Quantitatifs et automatisé à haut débit du génome à l'échelle écrans ARNi dans C. elegans

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer la fonction des gènes de manière quantitative et d'observer l'élégance à une échelle génomique. Cela est réalisé en réduisant d'abord l'expression de chaque gène par ARN interférent, dans des plaques de 96 puits.

Ensuite, le test approprié concernant la fonction du gène est réalisé. Dans cet exemple, la capacité de l'organisme *sea elegance* à répondre normalement à une infection fongique est évaluée en analysant l'expression d'un rapporteur fluorescent inductible. Puis, une analyse quantitative automatisée est effectuée à l'aide du Coss bio sortt. Enfin, l'analyse de caractères quantifiables, tels que l'expression d'un gène rapporteur fluorescent, révèle des sous-ensembles de gènes nécessaires à la modulation de voies particulières, régulant le développement, le comportement ou la physiologie.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans divers domaines où l'on observe de l'élégance, tels que le développement, la neurobiologie, ainsi que les interactions entre l'hôte et les agents pathogènes. Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode lorsque les premiers criblages RNAi à grande échelle sur l'œil ont été publiés par le laboratoire Oranger. Il a fallu des efforts considérables pour développer les outils nécessaires et perfectionner l'automatisation.

Je vais démontrer la procédure conjointement avec Olivia Ti, scientifique membre du personnel et assistante de recherche du laboratoire de Jonathan Eubanks, pour préparer des boîtes de culture de 10 à 1296 puits. Commencez par préparer 100 millilitres de milieu de croissance pour nématodes, ou NGM, dans de l'eau déionisée. Veuillez consulter le protocole écrit pour obtenir les instructions.

Tandis que le milieu est encore tiède, ajouter 100 microgrammes par millilitre d'ampicilline, 12,5 microgrammes par millilitre de tétracycline, quatre millimolaire d'IPTG, puis répartir rapidement 75 microlitres dans chaque puits d'une plaque à 96 puits à fond plat. Vérifier la présence de bulles d'air dans les puits et les éliminer immédiatement. Conserver les plaques dans une chambre humide à quatre degrés Celsius.

Ensuite, préparez des plaques de 96 puits profonds en ajoutant 1,5 millilitre de LB contenant de l'ampicilline et de la tétracycline. Ajoutez une étiquette unique ou un code-barres à chaque puits. Couvrez chaque plaque et conservez-la à quatre degrés Celsius si elle est préparée à l'avance, puis agitez la plaque-mère de 96 puits contenant l'ARNI.

Des clones bactériens avec de l'ampicilline, de la tétracycline et du glycérol, et distribuez trois microlitres de chaque clone bactérien dans le puits correspondant d'une plaque profonde 96 puits préparée au préalable. Utilisez des puits vides comme témoins, couvrez les plaques profondes 96 puits avec un film adhésif et incubez-les toute la nuit à 37 degrés Celsius sous agitation. Placez la plaque de réplication 96 puits utilisée à moins 80 degrés Celsius le matin suivant la culture nocturne.

Transférez les plaques NGM de 96 puits de quatre degrés centigrades vers une cabine de flux laminaire stérile et laissez-les réchauffer et sécher pendant cinq à 15 minutes. Ensuite, ajoutez l'étiquette ou le code-barres approprié à chaque plaque. Récupérez les plaques de culture nocturne en format 96 puits profonds depuis l'incubateur.

Observer les cultures bactériennes ayant bien poussé dans la centrifugeuse. Placer les plaques profondes 96 puits pendant cinq minutes à 4 000 tr/min. Éliminer le surnageant en retournant brusquement la plaque à l’envers et sécher rapidement.

Les bords de la plaque sur une serviette en papier remettent en suspension le culot bactérien dans le liquide résiduel par vortexage. Idéalement, utilisez un agitateur dédié afin que chaque plaque reçoive exactement le même traitement. Transférez cinq microlitres des bactéries remises en suspension dans le milieu Resus sur des plaques NGM à 96 puits à l’aide d’une pipette multipipette à huit ou douze canaux.

Évitez de toucher le NGM. Laissez les bactéries sécher sous une hotte à flux laminaire stérile pendant environ deux heures. Vérifiez régulièrement afin d'éviter que le NGM ne devienne trop sec. Incubez les plaques R-N-A-I-N-G-M de 96 puits pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans une chambre humide.

Se référer au protocole écrit pour préparer une population synchronisée de vers après refroidissement des plaques d'interférence ARN à 96 puits à température ambiante. Ajouter environ 100 à 200 vers dans deux microlitres de M neuf à chacun. Vérifier que chaque puits contient des vers.

Les vers doivent nager. Laisser sécher les boîtes sous une hotte à flux laminaire stérile pendant un maximum d'une heure. Vérifier régulièrement les boîtes.

Les vers doivent ramper plutôt que nager. Placer les boîtes dans une chambre humide à 25 degrés Celsius pendant la nuit. Après avoir sélectionné un lot hautement infectieux de spores de Judge Miria.

Utilisez le tampon M neuf pour recueillir les spores à partir d'une plaque de neuf centimètres de diamètre. Répartissez quatre microlitres de spores dans chaque puits et vérifiez la présence de spores dans chaque puits. Les vers doivent nager.

Placer les boîtes pour les faire sécher sous une hotte à flux laminaire stérile pendant environ une heure. Vérifier régulièrement les boîtes jusqu'à ce que les vers commencent à ramper. Ensuite, placer les boîtes infectées dans une chambre humide à 25 degrés Celsius pendant la nuit.

Vérifiez les vers avant l'analyse en les observant rapidement au microscope à fluorescence afin de confirmer un développement correct, une bonne induction de la GFP dans les puits de contrôle négatif et une fluorescence GFP réduite dans les puits de contrôle positif. Si l'induction est bonne, utilisez une pipette multipipette à huit ou douze canaux pour transférer les vers avec 100 microlitres de NaCl 50 millimolaire et 0,05 % de Triton vers une nouvelle plaque de 96 puits à fond rond, étiquetée ou à code-barres.

Congelez les plaques à moins 80 degrés Celsius jusqu'à l'analyse. Le jour de l'analyse, décongelez les plaques congelées à température ambiante. Une fois les plaques décongelées, procédez à l'analyse automatisée à l'aide du COPA bios.

Le machine Sortt traite la plaque puits par puits et analyse les paramètres de chaque ver, tels que leur fluorescence. Transcrivez les informations obtenues à partir du biosortt COPA dans un fichier Excel afin de vérifier la qualité des données. Ensuite, stockez les données brutes, y compris la densité optique, la longueur axiale et les émissions fluorescentes, dans un paquetage limbs pour des analyses quantitatives détaillées ultérieures.

Dans cette expérience, des vers transgéniques expriment de façon constitutive un rapporteur P call 12 ds rouge et un PNLP 29 GFP inductible. Les vers rapporteurs ont été exposés à un clone témoin ou à un clone A-G-F-P-R-N-A eye pendant 48 heures. Les panneaux situés à gauche montrent des vers non infectés, tandis que ceux de droite montrent des vers 18 heures après infection par D spora.

Lorsque le phénotype d'intérêt est l'expression d'un rapporteur A GFP, les puits de gènes contenant le clone d'ARNi GFP fournissent un contrôle robuste. COPA bios SORTT génère des données numériques pour chaque ver analysé. Ces graphiques montrent la moyenne et l'écart type pour chaque puit de vers transgéniques.

Exprimant constitutivement un rapporteur DS rouge p call 12 et un rapporteur GFP PNLP 29 inductible après ARNi et infection avec diaspora. Le trieur analyse le temps de vol (TOF), qui correspond à la taille des vers, la fluorescence rouge, ainsi que le rapport entre la fluorescence verte et le TOF. Certains clones provoquent des défauts de croissance et/ou affectent l'expression de P 12 DS rouge.

D'autres affectent spécifiquement l'expression des protéines fluorescentes. Par exemple, ce clone particulier cible le gène NS Y, précédemment identifié comme important pour la régulation de NLP 29. La fluorescence verte et rouge ainsi que le TOF sont mesurés en unités arbitraires mais constantes.

L'une des innovations de ce protocole réside dans l'utilisation de plaques congelées afin de reporter leur analyse. La congélation permet de conserver les plaques jusqu'à deux semaines sans modifier sensiblement les résultats, comme indiqué ici. Bien que les valeurs absolues de la fluorescence mesurée puissent être modifiées, leurs rapports relatifs restent similaires.

Lorsque quatre vers portant les transgènes PNLP-29 GFP et Pcall-12 dsRed ont été infectés ou non par Diaspora, chaque boîte a été grossièrement divisée en deux moitiés après 18 heures : une moitié a été analysée immédiatement, tandis que l'autre a été congelée à -80 °C pendant 24 heures avant décongélation. Des valeurs d'analyse pour la taille moyenne, l'opacité et les fluorescences verte et rouge ont été calculées pour chaque échantillon.

Le graphique montre le rapport de la moyenne des échantillons infectés divisée par celle des échantillons non infectés pour les échantillons congelés et vivants présentés ici. À partir d'analyses en double d'une plaque représentative, on obtient les rapports de fluorescence normalisés pour chaque puits, correspondant à la moyenne de fluorescence d'un puits divisée par la moyenne tronquée de la plaque. Une fois maîtrisé, ce protocole permet à un groupe de deux à trois personnes d'effectuer un criblage à l'échelle du génome en deux à trois mois.

La réussite de ce protocole exige une excellente collaboration d'équipe. Les membres de mon groupe ont fourni des efforts considérables pour élaborer un protocole efficace et relativement facile à mettre en œuvre.