Name: Dépistage du contenu haute sur les maladies neurodégénératives (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: Découvrez le dépistage haute contenu pour quantifier les voies cellulaires affectées dans les maladies neurodégénératives. Cette méthode combine culture automatisée et imagerie pour étudier la santé neuronale et la fonction mitochondriale.

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1. Processus automatisé adhérente de culture cellulaire (Figure 1) 20 <ol><li> Préparer le système automatisé de culture cellulaire pour l'entrée des boîtes de culture cellulaire. Des consommables de charge (par exemple, des embouts de pipette, des plaques de culture cellulaire, plaques de dosage) dans le système en utilisant l'interface utilisateur graphique (GUI). S'assurer qu'il ya suffisamment de milieux de culture cellulaire, un tampon phosphate salin (PBS) et la trypsine dans le système robotisé. </li><li> Manuellement plaques semences OmniTray deux avec 2 x 10 6 cellules par plaque, de la ligne de neuroblastome SH-SY5Y cellule. Maintenir les cellules de l'Opti-MEM avec 10% de sérum bovin foetal (FBS). Mettez les plaques dans le robot culture cellulaire en utilisant l'interface graphique. Les cellules seront incubées à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Choisissez quelle cellule protocole de culture doit être initié 20. On peut choisir à partir d'un procédé de culture cellulaire adhérente 22, la culture et l'expansion des cellules souches embryonnaires (ES) sur les cellules cellules nourricières de souris 23 ou la culture de la suspension cells 22. </li><li> Sélectionnez le protocole de culture de cellules adhérentes (figure 1) et assurer adhérente de cellules fichiers paramètre de ligne spécifiques sont ajustées de telle sorte que le seuil de la confluence (l'aire de la plaque OmniTray qui contient des cellules) est fixé à 70%. Régler l'heure trypsinisation total de deux minutes. </li><li> Demander au robot pour préparer les plaques OmniTray nouvelle, avec un nombre de cellules de semis de 2 x 10 6 cellules par plaque. </li><li> Plaques OmniTray entrée dans le système de culture cellulaire utilisant le protocole automatisé adhérente de culture cellulaire (figure 1). Ce protocole comporte les étapes suivantes: plaques sont incubées et imagé jusqu'à ce qu'ils atteignent le seuil de la confluence pré-définis. Si les cellules n'atteignent pas le seuil de la confluence dans les 5 lectures, les plaques sont retirés du système. Arrivé au seuil défini par l'utilisateur confluent, les cellules sont lavées, traitées à la trypsine et comptées. Un certain nombre de pré-défini de cellules sont ajoutées à des plaques OmniTray nouvelle et si il ya un nombre suffisant de cellules, un engourdissement spécifiéeer des plaques de dosage sont transportés sur le pont et un nombre défini de cellules distribué dans chaque puits. Plaques de dosage peut être directement imagés à l'aide du microscope intégré ou de sortie du système pour un traitement ultérieur. </li><li> Demandez le système pour préparer quatre plaques de dosage par plaque OmniTray, avec un total de 5000 cellules par puits. </li></ol> 2. la production de virus shRNA et le placage en plaques de dosage (Temps requis: 6 jours) <ol><li> Cultivez stocks de glycérol contenant les vecteurs bactériens shRNA (Open Biosystems, TRC1) la nuit dans 2ml de médias milieu Luria-Bertani contenant 100 ug / ml d'ampicilline (Sigma-Aldrich). </li><li> Extrait plasmides selon le protocole du fabricant (Promega Wizard MagneSil TFX). </li><li> Produire de virus en utilisant l'ARNi Consortium haut débit de production Lentivirales (96 puits) du protocole 24. Travailler avec des lentivirus est relativement sûr car les particules de virus utilisés pour la transduction sont la réplication déficiente et split-stratégies de conditionnement génétique sont utilisées pour leur production. Cependant, quand on travaille avec des lentivirus, d'autres procédures de biosécurité sont nécessaires pour minimiser le risque pour soi et les autres 25. Toutes les expériences doivent être menées dans un laboratoire ou d'MLII BSL2 niveau de sécurité. Tous les plastiques (pipettes, des plats en plastique, les médias) qui ont été en contact avec des particules lentivirus doivent être incubées avec l'eau de Javel pour 24 heures avant l'élimination. </li><li> Calculer la multiplicité d'infection (MOI) de lentivirus par la détermination du pourcentage de cellules GFP-positives à l'aide de la GFP pLKO.1 plasmide (Sigma-Aldrich). </li><li> Lentivirus plaque dans des plaques d'essai, avec une MOI de 3. </li></ol> 3. Transduction lentiviraux et la différenciation neuronale des cellules SH-SY5Y (Temps requis: 6 jours) <ol><li> Les cellules sont ajoutés dans les plaques d'essai (voir étape 1.7). Charge plaques de dosage contenant des lentivirus shRNA dans le système de culture cellulaire automatisé. </li><li> Après 24 heures, les médias sur leplaques de dosage sera changé pour Opti-MEM contenant 0,5% de FBS et 0,1 d'acide rétinoïque uM pour commencer le processus de différenciation. La différenciation des cellules SH-SY5Y permet la visualisation des structures neuritique et synchronise la division cellulaire. </li><li> Poursuivre l'incubation des plaques d'essai dans les médias de différenciation pendant 5 jours. Cela garantit knockdown maximale de l'expression des gènes cibles. </li><li> Au jour 5, ajouter 50 uM H 2 O 2 à la moitié des plaques d'essai pendant 24 heures pour stimuler la translocation de DJ1 aux mitochondries. </li><li> Au jour 6, ajouter CmxROS Mitotracker (Invitrogen) pour les cellules, à une concentration finale de 200 nM par puits et incuber à 37 ° C pendant 30 minutes. </li><li> On peut demander au système de plaques d'image directement en utilisant l'imageur HC ou plaques peuvent être exportés à partir du système pour un traitement ultérieur. </li></ol> 4. Immunomarquage automatisée des plaques d'essai (Temps requis: 2 jours) Qualité d'image est paramount pour la réalisation d'une sensible et fiable HCS. Dommages à la monocouche cellulaire due à pipetage inexactes peuvent conduire à la qualité d'image médiocre et les résultats non reproductibles. Afin de minimiser les dommages couche de cellules, l'immunomarquage a été réalisée en utilisant une station robotique. La procédure est similaire à celui qui a été décrit précédemment, mais 26 a été personnalisé pour augmenter le débit et réduire l'utilisation des consommables. <ol><li> Fixer les cellules avec 100 pl de paraformaldéhyde à 4% de pré-chauffé à 37 ° C. Incuber pendant 20 minutes à température ambiante. </li><li> Laver les cellules avec 200 pi de PBS pendant 5 minutes, 3 fois. </li><li> Incuber les plaques d'essai avec 200 pi de PBS contenant 0,1% de Triton (PBST) pendant 10 minutes. </li><li> Laver les cellules avec 200 pi de PBS pendant 5 minutes, 3 fois. </li><li> Incuber les plaques d'essai avec 200 pi de tampon de blocage (PBST avec 5% de FBS) pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Laver les cellules avec 200 pi de PBS pendant 5 minutes, 3 fois. </li><li> Incuber avec le Follen raison des anticorps primaires nuit à 4 ° C: <ol><li> Chèvre DJ1 N20 (Santa Cruz, 5 pg / ml) </li><li> Lapin β-tubuline III (Sigma-Aldrich, 1 ug / ml) </li></ol></li><li> Le lendemain, laver les cellules avec 200 pi de PBS pendant 5 minutes, 3 fois. </li><li> Incuber les plaques de dosage avec les anticorps secondaires suivants 1 heure à température ambiante: <ol><li> AlexaFluor 488 d'âne anti-chèvre (Invitrogen, 2 pg / ml) </li><li> AlexaFluor 647 chèvre anti-lapin (Invitrogen, 2 pg / ml </li></ol></li><li> Laver les cellules avec 200 pi de PBS pendant 5 minutes, 3 fois. </li><li> Incuber les cellules avec Hoechst (Invitrogen; 1 ug / ml) pendant 10 minutes. </li><li> Laver les cellules avec 200 ul de PBS pendant 5 minutes, 3 fois. </li><li> Plaques Conserver à 4 ° C jusqu'à ce qu'ils puissent être imagé. </li></ol> 5. Haute images par le contenu d'acquisition et d'analyse d'image (Temps requis: 5 jours) <ol><li> Image d'un total de 30 champs par puits en utilisant la lentille de l'objectif 20x. Visualisez DJ1 avec l'IFTC jeu de filtres, les mitochondries avec l'ensemble TRITC filtre, β-tubuline III avec le jeu de Cy5 filtre et les noyaux en utilisant l'ensemble filtre UV (figure 3). </li><li> Analyser les images en utilisant l'analyse compartimentale Bioapplication (Cellomics, ThermoFisher) pour déterminer l'intensité moyenne du signal Mitotracker dans les mitochondries. (Figure 4B, F). </li><li> Pour déterminer le coefficient moyen de chevauchement entre DJ1 et les mitochondries, d'analyser les images en utilisant le bioapplication colocalisation Cellomics (Cellomics, ThermoFisher). Définir des régions d'intérêt (ROI) comme suit: Un retour sur investissement - le noyau (figure 4A, E), le ROI B - mitochondries (figure 4 B, F). Exclure ROI A partir de ROI B pour assurer l'analyse de seulement le cytoplasme. Définir les mitochondries que la région cible I et DJ1 comme cible la région II (figure 4C, G). </li><li> Analyser les images en utilisant le profilage bioapplication neuronale (Cellomics, ThermoFisher) pour tracer la longueur moyenne des neurites de la tubuline β-coloration III (figure4D, H). </li><li> Plaques d'image en utilisant l'Opéra LX automatisés confocale lecteur (Perkin-Elmer). Image d'un total de 30 champs par puits en utilisant la lentille de l'objectif 60x avec immersion dans l'eau. Visualisez mitochondries avec le laser 561 nM et noyaux avec excitation UV. </li><li> Analyser les images en utilisant le Spot-Bord-Ridge (SER) la texture caractéristiques algorithme. Le filtre SER-Ridge transmet l'intensité de pixels formant des crêtes comme des modèles. Le plus fragmenté les mitochondries, plus le score SER-crête (figure 8). </li></ol> 6. La normalisation des données et analyse <ol><li> Importer les données du logiciel d'analyse d'image dans la BioConductor CellHTS2 paquet pour l'environnement logiciel R (R version 2.11.1, la version 2.6 du BioConductor). </li><li> Logarithme de base (2) de transformer les données avant de plaque médiane de normalisation par base 27, 28. Ne pas appliquer l'ajustement de variance par plaque. </li><li> Pour identifier les modificateurs d'un phénotype, utiliser une ANOVA à deux voies entre les différent le traitement des groupes à savoir les cellules infectées non traitées brouillés brouillés vs cellules toxine traitée vs cellules non traitées vs gène cible les cellules traitées gène cible (figures 5-7). </li></ol> 7. Les résultats représentatifs Mutations au sein DJ1 donner lieu à l'apparition au début récessif parkinsonisme 21, mais on ne sait pas comment la perte de DJ1 donne lieu à phénotype de la maladie. Il est connu que les cellules déficientes des DJ1 sont plus sensibles à la mort cellulaire induite par le stress oxydatif et en réponse au stress oxydatif, DJ1 translocation du cytoplasme vers le 29 mitochondries, 30. En construisant des tests HC pour surveiller ces phénotypes, nous pouvons identifier les gènes qui réglementent ou affectent les phénotypes associés à DJ1. Cette approche peut aider à déchiffrer les voies dans lesquelles DJ1 fonctions et qui pourraient être impliquées dans la pathogenèse de la maladie. Exemple d'une interaction avec les épistatique DJ1 (figure 5): Knockdown des DJ1 dans les cellules exposéesaux résultats de toxine dans une plus grande perte de viabilité cellulaire (BAR-B: image-B) par rapport aux cellules infectées par brouillés lentivirus (BAR-A: l'image-A). Knockdown d'un gène cible a un effet similaire à celui observé dans des cellules avec un effet de choc DJ1 (BAR-C: l'image-C). Knockdown des deux DJ1 et gène cible A en résulte une perte nettement supérieure de la viabilité cellulaire que la perte de gènes soit seul (BAR-D:-D l'image). Ceci suggère une interaction entre les épistatique DJ1 et gène cible A. Exemple d'un gène régulant DJ1 translocation (Figure 6): Quand les cellules sont exposées à une toxine, DJ1 translocation du cytoplasme vers les mitochondries, qui est quantifiée par un coefficient plus élevé de chevauchement entre DJ1 et les mitochondries (BAR-A: image Un rapport BAR-C: image C). Dans les cellules où B gène cible a été réduite au silence, moins DJ1 translocation dans la mitochondrie où les cellules sont exposées à la toxine. Ceci suggère que B gène cible est impliqué dans le transport de DJ1 aux mitochondries. (BAR-B: l'image B et BAR-D: l'image D) Exemple d'un gène impliqué dans excroissance neuronale (figure 7): Knockdown de C gène cible dans les cellules de type sauvage des résultats SH-SY5Y à une augmentation significative de la longueur des neurites (BAR-B: image-B) par rapport aux cellules infectées par des lentivirus exprimant brouillés shRNA (BAR-A: image A). Cet effet est perdu dans les cellules incubées avec de la toxine (BAR-C et D). Exemple d'un gène impliqué dans la morphologie mitochondriale (figure 8): L'infection de type sauvage SH-SY5Y avec shRNA ciblage génique résultats D à une diminution de la valeur de segmentation SER-Ridge mitochondriale (figure 8, l'image C et D) par rapport à cellules infectées par brouillés lentivirus (figure 8, l'image A et B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3452/3452fig1_lg.jpg"><img alt="Figure 1." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 1."></a> Figure 1 Schéma du protocole de culture cellulaire automatisé.: ntent "&gt; <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3452/3452fig2_lg.jpg"><img alt="Figure 2." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 2."></a> Figure 2 Vue schématique du processus de dépistage, l'analyse d'image et les méthodes statistiques utilisées lors du processus de dépistage:. I) Les cellules sont cultivées jusqu'à ce qu'elles soient confluentes et ensuite étalées dans des plaques de dosage contenant le lentivirus shRNA. Les cellules sont différenciées pendant 5 jours et la toxine est alors ajouté aux plaques pendant 24 heures. Plaques de dosage sont de sortie du système et immunocolorés. Le montant de temps requis pour chacun des processus est indiqué entre parenthèses. ii) Les données sont acquises en utilisant un imageur HC (viabilité des cellules, des protéines et translocation excroissance neuronale) et un imageur automatisés confocale (morphologie mitochondriale). Les données sont exportées vers CellHTS2 package dans R, de base (2) une transformation logarithmique et normalisée. Deux ANOVA est utilisé pour identifier les interactions significatives entre les différentes variables. Figure 3. Les images composites de cellules acquis par HC imagerie. A) Des cellules non traitées, b) les cellules traitées avec H 2 O 2. DJ1 est marquée en vert, les mitochondries en rouge et les noyaux en bleu. Coloration neurites n'est pas mis en évidence. <img alt="Figure 4." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 4."> Figure 4. Quantification de plusieurs fonctions cellulaires obtenues à partir d'un HCS. JC) non traitée SH-SY5Y. EH) H 2 O 2 traités SH-SY5Y. Une segmentation, E noyaux) et la définition des ROI A, B, F) Identification et quantification des mitochondries B, ROI, C, G) Identification des DJ1, cible de la voie II, D, G) l'identification et le calcul de la longueur des neurites moyenne. Cellules près du bord de l'image sont exclus de l'analyse. Encart images sont des images avant l'analyse. <imgalt src='"/' files></imgalt> Figure 5. Identification d'un gène dans épistasie avec DJ1 (lettres sur les barres correspondent aux inscriptions sur les images). Images de A à D sont SH-SY5Y étiquetés avec Mitotracker CMXRos (rouge) qui a été utilisé pour la quantification de la santé des cellules. <img alt="Figure 6." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig6.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 6."> Figure 6. Identification d'un gène régulant DJ1 translocation (lettres sur les barres correspondent aux inscriptions sur les images). Images de A à D sont SH-SY5Y étiquetés pour DJ1 (vert), les mitochondries (en rouge) et des noyaux (bleu) qui ont été utilisées pour la quantification des DJ1 translocation vers la mitochondrie. <img alt="Figure 7." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig7.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 7."> Figure 7. Identification d'un gène impliqué dans excroissance neuronale (lettres sur les barres correspondent aux inscriptions sur les images). Images de A à D sont SH-SY5Y étiquetés pour β-III tubuline (vert) et des noyaux (bleu) qui ont été utilisées pour la quantification de la longueur des neurites. <img alt="Figure 8." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig8.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 8."> Figure 8. Identification d'un gène impliqué dans la régulation de la morphologie mitochondriale. Image A et C sont des images composites du SH-SY5Y cellules infectées par brouillés shRNA ou un shRNA ciblage génique D respectivement. Les mitochondries sont colorés en rouge, tandis que les noyaux sont colorés en bleu. Image B et D sont des visualisations de la quantification SER-Ridge.

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</ol>

Nous n&#39;avons rien à divulguer

Avec la baisse des coûts de HT / HC systèmes de criblage cellulaire, combinée à la disponibilité de puissants outils de l&#39;échelle du génome de modifier la fonction des gènes, HT / HC écrans deviennent monnaie courante dans les milieux universitaires. L&#39;approche a déjà été appliquée avec succès dans divers domaines de recherche tels que l&#39;identification des cibles médicamenteuses dans le cancer 9, 31-33 et 34-36 et le développement embryonnaire a même potentiel d&#39;application dans le déchiffrement des voies impliquées dans les troubles neuropsychiatriques 37,38. Cependant la mise en œuvre d&#39;un tel système nécessite un investissement important de temps et d&#39;effort avec l&#39;optimisation des processus prenant souvent un minimum de 6 mois. Toutes les étapes, comme les temps de traitement à la trypsine, les vitesses de pipetage et les densités de semis doivent être ajustées, afin de s&#39;assurer que les cellules sont saines et une croissance régulière. Prévention de la contamination bactérienne est l&#39;un des défis les plus difficiles de culture cellulaire automatisé avec des protocoles de nettoyage hebdomadaires dans combination avec constante de rinçage de toutes les lignes portant liquides avec de l&#39;éthanol à 70% étant nécessaire pour les cultures sans contamination. Il sera également nécessaire d&#39;améliorer la robotique afin que les instruments supplémentaires, tels que les microscopes confocaux pour une meilleure résolution et des congélateurs à -80 ° C pour le stockage composé peut être intégré. Il ya aussi des limites qui doivent être abordées pour améliorer la sensibilité, la vitesse et l&#39;utilité de cette méthode pour étudier les réseaux de gènes et d&#39;identifier les gènes impliqués dans les voies pathogènes moléculaires. Pour effectuer un écran HT / HC et s&#39;assurer que les données fiables sont recueillis, plusieurs aspects doivent être optimisés. Tout d&#39;abord, la fiabilité de la mesure est primordiale et dépend de la robustesse et la sensibilité du dosage. Par exemple, les tests décrits ci-dessus sont adaptés pour les petits écrans, mais sont difficiles à mettre en œuvre à l&#39;échelle du génome entier, en raison d&#39;étapes de traitement avant le nombre requis d&#39;acquisition d&#39;image.Ainsi, on aurait pu construire des lignées cellulaires stables exprimant le gène rapporteur, ce qui permettrait à l&#39;imagerie directe et conduire à des variations diminué en raison du nombre réduit d&#39;étapes de traitement. A l&#39;heure actuelle, la conception d&#39;un test qui décrit avec précision et quantifie de manière fiable un phénotype d&#39;intérêt est un obstacle majeur dans le processus de dépistage HC. De nombreux écrans sont menées dans les cellules de mammifères en utilisant différentes bibliothèques d&#39;ARNi, qui souffrent d&#39;effets hors-cible, l&#39;efficacité limitée silençage génique et la couverture du génome incomplet. Ainsi les bibliothèques doivent être faites, qui sont plus spécifiques, puissants et ont une meilleure couverture. Des efforts sont en cours pour créer un tel il est à espérer de tels efforts permettront d&#39;améliorer la reproductibilité des HT / HC SCRE<html> fr hits. Une limitation de nombre de grands écrans de cellules échelle basée sont qu&#39;elles sont conduites dans les cellules de neuroblastome parce qu&#39;elles peuvent être manipulées génétiquement et cultivé à un grand nombre avec une relative facilité. Cependant, la pertinence des «hits» identifiés dans des modèles ex vivo de culture cellulaire pour la fonction in vivo est discutable, surtout que le cerveau se compose de types de cellules hautement spécialisées qui forment un réseau dense et complexe de connexions synaptiques de fonctionner comme une unité hautement intégrée. En conséquence, il est fréquent que les coups identifiées en utilisant la méthode de dépistage décrite ci-dessus, sont validées en utilisant des techniques d&#39;écrans secondaires additionnels et dans plus physiologique des modèles pertinents 39. Pour améliorer la traduction des hits identifiés lors de HCS, des modèles plus représentatifs et plus sophistiquées, telles que des cellules primaires et des cellules souches différenciées ou de co-culture de systèmes ont besoin d&#39;être développé et adapté pour HT / HC approches. ntent &quot;&gt; Avec une combinaison de culture cellulaire automatisé et HC imagerie, on peut rapidement gagner de nouveaux aperçus sur le fonctionnement des neurones et de déterminer quelles voies sont importantes pour le développement des maladies. Combinant HCS / HTS données avec des informations générées par d&#39;autres approches en« omique », il sera alors possible de construire une vue d&#39;ensemble la biologie des systèmes des maladies du cerveau, facilitant ainsi le développement thérapeutique.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> AI.CELLHOST </td><td> HAMILTON </td><td> <a href="http://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/">http://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/</a> </td></tr><tr><td> OPTI-MEM </td><td> INVITROGEN </td><td> 31985-054 </td></tr><tr><td> ACIDE RETINOIQUE </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> R2625 </td></tr><tr><td> PLAQUES OmniTray </td><td> NUNC </td><td> 465219 </td></tr><tr><td> 96 PLAQUES DE CULTURE BIEN </td><td> GRENIER </td><td> 655086 </td></tr><tr><td> DJ1 ANTICORPS N20 </td><td> SANTA CRUZ </td><td> SC27004 </td></tr><tr><td> ANTICORPS TUBULINE BETA-III </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> T3952 </td></tr><tr><td> CMXROS Mitotracker </td><td> INVITROGEN </td><td> M-7512 </td></tr><tr><td> Hoechst-33342 </td><td> INVITROGEN </td><td> H1399 </td></tr><tr><td> PEROXYDE D&#39;HYDROGÈNE </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> 216 763-100ml </td></tr><tr><td> TRYPSINE </td><td> INVITROGEN </td><td> 25050014 </td></tr><tr><td> Phosphate de Dulbecco solution saline tamponnée </td><td> INVITROGEN </td><td> 14190086 </td></tr><tr><td> PROMEGA WIZARD MagneSil TFX </td><td> PROMEGA </td><td> A2380 </td></tr><tr><td> CLONES shARN </td><td> OUVERT BIOSYSTEMS </td><td> <a href="http://www.openbiosystems.com/RNAi/shRNALibraries/TRCLibraryDetails/">http://www.openbiosystems</a>.com / ARNi / shRNALibraries / TRCLibraryDetails / </td></tr><tr><td> BIOAPPLICATIONS Cellomics </td><td> THERMO FISHER- </td><td> <a href="http://www.thermo.com/hcs">http://www.thermo.com/hcs</a> </td></tr></tbody></table>

dépistage du contenu haute sur les maladies neurodégénératives

High Content Screening in Neurodegenerative Diseases

L&#39;annotation fonctionnelle des génomes, la construction de réseaux moléculaires et l&#39;identification des cibles de nouveaux médicaments, sont des défis importants qui doivent être traitées comme une question de grande urgence 1-4. De multiples approches complémentaires en «omique» ont fourni des indices sur les facteurs de risque génétiques et les mécanismes pathogéniques sous-jacente de nombreuses maladies neurodégénératives, mais la plupart des conclusions ont encore besoin de validation fonctionnelle 5. Par exemple, une étude récente du génome entier pour l&#39;association maladie de Parkinson (PD), a identifié plusieurs nouveaux loci comme facteurs de risque pour la maladie, mais la variante sous-jacente responsable (s) ou mécanisme pathogène n&#39;est pas connue 6, 7. Comme chaque région associée peut contenir plusieurs gènes, l&#39;évaluation fonctionnelle de chacun des gènes sur les phénotypes associés à la maladie, en utilisant les techniques traditionnelles de biologie cellulaire serait trop long. Il ya aussi un besoin de comprendre les réseaux moléculaires qui pointentmutations génétiques à l&#39;phénotypes qu&#39;ils causent. Il est prévu que les phénotypes des maladies sont le résultat d&#39;interactions multiples qui ont été perturbés. Reconstruction de ces réseaux moléculaires en utilisant des méthodes traditionnelles prendrait beaucoup de temps. Par ailleurs, les prévisions du réseau à partir d&#39;études indépendant de composants individuels, l&#39;approche réductionniste, ne sera probablement sous-estimer la complexité de 8 réseau. Cette sous-estimation pourrait, en partie, expliquer le faible taux de réussite de l&#39;approbation des médicaments en raison d&#39;effets secondaires indésirables ou toxiques. Gagner un point de vue du réseau de sentiers des maladies liées à l&#39;aide HT / HC approches de dépistage cellulaire, et d&#39;identifier les nœuds clés au sein de ces voies, pourrait conduire à l&#39;identification de cibles qui sont plus adaptés pour l&#39;intervention thérapeutique. Criblage à haut débit (HTS) est une méthode idéale pour répondre à ces questions 9-12. mais les méthodes traditionnelles ont été unidimensionnel tests cellulaires entiers ainsi, celui utilisé simpliSTIC pour les affichages de processus biologiques complexes. Ils ont été incapables de quantifier simultanément les phénotypes observés dans de nombreuses maladies neurodégénératives telles que les déficits du transport axonal ou des altérations dans 13 propriétés morphologiques, 14. Cette approche ne pouvait pas être utilisée pour étudier la nature dynamique des processus cellulaires ou des événements pathogènes qui se produisent dans un sous-ensemble de cellules. Pour quantifier ces caractéristiques on doit passer au multi-dimensionnelle phénotypes appelés à haute teneur de dépistage (HCS) 4, 15-17. HCS est la quantification des cellules à base de plusieurs processus simultanément, ce qui fournit une représentation plus détaillée de la réponse cellulaire aux perturbations par rapport aux différentes HTS. HCS a de nombreux avantages sur HTS 18, 19, mais faire un haut-débit (HT)-haut contenu (SC) l&#39;écran dans des modèles neuronaux est problématique en raison de coûts élevés, la variation de l&#39;environnement et l&#39;erreur humaine. Afin de détecter les réponses cellulaires sur un «Phenomic« échelleen utilisant l&#39;imagerie HC on doit réduire la variation et l&#39;erreur, tout en augmentant la sensibilité et de reproductibilité. Ici, nous décrivons une méthode précise et fiable pour mener des écrans shRNA utilisant la culture cellulaire automatisé 20 et HC imagerie dans des modèles cellulaires neuronales. Nous décrivons comment nous avons utilisé cette méthode pour identifier des modulateurs pour une protéine particulière, DJ1, qui, lorsqu&#39;il est muté entraîne autosomique récessive parkinsonisme 21. Alliant la polyvalence de l&#39;imagerie avec des méthodes HC HT, il est possible de quantifier avec précision une pléthore de phénotypes. Ce pourrait ensuite être utilisé pour faire avancer notre compréhension du génome, les voies impliquées dans la pathogenèse de la maladie ainsi que d&#39;identifier des cibles thérapeutiques potentielles.

Nous décrivons une méthodologie combinant la culture cellulaire automatisé à haute teneur en imagerie pour visualiser et quantifier les multiples processus cellulaires et des structures, de manière à haut débit. De telles méthodes peuvent aider dans l&#39;annotation fonctionnelle des génomes d&#39;autres ainsi que d&#39;identifier des réseaux de gènes des maladies et de cibles thérapeutiques potentielles.

Dépistage du contenu haute sur les maladies neurodégénératives

L'annotation fonctionnelle des génomes, la construction de réseaux moléculaires et l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques sont des défis majeurs qui doivent être...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'utiliser des tests à haut débit dans des modèles cellulaires de maladies afin de quantifier les voies altérées dans les maladies neurodégénératives. Pour ce faire, un modèle cellulaire du phénotype de la maladie est introduit dans le système automatisé de culture cellulaire, et les cellules sont incubées jusqu'à l'obtention du nombre cellulaire requis. Les cellules sont ensuite dissociées, comptées et réparties dans des plaques de 96 puits contenant un lentivirus exprimant divers ARNh.Après six jours de différenciation cellulaire, les cellules sont récupérées du système pour une immunomarquage et une imagerie à haut contenu. Enfin, les images sont analysées à l'aide de divers algorithmes d'analyse afin de quantifier des caractéristiques liées à la santé cellulaire, telles que la croissance neuronale et la fonction mitochondriale.Les résultats sont également analysés par une ANOVA à deux facteurs dans Novas afin d'identifier les effets d'interaction significatifs. Cette méthode peut accélérer la réponse aux questions clés concernant la fonction des gènes associés aux maladies et les voies dans lesquelles elles s'exercent globalement. Cela conduira ensuite à une meilleure compréhension des mécanismes pathogènes impliqués dans les maladies neurodégénératives.Pour commencer le processus de culture cellulaire, préparez le système automatisé de culture cellulaire pour l'insertion de plaques de culture cellulaire. Chargez les consommables tels que les pointes de pipette, les plaques de culture cellulaire et les plaques d'essai dans le système. Vérifiez également manuellement qu'il y a suffisamment de milieu de culture cellulaire, de PBS et de trypsine dans le système.Ensemencez deux plaques de plateau omni avec deux fois 10 à la puissance six cellules par plaque de la lignée cellulaire de neuroblastome SH-SY5Y. Maintenez les cellules dans un milieu optimal contenant 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et placez les plaques sur l'étagère d'entrée du robot de culture cellulaire. À l'aide de l'interface utilisateur graphique (GUI), sélectionnez le protocole de culture de cellules adhérentes A et ajustez les fichiers de paramètres spécifiques à la lignée cellulaire adhérente a de sorte que le seuil de confluence soit fixé à 70 %.Temps total de mise en place : deux minutes. Instruire le système de préparer de nouvelles plaques Omni Tray avec une concentration cellulaire de deux fois 10 à la puissance six cellules par plaque. Instruire le système de préparer des plaques d'essai par plaque Omni Tray, avec un total de 5 000 cellules par puits, puis incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % CO₂.Les étapes suivantes sont impliquées dans ce protocole de culture cellulaire d'adhérence. Les plaques sont incubées et observées jusqu'à ce que les cellules atteignent le seuil de confluence prédéfini. Si les cellules n'atteignent pas le seuil de confluence après cinq lectures, les plaques sont retirées du système.Une fois le seuil de confluence défini par l'utilisateur atteint, les cellules sont lavées, trypsinisées et comptées. Un nombre prédéfini de cellules est ajouté à de nouvelles plaques omni trait, et si le nombre de cellules est suffisant, un nombre spécifié de plaques d'essai est transporté vers la station et un nombre défini de cellules est distribué dans chaque puits. Enfin, les plaques d'essai peuvent être directement imagées à l'aide du microscope intégré ou sorties du système pour un traitement ultérieur afin de commencer la procédure de production de virus.Inoculer le milieu LB contenant de l'ampicilline avec des stocks bactériens en glycérol contenant les vecteurs HRNA, faire pousser toute la nuit, puis le jour suivant, centrifuger les cellules et éliminer le surnageant ; extraire les plasmides à l'aide du système de purification de plasmides Wizard Magnus. L'ADN plasmidique final contenant l'E EIT est recueilli dans des plaques de 96 puits. Le lentivirus S-H-R-N-A est produit selon les protocoles du RNAi Consortium, une production de lentivirus dans des plaques de 96 puits ; toutes les expériences doivent être réalisées dans un laboratoire de sécurité de niveau ML2 ou BSL2 et tous les réactifs ainsi que consommables utilisés doivent être décontaminés avec du chlore à 30 % après usage.La procédure de production de lentivirus ne sera pas démontrée dans cette vidéo, mais elle prend quatre jours et comprend les étapes suivantes. Premièrement, les cellules d'emballage sont semées le jour zéro l'après-midi suivant. Le jour un, les cellules d'emballage sont transfectées avec trois plasmides de lentivirus 18 heures après la transfection.Deuxième jour, le milieu est remplacé par un milieu frais riche en BSA ou en sérum. Vingt-quatre heures après le changement de milieu. Troisième jour, le virus est récolté et le milieu est à nouveau remplacé par un milieu frais riche en BSA ou en sérum.Enfin, 24 heures après la première récolte du virus, au jour quatre, le virus est à nouveau récolté et les cellules d’emballage sont éliminées afin de calculer la multiplicité d'infection ou MOI du lentivirus. Transduisez les cellules SHSY5Y à l’aide de dilutions sérielles du virus, incubez les cellules à 37 degrés Celsius et analysez-les 72 heures après la transduction. Visualisez l’expression de la GFP au microscope et déterminez le pourcentage de cellules positives à la GFP. Plaquez le lentivirus S-H-R-N-A dans des plaques d’essai avec un MOI de trois. Après avoir mis en place le lentivirus S-H-R-N-A dans les plaques d’essai, insérez les plaques dans le système automatisé de culture cellulaire pour la transduction lentivirale.Après 24 heures, le milieu des plaques d'essai sera remplacé par un milieu optimal contenant 0,5 % de FBS et 0,1 micromolaire d'acide rétinoïque. Pour débuter le processus de différenciation, poursuivre l'incubation des plaques d'essai dans le milieu de différenciation pendant cinq jours afin d'assurer une inhibition maximale de l'expression du gène cible. Au jour cinq, ajouter de l'H2O à la moitié des plaques d'essai pendant 24 heures afin de stimuler la translocation de la protéine DJ1 vers les mitochondries. Au jour six, ajouter le traceur MIT aux cellules à une concentration finale de 200 nanomolaires par puits et incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.Après cela, les plaques peuvent être transportées vers l’imager haute teneur ou imager HC pour l’acquisition d’images. Alternativement, les plaques peuvent être exportées du système pour un traitement ultérieur, tel qu’un marquage immunohistochimique. Pour l’imagerie haute teneur, un total de 30 champs par puits sera imagé à l’aide de l’objectif 20 x visualisé DJ un avec le jeu de filtres fitzy mitochondries, avec le jeu de filtres trixy bêta trois tubuline, avec le jeu de filtres S cinq et les noyaux avec le jeu de filtres UV.Il s'agit d'un exemple d'images composites de cellules acquises par imagerie à haut contenu. La figure montre trois cellules non traitées dans le panneau A et des cellules traitées avec H2O deux dans le panneau B. DJ one est marqué en vert, les mitochondries en rouge et les noyaux en bleu. Pour déterminer le coefficient de recouvrement moyen entre DJ one et les mitochondries, analyser les images à l'aide de l'application biologique de colocalisation.Définir les régions d'intérêt. ROI comme suit : ROIA, noyau, figure quatre A et E ; et ROIB, mitochondries, figure quatre B et F. Exclure ROIA de ROIB. Afin de garantir l'analyse uniquement du cytoplasme, définir les mitochondries comme région cible un et DJ un comme région cible deux, figure quatre C et G. Analyser les images à l'aide de l'application bio d'analyse compartimentale com pour déterminer l'intensité moyenne du signal du traceur MIT à l'intérieur des mitochondries.Figure quatre B et F pour tracer les longueurs moyennes des neurites à partir de la coloration par la bêta-tubuline trois. Analyser les images à l'aide de l'application biologique de profilage neuronal, figure quatre D et H, sur les plaques d'images suivantes, en utilisant le lecteur confocal automatisé opera lx.Visualisez les mitochondries avec le laser de 561 nanomètres et les noyaux avec une image d'excitation UV. Un total de 30 champs par puits en utilisant l'objectif de 60 x avec immersion dans l'eau. Analysez enfin les images à l'aide de l'algorithme basé sur les caractéristiques texturales de type bord des taches ou crête (SER).Le filtre de crête SER transmet l'intensité en pixels formant des motifs semblables à des crêtes. Plus les mitochondries sont fragmentées, plus le score de crête SER est élevé. Dans cette vidéo, des tests à haut débit ou tests HC ont été utilisés pour identifier des modulateurs de la protéine DJ-1A, dont la perte provoque un parkinsonisme autosomique récessif.Ce premier résultat représentatif illustre une interaction épistasique avec DJ1. Le graphique en barres à gauche montre les unités de fluorescence normalisées, et les images à droite montrent des cellules SHSY5Y marquées en rouge avec le traceur mito pour la quantification de la viabilité cellulaire.On a observé qu'après exposition à la toxine, l'extinction de DJ one dans les cellules entraînait une perte plus importante de la viabilité cellulaire par rapport aux cellules infectées par un lentivirus désordonné. L'extinction du gène cible A produisait un effet similaire à celui observé dans les cellules présentant une extinction de DJ one. Toutefois, l'extinction simultanée de DJ one et du gène cible A entraînait une perte de viabilité cellulaire significativement plus importante que la perte induite par l'extinction de l'un ou l'autre gène seul, ce qui suggère une interaction épistasique entre DJ one et le gène cible A. Cet exemple suivant concerne un gène régulant la translocation de DJ one.Le graphique en barres montre le coefficient de recouvrement normalisé entre DJ1 et les mitochondries, qui reflète la translocation de DJ1 du cytoplasme vers les mitochondries. Les panneaux A à D sont des images de cellules SHSY5Y marquées en vert pour DJ1, en rouge pour les mitochondries et en bleu pour les noyaux. Lorsque les cellules sont exposées à une toxine, DJ1 se transloque du cytoplasme vers les mitochondries, ce qui se traduit par un coefficient de recouvrement plus élevé entre DJ1 et les mitochondries.Dans les cellules où le gène cible B a été silencé, moins de DJ une transloque vers les mitochondries lorsque les cellules sont exposées à la toxine, ce qui suggère que le gène cible B est impliqué dans le transport de DJ une vers les mitochondries. Un exemple de gène impliqué dans la croissance neuronale est montré ici. Les longueurs normalisées des neurites sont présentées dans le graphique en barres, et les cellules utilisées pour la quantification des longueurs des neurites sont visibles sur les images, avec la tubuline bêta trois en vert et les noyaux en bleu.L'extinction du gène cible C dans les cellules SHSY5Y de type sauvage entraîne une augmentation significative de la longueur des neurites par rapport aux cellules infectées par un lentivirus exprimant un ARNsh désordonné. Cet effet est perdu dans les cellules incubées avec la toxine. Enfin, ces résultats montrent un exemple de gène impliqué dans la morphologie mitochondriale.Les valeurs moyennes de la segmentation des crêtes de la SER mitochondriale pour les cellules SHSY-5Y infectées par un ARN brouillé ou un ARN-H ciblant le gène D sont présentées dans le graphique. L'image A et l'image C sont des images composites de cellules SHSY-5Y infectées respectivement par un ARN brouillé ou un ARN-H ciblant le gène D. Les mitochondries sont colorées en rouge tandis que les noyaux sont colorés en bleu.Les images B et D sont des visualisations de la quantification des crêtes du RER observées ici. L'infection de cellules SHSY5Y de type sauvage avec un ARNh ciblant le gène D entraîne une augmentation de la valeur de segmentation des crêtes mitochondriales du RER par rapport aux cellules infectées avec un lentivirus désordonné. Cette approche peut ouvrir la voie aux chercheurs dans le domaine de la neurodégénérescence pour explorer et annoter les voies impliquées dans la pathogenèse des maladies de manière opportune.Cela conduira alors à de meilleures cibles pour le développement thérapeutique.

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Cet article décrit un nouveau protocole et de réactif mis conçu pour la mesure sensibles des effets neurotoxiques de composés et de traitements sur les co-cultures de neurones et les astrocytes en utilisant l'analyse à haute teneur. Les résultats démontrent que l'analyse de contenu de haute technologie représente un roman passionnant pour l'évaluation de la neurotoxicité.

Un neuronale et astrocytes de co-culture de dosage pour l&#39;analyse du contenu haute de la neurotoxicité

Source : Bétemps, D.,  et al.,  Détection de la α-synucléine associée à la maladie par ELISA amélioré dans le cerveau de souris transgéniques surexprimant la α-synucléine humaine mutée A53T. J. Vis. Exp. (2015). Cette vidéo montre la procédure de détection de la protéine α-synucléine associée aux maladies neurodégénératives dans le tissu cérébral de souris transgéniques à l’aide d’ELISA. Les étapes comprennent l’homogénéisation des tissus, la centrifugation et la détection ELISA de la protéine...

Détection de la protéine α-synucléine associée à une maladie neurodégénérative à l’aide d’un ELISA

Nous présentons une méthode de dépistage rapide et peu coûteuse pour identifier des régulateurs de transcription à l'aide de haut-débit transfections robotiques et un dosage de la luciférase double lueur maison. Ce protocole génère rapidement des données fonctionnelles directes côté-à-côte pour des milliers de gènes et est facilement modifiable pour cibler tout gène d'intérêt.

Criblage à haut débit fonctionnelle utilisant une maison double lueur de dosage de luciférase

Nous décrivons un haut-débit, multiplex, et le liquide céphalorachidien protéomique ciblée (CSF) test développé avec le potentiel pour la traduction clinique. Le test peut quantifier des marqueurs potentiels et les facteurs de risque pour la neurodégénérescence, telles que les variantes de l'apolipoprotéine E (E2, E3 et E4), et mesurer leur expression allélique.

A High Throughput, multiplexée et ciblée protéomique CSF Assay à Quantifier neurodégénératifs Biomarqueurs et apolipoprotéine E isoformes Status

On décrit ici une approche de dépistage comportementale qui peut être utilisée pour cribler des composés qui présentent une efficacité in vivo sur les comportements moteurs cognitifs et fonctionnels dans les modèles de souris transgéniques de la β-amyloïdose et de la tauopathie. Ces méthodes sont optimisées pour filtrer les composés pour l'activité dans des tâches de mémoire à court terme et de travail.

Évaluation de l&#39;alternance spontanée, reconnaissance récente d&#39;objets et assemblage des membres dans les modèles de souris transgéniques de la neuropathologie amyloïde-β et tau

Les auteurs décrivent une méthode pour quantifier l’agrégation des protéines mal repliées. Les détails de notre protocole des gènes induits par cellulaires stables ligne génération automatisée d’imagerie confocale et analyse d’image des agrégats de protéine. Comme application illustrative, nous avons étudié l’effet de petites molécules dans la promotion de SOD1 agrégation en temps - et dose-dépendante.

Développement de dosage pour une Quantification contenue élevée de Formation globale de protéine mutante Sod1 dans les cellules vivantes

Cette méthodologie produit des arbres de décision qui ciblent les groupes de population plus enclins à souffrir d'une déficience cognitive légère et sont utiles pour le dépistage sélectif rentable de la maladie.

Une approche d'apprentissage automatique pour concevoir un dépistage sélectif efficace de l'affaiblissement cognitif léger

Nous présentons un protocole utilisant une approche génétique avancée au dépiste pour des mutants présentant la neurodégénérescence dans le melanogaster de Drosophila. Il intègre un test d'escalade, l'analyse histologique, la cartographie des gènes et le séquençage de l'ADN pour finalement identifier de nouveaux gènes liés au processus de neuroprotection.

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster In Vivo

Nous décrivons la production de cultures mixtes d’astrocytes et de cellules précurseurs d’oligodendrocytes dérivées de cellules souches neurales fœtales ou adultes se différenciant en oligodendrocytes matures, et la modélisation in vitro de stimuli nocifs. Le couplage avec une technique de dépistage à haute teneur à base de cellules permet de construire un système de dépistage de médicaments fiable et robuste.

Analyse de la différenciation et de la maturation de criblage à haute teneur de cultures de cellules souches neurales fœtales et adultes dérivées de cellules souches oligodendrocytes

Les fibroblastes de patients porteurs de mutations dans la maladie de Parkinson pathogènes gènes représentent une forme accessible...

L&#39;utilisation de fibroblastes humains primaires pour la surveillance des phénotypes mitochondriales dans le domaine de la maladie de Parkinson

Découvrez le dépistage haute contenu pour quantifier les voies cellulaires affectées dans les maladies neurodégénératives. Cette méthode combine culture automatisée et imagerie pour étudier la santé neuronale et la fonction mitochondriale.

Dépistage du contenu haute sur les maladies neurodégénératives

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