Name: Quantitatifs et automatisé à haut débit du génome à léchelle écrans ARNi dans C. elegans /em (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Découvrez un criblage ARN à haut débit automatisé chez C. elegans pour identifier les gènes impliqués dans l'immunité innée antifongique. Cette méthode quantitative permet une analyse rapide et précise des fonctions géniques.

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Nous tenons à remercier D. Braendle, CL Kurz et F. Montañana-Sanchis pour leurs contributions. Ce projet a été soutenu par des subventions de l&#39;ANR et le Conseil Régional PACA, et le financement institutionnel de l&#39;INSERM et le CNRS.

<ol><li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+interference+by+ingested+dsRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specific interference by ingested dsRNA.</a> Nature. 395, 854-854 (1998).</li>
<li>Kamath, R. S., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30, 313-321 (2003).</li>
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<li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-fungal+innate+immunity+in+C.+elegans+is+enhanced+by+evolutionary+diversification+of+antimicrobial+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Anti-fungal innate immunity in C. elegans is enhanced by evolutionary diversification of antimicrobial peptides.</a> PLoS Pathog. 4, e1000105-e1000105 (2008).</li>
<li>Simmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+RNAi+of+C.+elegans+Using+the+Hypersensitive+rrf-3+Strain+Reveals+Novel+Gene+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide RNAi of C. elegans Using the Hypersensitive rrf-3 Strain Reveals Novel Gene Functions.</a> PLoS Biol. 1, e12-e12 (2003).</li>
<li>Couillault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR-independent+control+of+innate+immunity+in+Caenorhabditis+elegans+by+the+TIR+domain+adaptor+protein+TIR-1%2C+an+ortholog+of+human+SARM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM.</a> Nat Immunol. 5, 488-494 (2004).</li>
<li>Morton, E., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+suite+of+MATLAB-based+computational+tools+for+automated+analysis+of+COPAS+Biosort+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A suite of MATLAB-based computational tools for automated analysis of COPAS Biosort data.</a> Biotechniques. 48, xxv-xxx (2010).</li>
<li>Rohlfing, A. K., Miteva, Y., Hannenhalli, S., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+physiological+activation+of+osmosensitive+gene+expression+mimics+transcriptional+signatures+of+pathogen+infection+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genetic and physiological activation of osmosensitive gene expression mimics transcriptional signatures of pathogen infection in C. elegans.</a> PLoS One. 5, e9010-e9010 (2010).</li>
<li>Lee, K. Z., Kniazeva, M., Han, M., Pujol, N., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fatty+acid+synthase+fasn-1+acts+upstream+of+WNK+and+Ste20%2FGCK-VI+kinases+to+modulate+antimicrobial+peptide+expression+in+C.+elegans+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">The fatty acid synthase fasn-1 acts upstream of WNK and Ste20/GCK-VI kinases to modulate antimicrobial peptide expression in C. elegans epidermis.</a> Virulence. 1, 113-122 (2010).</li>
<li>Duverger, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+semi-automated+high-throughput+approach+to+the+generation+of+transposon+insertion+mutants+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A semi-automated high-throughput approach to the generation of transposon insertion mutants in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Nucleic Acids Res. 35, e11-e11 (2007).</li>
<li>Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+crawling+and+swimming+locomotory+patterns+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20982-20987 (2008).</li>
<li>Ruzanov, P., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+SAGE+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Deep SAGE analysis of the Caenorhabditis elegans transcriptome.</a> Nucleic Acids Res. 38, 3252-3262 (2010).</li>
<li>Kurz, C. L., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+in+a+dish%3A+high-throughput+analyses+of+bacterial+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Infection in a dish: high-throughput analyses of bacterial pathogenesis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 10, 10-16 (2007).</li>
<li>Okoli, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+antifungal+compounds+active+against+Candida+albicans+using+an+improved+high-throughput+Caenorhabditis+elegans+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of antifungal compounds active against Candida albicans using an improved high-throughput Caenorhabditis elegans assay.</a> PLoS One. 4, e7025-e7025 (2009).</li>
<li>Moy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+antimicrobials+using+a+live-animal+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 10414-10419 (2006).</li>
<li>Ballestriero, F., Thomas, T., Burke, C., Egan, S., Kjelleberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+compounds+with+bioactivity+against+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+by+a+screen+based+on+the+functional+genomics+of+the+marine+bacterium+Pseudoalteromonas+tunicata+D2%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of compounds with bioactivity against the nematode Caenorhabditis elegans by a screen based on the functional genomics of the marine bacterium Pseudoalteromonas tunicata D2.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 5710-5717 (2010).</li>
</ol>

Le laboratoire collabore avec l&#39;Union Ewbank Biometrica et Modul-Bio.

<p class="jove_content"&gt; Le protocole actuel permet dépistage à grande échelle dans l&#39;ARNi<em&gt; C. elegans</em&gt; Sur un milieu solide, en utilisant le niveau d&#39;expression d&#39;un gène rapporteur fluorescent en tant que lecture. Il a été optimisé avec des outils automatisés pour faciliter tests à haut débit, permettant une manipulation facile et rapide d&#39;un grand nombre d&#39;échantillons, d&#39;une manière efficace, fiable et reproductible. D&#39;autres méthodes ont été décrites qui ne reposent pas si lourdement sur la manipulation automatisée des échantillons de liquide<sup&gt; 8</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Un aspect clé de l&#39;organisation au protocole a été le développement d&#39;une méthode robuste de suivi des échantillons, en adaptant le logiciel commercial MBioLIMS à la procédure de l&#39;écran ARNi en collaboration avec le ModulBio entreprise. À chaque étape de la procédure, les plaques sont désormais identifiés par un code barre généré dans le LIMS. Comme le LIMS enregistre également l&#39;identité des clones dans chaque puits sur chaque plaque, allant de bien à gène putatif est simple. Et au-delà de cela, les liens LIMS à la base de données WormBase communauté, permettant un accès direct à des données moléculaires et fonctionnelles sur un gène donné. Le LIMS facilite également les analyses à effectuer sur la plaque ou même au niveau des chromosomes et du génome entier. Pour ces analyses, les données sont stockées d&#39;une manière qui est tout à fait compatible avec les outils décrits précédemment comme COPAmulti<sup&gt; 16</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Un point critique dans la méthode expérimentale est l&#39;ajustement de la quantité de nourriture par rapport au nombre de vers. Pour de nombreux tests, il est essentiel que les vers ne meurent pas de faim à la fin de l&#39;expérience, mais il est également important de ne pas avoir trop de nourriture au début. Nous avons observé qu&#39;une forte densité de nourriture diminue l&#39;induction de fluorescence dans le protocole en utilisant des vers portant le p<em&gt; Nlp-29</em&gt; :: Rapporteur GFP. Cela peut refléter une diminution de l&#39;efficacité d&#39;infection lorsque les vers sont cultivées dans des bactéries trop (BS, résultats non publiés). Dans le même temps, les conditions de culture de la bactérie ARNi est également important, car cela détermine si ARNdb est produite à un niveau optimal. Certains protocoles à grande échelle exigent l&#39;ARNi culture de clones ARNi sur gélose avant l&#39;ensemencement des cultures liquides<sup&gt; 8</sup&gt;. Nous avons obtenu gene silencing robuste en omettant cette étape. Nous avons opté pour un excès de croissance de chaque culture pour assurer des résultats homogènes. Le protocole décrit prévoit en effet suffisamment de matière pour effectuer 2 ou 3 écrans en parallèle. Dans l&#39;intérêt d&#39;obtenir les résultats les plus robustes, nous privilégions, cependant, la réalisation d&#39;écrans en double en utilisant des cultures indépendantes de vers, bactéries et spores fongiques ARNi.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Une autre étape essentielle est liée à l&#39;utilisation de moyennes qui ne soit ni trop humide ni trop sec. Si les plaques ne sont pas assez sèches, la bactérie ARNi ne se dessèche pas correctement et les vers de se baigner pendant l&#39;essai. Cela peut causer des problèmes. Par exemple, les vers ne sont pas efficacement infectées par le<em&gt; D. coniospora</em&gt; Dans un liquide (C Couillault, résultats non publiés). D&#39;autre part, dans des plaques sèches, l&#39;osmolarité du milieu augmente la culture. Cela a des effets directs sur la physiologie ver<sup&gt; 17</sup&gt;, Comprenant l&#39;induction de certains gènes peptides antimicrobiens, tels que<em&gt; 29 nlp</em&gt;<sup&gt; 18</sup&gt;. Le volume utilisé pour distribuer les vers et les spores est essentielle pour permettre un séchage efficace et rapide. Si plus de 10 uL de liquide est ajouté à des plaques fraîches, les puits peuvent prendre plusieurs heures pour sécher. Cela peut signifier qu&#39;il est difficile d&#39;utiliser des méthodes robotiques pour ajouter des vers sur les plaques. Par exemple, chaque ver est distribué par le Biosort dans l&#39;ordre de 1 pl de liquide. Nous distribuons actuellement les vers manuellement que nous permet aussi de surmonter la tendance de vers en solution dans les sédiments.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Nous avons déjà indiqué un ajustement de la Biosort qui permettrait à une plaque de 96 puits à analyser en 36 minutes<sup&gt; 19</sup&gt;. Fabricant de la machine UBI offre maintenant une modification de la Biosort à diminuer encore le temps d&#39;analyse. Avec le &quot;FastReFlex&quot;, les échantillons sont directement acheminé à travers la cellule d&#39;écoulement pour l&#39;analyse, en contournant le filtre à bulles-piège. Il en résulte une réduction significative du temps d&#39;acquisition de données; une plaque entière peut être analysé en 22 min permettant d&#39;environ 20 plaques à traiter par jour. Si les plaques ne sont pas gelés, cependant, il y aurait un intervalle de 8 heures entre les premiers et le dernier. Étant donné la durée relativement courte de l&#39;expérience, avec l&#39;infection qui dure seulement 18 heures, cela pourrait introduire une variable inacceptable dans les plaques. Non seulement les plaques de gel avant l&#39;analyse résoudre ce problème, mais il est également essentiel dans le contexte de l&#39;analyse à haut débit que, avec le protocole standard actuel et de manutention de liquides robots, 2 personnes peuvent facilement traiter jusqu&#39;à 50 plaques par semaine. Actuellement, nous avons l&#39;habitude d&#39;écran 30 plaques par semaine, ce qui permet un écran l&#39;ensemble du génomedoivent avoir lieu en moins de 2 mois.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Une caractéristique intéressante de ce protocole est le fait qu&#39;il utilise la gélose solide, permettant des dosages qui ne peuvent être réalisées en milieu liquide. Comme la physiologie ver diffère selon les conditions de culture<sup&gt; 20,21</sup&gt;, Être capable de réaliser des tests sur milieu solide peut également compléter habituelles à base de liquide écrans. Pour certains phénotypes (par exemple le mouvement), l&#39;analyse peut être effectuée directement avec des plaques de milieu de 96 puits solides. Pour l&#39;écran actuel, cependant, que le Biosort ne pouvons pas échantillonner à partir des plaques de milieu solide, les vers sont d&#39;abord transférés à l&#39;état liquide avant de le congeler. D&#39;autre part, le Biosort COPAS permet une analyse multiparamétrique quantitative compatible avec la mesure de nombreux phénotypes différents. Il est probable que, pour n&#39;importe quel écran donnée ne sont pas tous les paramètres mesurés sera le premier de lecture. Néanmoins, ces mesures peuvent être utiles pour plusieurs raisons. Ils permettent de déterminer si le dosage se sont déroulées correctement. Par exemple, on peut vérifier sur le nombre et la taille des vers dans chaque puits. Ce n&#39;est que lorsque un clone ARNi devrait bloquer la croissance ou la reproduction doit y avoir un écart par rapport aux valeurs attendues. Wells avec moins de 20 vers ou / et des animaux 30% plus petites (TOF) par rapport à un stanstandard de contrôle sans effet sur la croissance (<em&gt; Par exemple GFP (ARNi</em&gt;)) Peuvent être exclus des analyses ultérieures. La fonction de ces clones peuvent être traitées en utilisant un protocole alternatif dans lequel les vers sont exposés à des bactéries ARNi après leur développement est bien avancé<sup&gt; 15</sup&gt;. Les différents paramètres peuvent également être utilisés pour affiner gène candidat (hit) de sélection, par exemple, limiter coups seulement à ceux qui ont une incidence fluorescence verte, mais pas rouge. La méthode choisie pour la sélection précise succès dépendra du type d&#39;écran et de son exacte de lecture. Compte tenu de la complexité des données générées à partir d&#39;un génome quantitative, grand écran, la collaboration avec un statisticien peut être nécessaire.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Le protocole que nous décrivons peut être facilement adaptée à d&#39;autres types de tests. Par exemple, lors de l&#39;étape d&#39;infection<em&gt; D. coniospora</em&gt; Pourrait être remplacé par n&#39;importe quel autre agent pathogène capable d&#39;infecter sur des supports solides. Ce peut être utile comme nous l&#39;avons constaté que bon nombre des facteurs de virulence importants pour l&#39;infection à Serratia marcescens dans une culture liquide ne jouent pas un rôle lors de l&#39;infection en milieu solide (E. Pradel, communication personnelle). Le protocole est également totalement compatible avec les tests de composés chimiques<sup&gt; 22-24</sup&gt;, Ou pour identifier des composés à la bioactivité l&#39;utilisation de bibliothèques différentes de bactéries<sup&gt; 25</sup&gt;, Devrait donc trouver une utilité générale dans le<em&gt; C. elegans</emCommunauté de la recherche&gt;.</p

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> BactoAgar </td><td> BD Diagnostic Systems </td><td> 214010 </td><td></td></tr><tr><td> Ampicilline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9518 </td><td></td></tr><tr><td> Bactopeptone </td><td> BD Diagnostic Systems </td><td> 211677 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Tout fournisseur </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Film adhésif AeraSeal </td><td> Dutscher </td><td> 760214 </td><td></td></tr><tr><td> Isopropylique β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) </td><td> Thermo Scientific </td><td> AB-0481 </td><td></td></tr><tr><td> K 2 HPO 4 </td><td> Tout fournisseur </td><td></td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Tout fournisseur </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> Tout fournisseur </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Tout fournisseur </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> Tout fournisseur </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Tout fournisseur </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Plaque de 96 puits profond </td><td> Thermo Scientific </td><td> AB-0932 </td><td></td></tr><tr><td> Plaque de 96 puits à plat </td><td> FALCON </td><td> 353072 </td><td></td></tr><tr><td> Plaque de 96 puits rond </td><td> FALCON </td><td> 353077 </td><td></td></tr><tr><td> Tétracycline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8032 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Tout fournisseur </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TECAN robots </td><td> TECAN </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Liquidator96 TM </td><td> RAININ </td><td></td><td></td></tr><tr><td> COPAS Biosort </td><td> Union Biometrica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LIMS </td><td> Modul-Bio </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantitatifs et automatisé à haut débit du génome à l&#39;échelle écrans arni dans c. elegans</em

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

L&#39;ARN interférence est une méthode puissante pour comprendre la fonction des gènes, en particulier quand elles sont menées à une échelle du génome entier et dans un contexte quantitatif. Dans C. elegans, la fonction du gène peut être renversé simplement et efficacement en se nourrissant les vers avec des bactéries exprimant un ARN double brin correspondant à un gène spécifique 1. Alors que la création de bibliothèques de clones d&#39;ARNi couvrant la plupart des C. elegans génome 2,3 ouvert la voie à de véritables études génomiques fonctionnelles (voir, par exemple 4-7), la plupart des méthodes établies sont laborieuses. Moy et ses collègues ont mis au point des protocoles semi-automatiques qui facilitent l&#39;échelle du génome écrans 8. L&#39;approche repose sur l&#39;imagerie microscopique et l&#39;analyse d&#39;image. Nous décrivons ici un protocole alternatif pour un haut débit du génome, grand écran, basée sur la manipulation robotique de clones bactériens ARNi, une analyse quantitative à l&#39;aide de la Biosort COPAS (Union Biometrica (UBI)), et unelogiciel intégré: l&#39;MBioLIMS (Laboratory Information Management System de Modul-Bio) une technologie qui offre un débit plus élevé pour la gestion des données et le suivi des échantillons. Procédé permettant écrans à être effectuée sur des plaques de milieu solide. Ceci est particulièrement important pour certaines études, comme celles portant sur ​​les interactions hôte-pathogène dans C. elegans, car certains microbes ne sont pas efficacement infecter des vers dans une culture liquide. Nous montrons comment la méthode peut être utilisée pour quantifier l&#39;importance des gènes dans les anti-fongiques l&#39;immunité innée dans C. elegans. Dans ce cas, l&#39;approche repose sur l&#39;utilisation d&#39;une souche transgénique portant un épiderme infection inductible du gène rapporteur fluorescent, avec la GFP sous le contrôle du promoteur du gène du peptide antimicrobien de la PNL 29 et un journaliste en rouge fluorescent qui est exprimé de façon constitutive dans le épiderme. Celle-ci prévoit un contrôle interne pour l&#39;intégrité fonctionnelle de l&#39;épidermeet non spécifique du transgène taire 9. Lorsque les vers de contrôle sont infectées par le champignon, ils émettent une fluorescence verte. Abattre par ARNi d&#39;un gène requis pour des résultats nlp expression 29 de fluorescence diminuée après l&#39;infection. Actuellement, ce protocole permet à plus de 3000 clones d&#39;ARNi à être testé et analysé par semaine, ouvrant la possibilité de filtrer l&#39;ensemble du génome en moins de 2 mois.

Nous décrivons un protocole à l&#39;aide<em&gt; C. elegans</em&gt; Et les bibliothèques d&#39;alimentation ARNi qui permet la mesure automatisée de plusieurs paramètres tels que la fluorescence, la taille et l&#39;opacité de chaque ver dans une population. Nous donnons un exemple d&#39;un écran pour identifier les gènes impliqués dans la lutte contre l&#39;immunité innée dans fongique<em&gt; C. elegans</em&gt;.

Quantitatifs et automatisé à haut débit du génome à l&#39;échelle écrans ARNi dans C. elegans</em

L'interférence ARN est une méthode puissante pour comprendre la fonction des gènes, particulièrement lorsqu'elle est réalisée à l'échelle du génome entier et dans un contexte quantitatif. Chez C. ...

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer la fonction des gènes de manière quantitative et d'observer l'élégance à une échelle génomique. Cela est réalisé en réduisant d'abord l'expression de chaque gène par ARN interférent, dans des plaques de 96 puits.Ensuite, le test approprié concernant la fonction du gène est réalisé. Dans cet exemple, la capacité de l'organisme *sea elegance* à répondre normalement à une infection fongique est évaluée en analysant l'expression d'un rapporteur fluorescent inductible. Puis, une analyse quantitative automatisée est effectuée à l'aide du Coss bio sortt. Enfin, l'analyse de caractères quantifiables, tels que l'expression d'un gène rapporteur fluorescent, révèle des sous-ensembles de gènes nécessaires à la modulation de voies particulières, régulant le développement, le comportement ou la physiologie.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans divers domaines où l'on observe de l'élégance, tels que le développement, la neurobiologie, ainsi que les interactions entre l'hôte et les agents pathogènes. Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode lorsque les premiers criblages RNAi à grande échelle sur l'œil ont été publiés par le laboratoire Oranger. Il a fallu des efforts considérables pour développer les outils nécessaires et perfectionner l'automatisation.Je vais démontrer la procédure conjointement avec Olivia Ti, scientifique membre du personnel et assistante de recherche du laboratoire de Jonathan Eubanks, pour préparer des boîtes de culture de 10 à 1296 puits. Commencez par préparer 100 millilitres de milieu de croissance pour nématodes, ou NGM, dans de l'eau déionisée. Veuillez consulter le protocole écrit pour obtenir les instructions.Tandis que le milieu est encore tiède, ajouter 100 microgrammes par millilitre d'ampicilline, 12,5 microgrammes par millilitre de tétracycline, quatre millimolaire d'IPTG, puis répartir rapidement 75 microlitres dans chaque puits d'une plaque à 96 puits à fond plat. Vérifier la présence de bulles d'air dans les puits et les éliminer immédiatement. Conserver les plaques dans une chambre humide à quatre degrés Celsius.Ensuite, préparez des plaques de 96 puits profonds en ajoutant 1,5 millilitre de LB contenant de l'ampicilline et de la tétracycline. Ajoutez une étiquette unique ou un code-barres à chaque puits. Couvrez chaque plaque et conservez-la à quatre degrés Celsius si elle est préparée à l'avance, puis agitez la plaque-mère de 96 puits contenant l'ARNI. Des clones bactériens avec de l'ampicilline, de la tétracycline et du glycérol, et distribuez trois microlitres de chaque clone bactérien dans le puits correspondant d'une plaque profonde 96 puits préparée au préalable. Utilisez des puits vides comme témoins, couvrez les plaques profondes 96 puits avec un film adhésif et incubez-les toute la nuit à 37 degrés Celsius sous agitation. Placez la plaque de réplication 96 puits utilisée à moins 80 degrés Celsius le matin suivant la culture nocturne.Transférez les plaques NGM de 96 puits de quatre degrés centigrades vers une cabine de flux laminaire stérile et laissez-les réchauffer et sécher pendant cinq à 15 minutes. Ensuite, ajoutez l'étiquette ou le code-barres approprié à chaque plaque. Récupérez les plaques de culture nocturne en format 96 puits profonds depuis l'incubateur.Observer les cultures bactériennes ayant bien poussé dans la centrifugeuse. Placer les plaques profondes 96 puits pendant cinq minutes à 4 000 tr/min. Éliminer le surnageant en retournant brusquement la plaque à l’envers et sécher rapidement.Les bords de la plaque sur une serviette en papier remettent en suspension le culot bactérien dans le liquide résiduel par vortexage. Idéalement, utilisez un agitateur dédié afin que chaque plaque reçoive exactement le même traitement. Transférez cinq microlitres des bactéries remises en suspension dans le milieu Resus sur des plaques NGM à 96 puits à l’aide d’une pipette multipipette à huit ou douze canaux.Évitez de toucher le NGM. Laissez les bactéries sécher sous une hotte à flux laminaire stérile pendant environ deux heures. Vérifiez régulièrement afin d'éviter que le NGM ne devienne trop sec. Incubez les plaques R-N-A-I-N-G-M de 96 puits pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans une chambre humide.Se référer au protocole écrit pour préparer une population synchronisée de vers après refroidissement des plaques d'interférence ARN à 96 puits à température ambiante. Ajouter environ 100 à 200 vers dans deux microlitres de M neuf à chacun. Vérifier que chaque puits contient des vers.Les vers doivent nager. Laisser sécher les boîtes sous une hotte à flux laminaire stérile pendant un maximum d'une heure. Vérifier régulièrement les boîtes.Les vers doivent ramper plutôt que nager. Placer les boîtes dans une chambre humide à 25 degrés Celsius pendant la nuit. Après avoir sélectionné un lot hautement infectieux de spores de Judge Miria.Utilisez le tampon M neuf pour recueillir les spores à partir d'une plaque de neuf centimètres de diamètre. Répartissez quatre microlitres de spores dans chaque puits et vérifiez la présence de spores dans chaque puits. Les vers doivent nager.Placer les boîtes pour les faire sécher sous une hotte à flux laminaire stérile pendant environ une heure. Vérifier régulièrement les boîtes jusqu'à ce que les vers commencent à ramper. Ensuite, placer les boîtes infectées dans une chambre humide à 25 degrés Celsius pendant la nuit.Vérifiez les vers avant l'analyse en les observant rapidement au microscope à fluorescence afin de confirmer un développement correct, une bonne induction de la GFP dans les puits de contrôle négatif et une fluorescence GFP réduite dans les puits de contrôle positif. Si l'induction est bonne, utilisez une pipette multipipette à huit ou douze canaux pour transférer les vers avec 100 microlitres de NaCl 50 millimolaire et 0,05 % de Triton vers une nouvelle plaque de 96 puits à fond rond, étiquetée ou à code-barres.Congelez les plaques à moins 80 degrés Celsius jusqu'à l'analyse. Le jour de l'analyse, décongelez les plaques congelées à température ambiante. Une fois les plaques décongelées, procédez à l'analyse automatisée à l'aide du COPA bios.Le machine Sortt traite la plaque puits par puits et analyse les paramètres de chaque ver, tels que leur fluorescence. Transcrivez les informations obtenues à partir du biosortt COPA dans un fichier Excel afin de vérifier la qualité des données. Ensuite, stockez les données brutes, y compris la densité optique, la longueur axiale et les émissions fluorescentes, dans un paquetage limbs pour des analyses quantitatives détaillées ultérieures.Dans cette expérience, des vers transgéniques expriment de façon constitutive un rapporteur P call 12 ds rouge et un PNLP 29 GFP inductible. Les vers rapporteurs ont été exposés à un clone témoin ou à un clone A-G-F-P-R-N-A eye pendant 48 heures. Les panneaux situés à gauche montrent des vers non infectés, tandis que ceux de droite montrent des vers 18 heures après infection par D spora.Lorsque le phénotype d'intérêt est l'expression d'un rapporteur A GFP, les puits de gènes contenant le clone d'ARNi GFP fournissent un contrôle robuste. COPA bios SORTT génère des données numériques pour chaque ver analysé. Ces graphiques montrent la moyenne et l'écart type pour chaque puit de vers transgéniques.Exprimant constitutivement un rapporteur DS rouge p call 12 et un rapporteur GFP PNLP 29 inductible après ARNi et infection avec diaspora. Le trieur analyse le temps de vol (TOF), qui correspond à la taille des vers, la fluorescence rouge, ainsi que le rapport entre la fluorescence verte et le TOF. Certains clones provoquent des défauts de croissance et/ou affectent l'expression de P 12 DS rouge.D'autres affectent spécifiquement l'expression des protéines fluorescentes. Par exemple, ce clone particulier cible le gène NS Y, précédemment identifié comme important pour la régulation de NLP 29. La fluorescence verte et rouge ainsi que le TOF sont mesurés en unités arbitraires mais constantes.L'une des innovations de ce protocole réside dans l'utilisation de plaques congelées afin de reporter leur analyse. La congélation permet de conserver les plaques jusqu'à deux semaines sans modifier sensiblement les résultats, comme indiqué ici. Bien que les valeurs absolues de la fluorescence mesurée puissent être modifiées, leurs rapports relatifs restent similaires.Lorsque quatre vers portant les transgènes PNLP-29 GFP et Pcall-12 dsRed ont été infectés ou non par Diaspora, chaque boîte a été grossièrement divisée en deux moitiés après 18 heures : une moitié a été analysée immédiatement, tandis que l'autre a été congelée à -80 °C pendant 24 heures avant décongélation. Des valeurs d'analyse pour la taille moyenne, l'opacité et les fluorescences verte et rouge ont été calculées pour chaque échantillon.Le graphique montre le rapport de la moyenne des échantillons infectés divisée par celle des échantillons non infectés pour les échantillons congelés et vivants présentés ici. À partir d'analyses en double d'une plaque représentative, on obtient les rapports de fluorescence normalisés pour chaque puits, correspondant à la moyenne de fluorescence d'un puits divisée par la moyenne tronquée de la plaque. Une fois maîtrisé, ce protocole permet à un groupe de deux à trois personnes d'effectuer un criblage à l'échelle du génome en deux à trois mois.La réussite de ce protocole exige une excellente collaboration d'équipe. Les membres de mon groupe ont fourni des efforts considérables pour élaborer un protocole efficace et relativement facile à mettre en œuvre.

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