Dépistage du contenu haute sur les maladies neurodégénératives

L'objectif général de l'expérience suivante est d'utiliser des tests à haut débit dans des modèles cellulaires de maladies afin de quantifier les voies altérées dans les maladies neurodégénératives. Pour ce faire, un modèle cellulaire du phénotype de la maladie est introduit dans le système automatisé de culture cellulaire, et les cellules sont incubées jusqu'à l'obtention du nombre cellulaire requis. Les cellules sont ensuite dissociées, comptées et réparties dans des plaques de 96 puits contenant un lentivirus exprimant divers ARNh.

Après six jours de différenciation cellulaire, les cellules sont récupérées du système pour une immunomarquage et une imagerie à haut contenu. Enfin, les images sont analysées à l'aide de divers algorithmes d'analyse afin de quantifier des caractéristiques liées à la santé cellulaire, telles que la croissance neuronale et la fonction mitochondriale.

Les résultats sont également analysés par une ANOVA à deux facteurs dans Novas afin d'identifier les effets d'interaction significatifs. Cette méthode peut accélérer la réponse aux questions clés concernant la fonction des gènes associés aux maladies et les voies dans lesquelles elles s'exercent globalement. Cela conduira ensuite à une meilleure compréhension des mécanismes pathogènes impliqués dans les maladies neurodégénératives.

Pour commencer le processus de culture cellulaire, préparez le système automatisé de culture cellulaire pour l'insertion de plaques de culture cellulaire. Chargez les consommables tels que les pointes de pipette, les plaques de culture cellulaire et les plaques d'essai dans le système. Vérifiez également manuellement qu'il y a suffisamment de milieu de culture cellulaire, de PBS et de trypsine dans le système.

Ensemencez deux plaques de plateau omni avec deux fois 10 à la puissance six cellules par plaque de la lignée cellulaire de neuroblastome SH-SY5Y. Maintenez les cellules dans un milieu optimal contenant 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et placez les plaques sur l'étagère d'entrée du robot de culture cellulaire. À l'aide de l'interface utilisateur graphique (GUI), sélectionnez le protocole de culture de cellules adhérentes A et ajustez les fichiers de paramètres spécifiques à la lignée cellulaire adhérente a de sorte que le seuil de confluence soit fixé à 70 %.

Temps total de mise en place : deux minutes. Instruire le système de préparer de nouvelles plaques Omni Tray avec une concentration cellulaire de deux fois 10 à la puissance six cellules par plaque. Instruire le système de préparer des plaques d'essai par plaque Omni Tray, avec un total de 5 000 cellules par puits, puis incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % CO₂.

Les étapes suivantes sont impliquées dans ce protocole de culture cellulaire d'adhérence. Les plaques sont incubées et observées jusqu'à ce que les cellules atteignent le seuil de confluence prédéfini. Si les cellules n'atteignent pas le seuil de confluence après cinq lectures, les plaques sont retirées du système.

Une fois le seuil de confluence défini par l'utilisateur atteint, les cellules sont lavées, trypsinisées et comptées. Un nombre prédéfini de cellules est ajouté à de nouvelles plaques omni trait, et si le nombre de cellules est suffisant, un nombre spécifié de plaques d'essai est transporté vers la station et un nombre défini de cellules est distribué dans chaque puits. Enfin, les plaques d'essai peuvent être directement imagées à l'aide du microscope intégré ou sorties du système pour un traitement ultérieur afin de commencer la procédure de production de virus.

Inoculer le milieu LB contenant de l'ampicilline avec des stocks bactériens en glycérol contenant les vecteurs HRNA, faire pousser toute la nuit, puis le jour suivant, centrifuger les cellules et éliminer le surnageant ; extraire les plasmides à l'aide du système de purification de plasmides Wizard Magnus. L'ADN plasmidique final contenant l'E EIT est recueilli dans des plaques de 96 puits. Le lentivirus S-H-R-N-A est produit selon les protocoles du RNAi Consortium, une production de lentivirus dans des plaques de 96 puits ; toutes les expériences doivent être réalisées dans un laboratoire de sécurité de niveau ML2 ou BSL2 et tous les réactifs ainsi que consommables utilisés doivent être décontaminés avec du chlore à 30 % après usage.

La procédure de production de lentivirus ne sera pas démontrée dans cette vidéo, mais elle prend quatre jours et comprend les étapes suivantes. Premièrement, les cellules d'emballage sont semées le jour zéro l'après-midi suivant. Le jour un, les cellules d'emballage sont transfectées avec trois plasmides de lentivirus 18 heures après la transfection.

Deuxième jour, le milieu est remplacé par un milieu frais riche en BSA ou en sérum. Vingt-quatre heures après le changement de milieu. Troisième jour, le virus est récolté et le milieu est à nouveau remplacé par un milieu frais riche en BSA ou en sérum.

Enfin, 24 heures après la première récolte du virus, au jour quatre, le virus est à nouveau récolté et les cellules d’emballage sont éliminées afin de calculer la multiplicité d'infection ou MOI du lentivirus. Transduisez les cellules SHSY5Y à l’aide de dilutions sérielles du virus, incubez les cellules à 37 degrés Celsius et analysez-les 72 heures après la transduction. Visualisez l’expression de la GFP au microscope et déterminez le pourcentage de cellules positives à la GFP. Plaquez le lentivirus S-H-R-N-A dans des plaques d’essai avec un MOI de trois. Après avoir mis en place le lentivirus S-H-R-N-A dans les plaques d’essai, insérez les plaques dans le système automatisé de culture cellulaire pour la transduction lentivirale.

Après 24 heures, le milieu des plaques d'essai sera remplacé par un milieu optimal contenant 0,5 % de FBS et 0,1 micromolaire d'acide rétinoïque. Pour débuter le processus de différenciation, poursuivre l'incubation des plaques d'essai dans le milieu de différenciation pendant cinq jours afin d'assurer une inhibition maximale de l'expression du gène cible. Au jour cinq, ajouter de l'H2O à la moitié des plaques d'essai pendant 24 heures afin de stimuler la translocation de la protéine DJ1 vers les mitochondries. Au jour six, ajouter le traceur MIT aux cellules à une concentration finale de 200 nanomolaires par puits et incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Après cela, les plaques peuvent être transportées vers l’imager haute teneur ou imager HC pour l’acquisition d’images. Alternativement, les plaques peuvent être exportées du système pour un traitement ultérieur, tel qu’un marquage immunohistochimique. Pour l’imagerie haute teneur, un total de 30 champs par puits sera imagé à l’aide de l’objectif 20 x visualisé DJ un avec le jeu de filtres fitzy mitochondries, avec le jeu de filtres trixy bêta trois tubuline, avec le jeu de filtres S cinq et les noyaux avec le jeu de filtres UV.

Il s'agit d'un exemple d'images composites de cellules acquises par imagerie à haut contenu. La figure montre trois cellules non traitées dans le panneau A et des cellules traitées avec H2O deux dans le panneau B. DJ one est marqué en vert, les mitochondries en rouge et les noyaux en bleu. Pour déterminer le coefficient de recouvrement moyen entre DJ one et les mitochondries, analyser les images à l'aide de l'application biologique de colocalisation.

Définir les régions d'intérêt. ROI comme suit : ROIA, noyau, figure quatre A et E ; et ROIB, mitochondries, figure quatre B et F. Exclure ROIA de ROIB. Afin de garantir l'analyse uniquement du cytoplasme, définir les mitochondries comme région cible un et DJ un comme région cible deux, figure quatre C et G. Analyser les images à l'aide de l'application bio d'analyse compartimentale com pour déterminer l'intensité moyenne du signal du traceur MIT à l'intérieur des mitochondries.

Figure quatre B et F pour tracer les longueurs moyennes des neurites à partir de la coloration par la bêta-tubuline trois. Analyser les images à l'aide de l'application biologique de profilage neuronal, figure quatre D et H, sur les plaques d'images suivantes, en utilisant le lecteur confocal automatisé opera lx.

Visualisez les mitochondries avec le laser de 561 nanomètres et les noyaux avec une image d'excitation UV. Un total de 30 champs par puits en utilisant l'objectif de 60 x avec immersion dans l'eau. Analysez enfin les images à l'aide de l'algorithme basé sur les caractéristiques texturales de type bord des taches ou crête (SER).

Le filtre de crête SER transmet l'intensité en pixels formant des motifs semblables à des crêtes. Plus les mitochondries sont fragmentées, plus le score de crête SER est élevé. Dans cette vidéo, des tests à haut débit ou tests HC ont été utilisés pour identifier des modulateurs de la protéine DJ-1A, dont la perte provoque un parkinsonisme autosomique récessif.

Ce premier résultat représentatif illustre une interaction épistasique avec DJ1. Le graphique en barres à gauche montre les unités de fluorescence normalisées, et les images à droite montrent des cellules SHSY5Y marquées en rouge avec le traceur mito pour la quantification de la viabilité cellulaire.

On a observé qu'après exposition à la toxine, l'extinction de DJ one dans les cellules entraînait une perte plus importante de la viabilité cellulaire par rapport aux cellules infectées par un lentivirus désordonné. L'extinction du gène cible A produisait un effet similaire à celui observé dans les cellules présentant une extinction de DJ one. Toutefois, l'extinction simultanée de DJ one et du gène cible A entraînait une perte de viabilité cellulaire significativement plus importante que la perte induite par l'extinction de l'un ou l'autre gène seul, ce qui suggère une interaction épistasique entre DJ one et le gène cible A. Cet exemple suivant concerne un gène régulant la translocation de DJ one.

Le graphique en barres montre le coefficient de recouvrement normalisé entre DJ1 et les mitochondries, qui reflète la translocation de DJ1 du cytoplasme vers les mitochondries. Les panneaux A à D sont des images de cellules SHSY5Y marquées en vert pour DJ1, en rouge pour les mitochondries et en bleu pour les noyaux. Lorsque les cellules sont exposées à une toxine, DJ1 se transloque du cytoplasme vers les mitochondries, ce qui se traduit par un coefficient de recouvrement plus élevé entre DJ1 et les mitochondries.

Dans les cellules où le gène cible B a été silencé, moins de DJ une transloque vers les mitochondries lorsque les cellules sont exposées à la toxine, ce qui suggère que le gène cible B est impliqué dans le transport de DJ une vers les mitochondries. Un exemple de gène impliqué dans la croissance neuronale est montré ici. Les longueurs normalisées des neurites sont présentées dans le graphique en barres, et les cellules utilisées pour la quantification des longueurs des neurites sont visibles sur les images, avec la tubuline bêta trois en vert et les noyaux en bleu.

L'extinction du gène cible C dans les cellules SHSY5Y de type sauvage entraîne une augmentation significative de la longueur des neurites par rapport aux cellules infectées par un lentivirus exprimant un ARNsh désordonné. Cet effet est perdu dans les cellules incubées avec la toxine. Enfin, ces résultats montrent un exemple de gène impliqué dans la morphologie mitochondriale.

Les valeurs moyennes de la segmentation des crêtes de la SER mitochondriale pour les cellules SHSY-5Y infectées par un ARN brouillé ou un ARN-H ciblant le gène D sont présentées dans le graphique. L'image A et l'image C sont des images composites de cellules SHSY-5Y infectées respectivement par un ARN brouillé ou un ARN-H ciblant le gène D. Les mitochondries sont colorées en rouge tandis que les noyaux sont colorés en bleu.

Les images B et D sont des visualisations de la quantification des crêtes du RER observées ici. L'infection de cellules SHSY5Y de type sauvage avec un ARNh ciblant le gène D entraîne une augmentation de la valeur de segmentation des crêtes mitochondriales du RER par rapport aux cellules infectées avec un lentivirus désordonné. Cette approche peut ouvrir la voie aux chercheurs dans le domaine de la neurodégénérescence pour explorer et annoter les voies impliquées dans la pathogenèse des maladies de manière opportune.

Cela conduira alors à de meilleures cibles pour le développement thérapeutique.