite, ajoutez l'étiquette ou le code-barres approprié à chaque plaque. Récupérez les plaques de culture nocturne à 96 puits dans l'incubateur.

Observez les cultures bactériennes en croissance réussie par centrifugation. Les plaques à 96 puits profonds pendant cinq minutes à 4 000 tr/min. Égouttez le surnageant en retournant rapidement la plaque à l'envers et séchez rapidement.

Les bords de la plaque sur une serviette en papier, remettez en suspension le pellet bactérien dans le liquide résiduel par vortexage. Idéalement en utilisant un agitateur dédié afin que chaque plaque reçoive précisément le même traitement. Transférez cinq microlitres du Res remis en suspension des bactéries sur les plaques NGM à 96 puits à l'aide d'une multipipette à huit ou douze canaux.

Évitez de toucher le NGM. Laissez les bactéries sécher sous un cabinet de flux laminaire stérile pendant environ deux heures. Vérifiez régulièrement pour éviter que le NGM ne devienne trop sec. Incubez les plaques RNAI-NGM à 96 puits à 37 degrés centigrades toute la nuit dans une chambre humide.

Référez-vous au protocole écrit pour préparer une population synchronisée de vers après refroidissement des plaques RNAI-NGM à 96 puits à température ambiante. Ajoutez environ 100 à 200 vers dans deux microlitres de M neuf dans chaque puits. Vérifiez que chaque puits contient des vers.

Les vers devraient nager. Laissez les plaques sécher sous un cabinet de flux laminaire stérile pendant un maximum d'une heure. Vérifiez régulièrement les plaques.

Les vers devraient ramper plutôt que nager. Placez les plaques dans une chambre humide à 25 degrés centigrades toute la nuit. Après avoir sélectionné un lot hautement infectieux de Judge Miria spora.

Utilisez le tampon M neuf pour collecter les spores à partir d'une plaque de neuf centimètres. Répartissez quatre microlitres de spores dans chaque puits et vérifiez la présence de spores dans chaque puits. Les vers devraient nager.

Mettez les plaques à sécher sous un cabinet de flux laminaire stérile pendant environ une heure. Vérifiez régulièrement les plaques jusqu'à ce que les vers commencent à ramper. Ensuite, placez les plaques infectées dans une chambre humide à 25 degrés centigrades toute la nuit.

Vérifiez les vers avant l'analyse en les observant rapidement sous un microscope fluorescent pour un développement réussi pour une bonne induction GFP sur le contrôle négatif et pour une fluorescence GFP réduite sur les puits de contrôle positif. Si l'induction est bonne, en utilisant une multipipette à huit ou douze canaux, transférez les vers avec 100 microlitres de 50 millimoles de NACL et 0,05 % de triton dans une nouvelle plaque à 96 puits à fond rond étiquetée ou codée par barres.

Congelez les plaques à moins 80 degrés Celsius jusqu'à l'analyse le jour de l'analyse. Décongelez les plaques congelées à température ambiante. Une fois que les plaques ont dégelé. Procédez à l'analyse automatisée à l'aide du COPA bios.

Sortt la machine traite la plaque puits par puits et analyse les paramètres de chaque ver, tels que leur fluorescence. Transcrivez les informations obtenues à partir de COPA bios sortt dans un fichier Excel pour la vérification de la qualité des données. Ensuite, stockez les données brutes, y compris la densité optique, la longueur axiale et les émissions fluorescentes dans un package limbs pour des analyses quantitatives détaillées ultérieures.

Dans cet expérience, les vers transgéniques exprimaient constitutivement un rapporteur P call 12 ds red et un rapporteur PNLP 29 GFP inductible. Les vers rapporteurs ont été exposés à un clone de contrôle ou RNA eye A-G-F-P-R-N pendant 48 heures. Les panneaux à gauche sont des vers non infectés, et ceux à droite sont des vers 18 heures après infection par D spora.

Lorsque le phénotype d'intérêt est l'expression d'un rapporteur GFP, les puits de gène avec le