Champ électrique contrôlé par les migrations des Réalisé cellules progénitrices neurales dans des environnements 2D et 3D

L’objectif global de cette procédure est d’enregistrer l’effet des champs électriques appliqués sur la migration des cellules progénitrices neurales dans des cultures 2D et des modèles 3D ex vivo. Pour ce faire, on isole et on étend d’abord les cellules progénitrices neurales des neurones in vitro. La deuxième étape consiste à préparer une suspension cellulaire unique de cellules progénitrices neurales.

Ensuite, pour la préparation de la culture 2D, les cellules progénitrices neurales sont plaquées dans des chambres électrotactiques conçues sur mesure. Alternativement, pour la préparation d’un modèle 3D ex vivo, les cellules progénitrices neurales sont marquées avec les crochets 3, 3, 3, 4, 2 et injectées dans un modèle organotypique de coupe de moelle épinière. En fin de compte, un champ électrique est appliqué aux chambres électriques et un enregistrement en accéléré est effectué pour montrer que les cellules progénitrices migrent vers la cathode du champ électrique dans des environnements 2D et 3D.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit une nouvelle méthode pour le suivi en direct de la migration induite par le champ électrique de cellules individuelles après transplantation dans un modèle organotypique 3D, ressemblant étroitement à l’environnement naturel. Cette méthode peut non seulement fournir un encart dans la technique électro, la migration des cellules neuro-entales transplantées dans la coupe de la moelle épinière, mais peut également être appliquée à d’autres systèmes qui, en tant que modèles de tranche de cerveau, sont petits. Pour commencer cette procédure, préparez des bandes de verre de 22 x 11 millimètres en divisant l’autoclave de 22 x 22 millimètres.

L’épaisseur numéro un du couvercle se glisse en deux à l’aide d’un stylo diamant. Ensuite, créez un puits de verre autoportant de dimensions intérieures, 22 x 10 millimètres en collant quatre bandes verticalement, en plaçant des bandes de 22 x 11 millimètres avec de la graisse silicone sous vide poussé, laissez le puits sécher complètement et durcir pendant la nuit. Le lendemain, fixez 2 bandes de verre de 22 x 11 millimètres parallèles les unes aux autres, en laissant un espace de 10 millimètres à la base d’une boîte de culture de 100 millimètres avec de la graisse de silicone.

Scellez ensuite la zone entre ces bandes en fixant une lamelle de 22 x 22 millimètres avec de la graisse silicone. Placez le puits de verre sur les lamelles de protection afin que les parois intérieures créent un espace confiné pour l’ensemencement des cellules. Imperméabilisez tous les joints avec de la graisse silicone.

Enduire cette région confinée séquentiellement de poly de lycine, suivi de laminine comme décrit dans le manuscrit ci-joint. Dans cette procédure, obtenez les cerveaux des souris E 14 à E 16 et placez-les dans un milieu basal froid D-M-E-M-F 12. Ensuite, retirez les méninges sous un microscope anatomique.

Après cela, transférez les cerveaux dans une boîte de Pétri de 35 millimètres. Utilisez la pince fine pour dissocier le cerveau en fragments de tissu. Transférez-les ensuite dans une centrifugeuse à tube de 15 millilitres.

Les échantillons sont prélevés à 800 tr/min pendant trois minutes pour éliminer les débris D. Ensuite, A-D-M-E-M-F 12 contenant BFDF et DGF aux échantillons. Tritrate les a mangés avec une pipette d’un millilitre.

Obtenez ensuite la suspension à cellule unique avec une passoire à cellules. Plaquez les cellules dans les flacons à raison de 20 000 à 50 000 cellules par millilitre. Ensuite, effectuez un changement complet de milieu tous les trois jours, ce qui implique de centrifuger les cellules à 1 300 tr/min pendant cinq minutes.

Jeter le supinate Resus, suspendre le PT dans un milieu frais et remettre les cellules dans le flacon tous les six jours après au moins cinq. Transférez les NEUROSPHERES dans une centrifugeuse à tube de 15 millilitres à 1 500 tr/min pendant cinq minutes. Jetez le supinate.

Remettre le granulé en suspension dans l’EDTA pour produire une suspension à cellule unique. Avant d’effectuer une numération cellulaire, préparez un millilitre de suspension contenant 10 000 cellules. Ensuite, retirez la laminine du puits de verre et laissez-le sécher complètement.

Remplacez-le par un millilitre de suspension cellulaire. Après cela, placez le plat dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant au moins quatre heures pour permettre les attaches. Une fois que les cellules sont suffisamment cofluentes, retirez le milieu de la chambre.

Retirez délicatement le verre. Ensuite, formez un toit au-dessus des cellules en fixant soigneusement un couvercle en verre autoclave de 22 x 22 millimètres entre 2 bandes de 22 x 11 millimètres avec de la graisse silicone. N’oubliez pas de couvrir les cellules avec quelques gouttes de milieu pour éviter qu’elles ne se dessèchent.

Formez ensuite un réservoir de fluide isolé à chaque extrémité de la chambre en créant deux barrières étanches à la graisse en silicone qui vont d’un bout à l’autre du plat. Remplissez la chambre avec un fluide frais, en assurant un écoulement d’un réservoir de fluide à l’autre. Ensuite, remettez le plat dans l’incubateur pendant 12 heures pour permettre la récupération cellulaire.

À l’étape suivante, préparez un couvercle pour couvrir le plat en perçant deux trous, un positionné sur chaque réservoir de la chambre de migration. Remplacez ensuite le milieu dans la chambre par un milieu de culture contenant un tampon hippies de 25 millimètres. Après cela, transférez la parabole dans le système d’imagerie à température contrôlée.

Définissez les paramètres expérimentaux pour l’enregistrement en accéléré et l’enregistrement multi-positions. Alignez la chambre de manière à ce que la cathode et l’anode soient respectivement à gauche et à droite pour vous assurer que le vecteur de champ électrique se déplace horizontalement tel qu’il est observé au microscope et enregistré dans le système d’imagerie. Ensuite, remplissez deux béchers.

Avec la solution de Steinberg. Connectez un bécher séparé à chaque réservoir de fluide à l’aide des ponts de verre pré-préparés remplis de solution de gélose Steinberg à 2 %. Placez ensuite les électrodes d’argent connectées à une alimentation CC dans la solution Steinberg.

Dans chaque bécher, réglez le cadran de tension de l’alimentation sur zéro et allumez-le. Mesurez la tension à travers la chambre électrotactique avec un voltmètre tout en tournant le cadran de tension. Ajustez ensuite la tension en fonction des exigences expérimentales.

Après cela, démarrez l’enregistrement en accéléré. Effectuez un changement de support et réajustez la tension si nécessaire. Toutes les heures, des médicaments ou des agents chimiques frais et moyens peuvent être ajoutés aux réservoirs au besoin.

À l’aide de trous supplémentaires percés dans le couvercle du plat de culture, un situé au-dessus de chaque réservoir de milieu. Dans cette étape, disséquez la moelle épinière lombaire de souris âgées de deux semaines. Ensuite, coupez les moelles épinières en sections de 500 microns d’épaisseur à l’aide d’un hachoir à tissu machel-wane sous un microscope anatomique.

Séparez les tranches et sélectionnez celles dont la structure de la moelle épinière axiale sagittale est intacte. Ensuite, placez les tranches dans une boîte de Pétri de 100 millimètres contenant 30 microlitres de gel MA. Placez-les le plus près possible du centre.

Maintenez-les dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant au moins 30 minutes. Pour que les protéines matri gel s’auto-assemblent, pour produire un film mince qui recouvre la surface des tranches de moelle épinière, il est très important que le matri gel ait été complètement assemblé. Incuber la boîte de Pétri à 37 degrés Celsius pendant encore 30 minutes si nécessaire, puis ajoutez quatre à six millilitres de milieu D-M-E-M-F 12 contenant 25 millimolaires de tampon de heis et 15 à 20 % de sérum de veau fœtal.

Très doucement pour éviter que le fluide ne coule directement sur les tranches, assurez-vous que les tranches ne sont pas entièrement immergées dans le milieu, laissant la surface des aubergines bien exposée à l’air. Changez de support deux fois par semaine. Incuber maintenant la suspension de cellules progénitrices neurales dans le milieu à l’aide de cinq crochets micromolaires.

3, 3, 3, 4, 2 pendant 30 minutes. Au microscope, à l’aide d’un tube de verre capillaire, injectez deux microlitres de suspension dans la tranche de la moelle épinière. Assurez-vous lentement que le tube de verre capillaire passe à travers le matrigel et atteint l’intérieur de la tranche de moelle épinière.

Gardez le tube de verre à l’intérieur de la tranche de moelle épinière pendant au moins 30 secondes pour éviter la suspension cellulaire. Passez par-dessus, puis placez la boîte de Pétri contenant la tranche de moelle épinière dans l’incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 cents de dioxyde de carbone pendant la nuit. Le lendemain, construisez une chambre électro-tactique autour de la tranche de moelle épinière contenant des crochets 3 3 3 4 2 cellules de neurogenèse marquées avant d’appliquer un champ électrique mesurant 500 millivolts par millimètre.

Ici, les cellules progénitrices neurales montrent une migration fortement dirigée vers la cathode lorsqu’elles sont exposées aux champs électriques, les lignes rouges et les flèches bleues représentent respectivement les trajectoires et la direction du mouvement cellulaire. Et voici le tracé des voies de migration présenté. Voici les cellules progénitrices neurales étiquetées avec les crochets 3, 3, 3, 4, 2.

Ils ont été transplantés dans la coupe organotypique de la moelle épinière au point de départ du traitement par champ électrique. Après que les cellules progénitrices neurales aient migré directionnellement vers la cathode pendant 2,5 heures, la polarité du champ électrique a été inversée. La modification de la polarité du champ électrique a déclenché une forte inversion de l’axxis vers la nouvelle cathode.

Voici une image des cellules progénitrices neurales transplantées dans la tranche de moelle épinière. À la fin de l’enregistrement en accéléré et une reconstruction 3D des cellules progénitrices neurales transplantées dans la coupe de la moelle épinière sont présentées ici. Mastérisation de masse.

Cette technique peut être réalisée en deux semaines si elle est correctement exécutée après son développement. Cette technique ouvre maintenant la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie cellulaire pour explorer la migration des cellules neuronales progènes dans les systèmes de culture 2D et 3D en réponse et appliquer au champ électrique.