Champ électrique contrôlé par les migrations des Réalisé cellules progénitrices neurales dans des environnements 2D et 3D

L'objectif général de cette procédure est d'enregistrer l'effet des champs électriques appliqués sur la migration des cellules progénitrices neuronales dans des modèles en culture 2D et ex vivo 3D. Cela est réalisé en isolant et en amplifiant d'abord les cellules progénitrices neuronales in vitro. La deuxième étape consiste à préparer une suspension monocellulaire de cellules progénitrices neuronales.

Ensuite, pour la préparation de cultures en 2D, les cellules progénitrices neuronales sont ensemencées dans des chambres électrotactiques conçues sur mesure. Alternativement, pour la préparation d'un modèle ex vivo en 3D, les cellules progénitrices neuronales sont marquées avec les sondes 3, 3, 3, 4, 2, puis injectées dans un modèle organotypique de tranches de moelle épinière. Enfin, un champ électrique est appliqué aux chambres électrotactiques et un enregistrement en lapse de temps est effectué afin de montrer que les cellules progénitrices migrent vers la cathode du champ électrique, tant dans les environnements en 2D qu'en 3D.

L'avantage principal de cette technique est qu'elle offre une méthode nouvelle pour le suivi en direct de la migration induite par un champ électrique de cellules individuelles après leur transplantation dans un modèle organotypique tridimensionnel, proche de l'environnement naturel. Cette méthode peut non seulement fournir un aperçu du rôle de l'électro-migration des cellules neuronales transplantées dans une tranche de moelle épinière, mais peut également être appliquée à d'autres systèmes, tels que les modèles de tranches cérébrales plus petits. Pour commencer cette procédure, préparez des bandes de verre de 22 par 11 millimètres en divisant au milieu des plaques de 22 par 22 millimètres stérilisées au autoclave.

Couper en deux des lamelles de numéro un à l’aide d’un crayon à pointe de diamant. Ensuite, créer une enceinte en verre autoportante de dimensions intérieures de 22 sur 10 millimètres en collant quatre bandes verticales de 22 sur 11 millimètres ensemble à l’aide de graisse de silicone pour vide élevé, puis laisser durcir complètement toute la nuit. Le jour suivant, fixer deux bandes de verre de 22 sur 11 millimètres parallèlement l’une à l’autre, en laissant un espace de 10 millimètres, sur le fond d’une boîte de culture de 100 millimètres à l’aide de graisse de silicone.

Ensuite, obturer la région entre ces bandes en fixant une lame de couverture de 22 sur 22 millimètres à l'aide de graisse de silicone. Placer la chambre en verre sur les lames de couverture de manière à ce que les parois intérieures forment un espace confiné pour la mise en place des cellules. Étanchéifier toutes les jonctions avec de la graisse de silicone.

Recouvrir cette région restreinte successivement de poly-d-lysine, puis de laminine, comme décrit dans le manuscrit associé. Dans cette procédure, prélever les cerveaux de souris E 14 à E 16 et les placer dans un milieu basal D-M-E-M-F 12 froid. Ensuite, retirer les méninges au microscope anatomique.

Ensuite, transférez les cerveaux dans une boîte de Pétri de 35 millimètres. Utilisez la pince fine pour dissocier les cerveaux en fragments de tissu. Puis transférez-les dans un tube centrifuge de 15 millilitres.

Échantillons à 800 tr/min pendant trois minutes pour éliminer les débris D. Ensuite, ajouter A-D-M-E-M-F 12 contenant BFDF et DGF aux échantillons. Homogénéiser en pipetant avec une pipette de un millilitre.

Ensuite, obtenir une suspension monocellulaire à l’aide d’un tamis cellulaire. Ensemencer les cellules dans les flacons à raison de 20 000 à 50 000 cellules par millilitre. Effectuer ensuite un changement complet de milieu tous les trois jours, ce qui implique une centrifugation des cellules à 1 300 tr/min pendant cinq minutes.

Éliminer le surnageant, suspendre le tissu dans un milieu frais et remettre les cellules dans le flacon tous les six jours après au moins cinq passages. Transférer les NEUROSPHÉROÏDES dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres à 1 500 tr/min pendant cinq minutes. Éliminer le surnageant.

Resuspendre le culot dans des trips contenant du EDTA afin d'obtenir une suspension monocellulaire. Avant d'effectuer un dénombrement cellulaire, préparer un millilitre de suspension contenant 10 000 cellules. Ensuite, retirer la laminine du puits en verre et laisser sécher complètement.

Remplacez-le par un millilitre de suspension cellulaire. Ensuite, placez la boîte dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant au moins quatre heures pour permettre l’attachement. Une fois que les cellules sont suffisamment confluentes, retirez le milieu de la chambre.

Retirez soigneusement le verre. Formez ensuite une couverture au-dessus des cellules en fixant délicatement une lame de verre de 22 par 22 millimètres entre deux bandes de 22 par 11 millimètres à l’aide de graisse de silicone. N’oubliez pas de recouvrir les cellules de quelques gouttes de milieu afin d’éviter qu’elles ne s’assèchent.

Ensuite, former un réservoir de milieu isolé à chaque extrémité de la chambre en créant deux barrières étanches en graisse de silicone s'étendant d'une extrémité de la boîte à l'autre. Remplir la chambre avec du milieu frais, en veillant à établir un écoulement d'un réservoir de milieu à l'autre. Par la suite, replacer la boîte dans l'incubateur pendant 12 heures afin de permettre la récupération des cellules.

À l'étape suivante, préparez un couvercle pour recouvrir la boîte en perçant deux trous, un positionné au-dessus de chaque réservoir de la chambre de migration. Ensuite, remplacez le milieu dans la chambre par un milieu de culture contenant du tampon hippies à 25 millimètres. Puis, transférez la boîte vers le système d'imagerie contrôlé en température.

Définissez les paramètres expérimentaux pour l’enregistrement en laps de temps et en plusieurs positions. Alignez la chambre de manière à ce que la cathode et l’anode soient respectivement à gauche et à droite, afin de garantir que le vecteur du champ électrique s’étende horizontalement, tel qu’observé au microscope et enregistré par le système d’imagerie. Ensuite, remplissez deux béchers.

Avec la solution de Steinberg. Relier un bécher séparé à chaque réservoir de milieu à l’aide des ponts de verre préparés contenant une solution d’agar à 2 % dans la solution de Steinberg. Puis placer les électrodes d’argent, reliées à une alimentation en courant continu, dans la solution de Steinberg.

Dans chaque bécher, régler le bouton de tension de l'alimentation électrique sur zéro et l'allumer. Mesurer la tension aux bornes de la chambre électrotactique à l'aide d'un voltmètre tout en augmentant progressivement le bouton de tension. Puis régler la tension conformément aux exigences de l'expérience.

Après cela, démarrez l'enregistrement en mode laps de temps. Effectuez un changement de milieu et réajustez la tension électrique selon les besoins. Toutes les heures, du milieu frais, des médicaments ou des agents chimiques peuvent être ajoutés aux réservoirs selon les besoins.

À l'aide de trous supplémentaires percés dans le couvercle de la boîte de culture, un situé au-dessus de chaque réservoir de milieu. À cette étape, disséquez les moelles épinières lombaires de souris âgées de deux semaines. Ensuite, découpez les moelles épinières en sections de 500 microns d'épaisseur à l'aide d'un hachoir à tissus Machel Wane sous un microscope anatomique.

Séparez les tranches et sélectionnez celles présentant une structure médullaire axiale sagittale intacte. Ensuite, placez les tranches dans une boîte de Pétri de 100 millimètres contenant 30 microlitres de gel MA. Disposez-les aussi près que possible du centre.

Les maintenir dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant au moins 30 minutes. Pour que les protéines de matri gel s'auto-assemblent et forment un film mince recouvrant la surface des tranches de moelle épinière, il est très important que l'assemblage du matri gel soit complet. Incuber la boîte de Pétri à 37 degrés Celsius pendant encore 30 minutes si nécessaire, puis ajouter quatre à six millilitres de milieu D-M-E-M-F 12 contenant 25 millimolaires de tampon heis et 15 à 20 % de sérum de veau fœtal.

Très doucement, afin d'éviter que le milieu ne s'écoule directement sur les tranches, veillez à ce que celles-ci ne soient pas complètement submergées dans le milieu, en laissant la surface des aubergines bien exposée à l'air. Changez le milieu deux fois par semaine. Incubez maintenant la suspension de cellules progénitrices neuronales dans le milieu contenant cinq micromoles de hooks.

3, 3, 3, 4, 2 pendant 30 minutes. Sous un microscope, utilisez un tube en verre capillaire pour micro-injecter deux microlitres de suspension dans la tranche de moelle épinière. Veillez lentement à ce que le tube en verre capillaire traverse le matrigel et atteigne l'intérieur de la tranche de moelle épinière.

Gardez le tube en verre à l'intérieur de la tranche de moelle épinière pendant au moins 30 secondes afin d'éviter toute suspension cellulaire. Passez rapidement, puis placez la boîte de Pétri contenant la tranche de moelle épinière dans l'incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 cent de dioxyde de carbone pendant la nuit. Le jour suivant, construisez une chambre électrotactique autour de la tranche de moelle épinière contenant des cellules de neurogenèse marquées 3 3 3 4 2 avant d'appliquer un champ électrique mesurant 500 millivolts par millimètre.

Ici, les cellules progénitrices neuronales montrent une migration fortement dirigée vers la cathode lorsqu'elles sont exposées à des champs électriques, les lignes rouges et les flèches bleues représentant respectivement les trajectoires et la direction du déplacement cellulaire. Et voici le tracé des parcours de migration illustrés. Voici les cellules progénitrices neuronales marquées avec les sondes 3 3, 3, 4 2.

Ils ont été transplantés dans la tranche organotypique de moelle épinière au moment du début du traitement par champ électrique. Après que les cellules progénitrices neuronales se soient déplacées de manière directionnelle vers la cathode pendant 2,5 heures, la polarité du champ électrique a été inversée. L'inversion de la polarité du champ électrique a déclenché un brusque retournement de l'axe en direction de la nouvelle cathode.

Voici une image des cellules progénitrices neuronales transplantées au sein d'une coupe de moelle épinière. À la fin de l'enregistrement en lapse de temps, une reconstruction 3D des cellules progénitrices neuronales transplantées au sein de la coupe de moelle épinière est présentée ici. Maîtrise effectuée.

Cette technique peut être réalisée en deux semaines si elle est correctement effectuée après son développement. Cette méthode ouvre désormais la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie cellulaire pour explorer la migration des cellules progénitrices neuronales dans des systèmes de culture en 2D et en 3D en réponse à un champ électrique et son application.