Name: Champ électrique contrôlé par les migrations des Réalisé cellules progénitrices neurales dans des environnements 2D et 3D (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Découvrez la migration des cellules progénitrices neurales contrôlée par champ électrique dans des environnements 2D et 3D. Cette méthode permet d'étudier le guidage cellulaire par électrotaxie en temps réel.

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Ce travail a été financé par la subvention de la Société royale URF UF051616, Royaume-Uni et l&#39;European Research Council StG subvention à la norme BS 243261. Le travail en laboratoire est MZ également soutenue par une California Institute of Regenerative Medicine subvention RB1-01417.

1. Neural isolement de cellules souches <ol><li> Disséquer cerveaux entiers de E14-16 chez la souris et les placer dans le froid du milieu DMEM/F12 basale. Retirez toutes les méninges sous un microscope anatomique et les cerveaux de transfert dans un plat de 35 mm de Petri. </li><li> Utilisez une pince fine à dissocier mécaniquement cerveaux en fragments de tissus et de les transférer à un tube de 15 ml, puis centrifuger les échantillons à 800 tours par minute pendant 3 min pour éliminer les débris. </li><li> Ajouter DMEM/F12 contenant bFGF et EGF et triturer avec une pipette de 1 ml. </li><li> Passer la suspension de cellules à travers un tamis de cellules pour obtenir une suspension cellulaire unique. </li><li> Cellules de la plaque dans des flacons à 2-5 x 10 4 cellules / ml, puis effectuer un plein milieu changer tous les 3 jours et le passage des cellules tous les 6 jours. </li><li> Après au moins 5 passages, digest neurosphères à des cellules individuelles à l'aide de la trypsine et l'EDTA et de croître sur les chambres electrotactic poly-D-lysine/laminin-coated (préparé comme décrit ci-dessous en 2). Utilisez le milieu de culture contenant N2-supplément,bFGF et EGF à tout moment pour maintenir les propriétés de PNJ. </li></ol> 2. Préparation de la chambre de electrotactic <ol><li> Préparer 22 x 11 mm bandes de verre en divisant autoclave 22 x 22 mm d'épaisseur des lamelles no.1 dans la moitié à l'aide d'un stylo en diamant. </li><li> Créer un verre autoportant et de dimensions intérieures 22 x 10 mm en recollant quatre verticalement debout 22 x 11 mm bandes avec de la graisse silicone de haute-vide. Autoriser les puits complètement sécher et durcir pendant la nuit. </li><li> Le lendemain, attacher deux 22 x 11 mm bandes de verre, parallèlement les uns aux autres en laissant un écart de 10 mm, à la base d'une boîte de culture de 100 mm à l'aide de la graisse silicone. Sceller la région entre ces bandes en plaçant un 22 x 22 mm lamelle à chaque extrémité, fixé au fond du récipient avec de la graisse sur trois côtés, mais pas celle la plus proche du centre. </li><li> Placez le verre bien préparé à l'étape 2.2 sur le couvercle glisse de sorte que les murs intérieurs de créer un espace confiné pour l'ensemencementles cellules sur le fond de la plaque. Imperméables à l'eau tous les joints avec de la graisse de silicone. Manteau cette région confinée de manière séquentielle avec la poly-D-lysine, puis la laminine: ajouter 1 ml de poly-D-lysine dans la chambre et sortir pendant 5 min à permettre l'acide poly-D-lysine pour se lier à la partie inférieure de la plaque; laver la chambre avec du PBS stérile à deux reprises, puis diluer la laminine dans du PBS stérile pour obtenir 20 pg / ml et utiliser pour couvrir le fond de la plaque. Laisser à température ambiante pendant la nuit. </li><li> Le lendemain, les cellules de récolte et de préparation de 1 ml de suspension contenant 1 x 104 cellules. Retirez la laminine de la vitre du bien, lui permettant de sécher complètement, et les remplacer par 1 ml de suspension cellulaire. Placer le plat dans l'incubateur à 37 ° C pendant un minimum de 4 heures pour permettre la fixation. </li><li> Une fois que les cellules sont suffisamment confluente retirer tout le milieu de la chambre. Retirez délicatement le verre bien. Former un toit au-dessus des cellules en prenant soin de fixation, avec de la graisse de silicone, un autoclave 22 x 22 mm une lamelle en verrepontage entre les deux 22 x 11 mm bandes. Couvrir les cellules avec quelques gouttes de milieu pour éviter le dessèchement. </li><li> Former un réservoir moyen isolé à chaque extrémité de la chambre en créant deux barrières étanches graisse de silicone qui s'exécutent d'un bord de la coupelle à l'autre, sur le toit chambre. Remplir la chambre avec un milieu frais, assurant un flux-travers d'un réservoir de médium à l'autre. Retour le plat dans l'incubateur pendant 12 heures pour permettre la récupération des cellules. </li></ol> 3. L'application d'un champ électrique à la chambre de electrotactic <ol><li> Préparer un couvercle pour couvrir le plat en perçant deux trous, l'un placé au-dessus de chaque réservoir de la chambre de la migration. </li><li> Remplacer tout le milieu dans la chambre du milieu de culture contenant 25 mM de tampon HEPES et transférer la capsule dans le système d'imagerie à température contrôlée. Mettre en place les paramètres expérimentaux pour la time-lapse et multi-position d'enregistrement. Aligner le chambre de sorte que la cathode et l'anode sontà gauche et à droite respectivement, pour que le vecteur EF s'étend horizontalement comme vu par le microscope et enregistrée dans le système d'imagerie. </li><li> Remplir deux béchers avec une solution de Steinberg (58 mM de NaCl, 0,67 mM de KCl, 0,44 mM de Ca (NO 3) 2 .4 H 2 0, 1,3 mM MgSO 4 .7 H 2 0 et 4,6 mM Trizma de base, pH 7,4). Connecter un bécher séparée à chaque réservoir de médium à l'aide de ponts de verre préparées à l'avance des tubes de verre (environ 13 cm de long et environ 3 mm de diamètre, et pliée en forme de U par chauffage dans une flamme Bunsen), remplis de 2% (p / v) Steinberg's-agar solution, en passant par les trous dans le couvercle. Remplissez le circuit électrique en plaçant Ag / AgCl électrodes reliées à une alimentation CC dans chaque bécher de solution de Steinberg. </li><li> Réglez la molette de tension sur l'alimentation à 0 et allumez-le. Mesurer la tension aux bornes de la chambre electrotactic tout en tournant le cadran de tension, à l'aide d'un voltmètre, et ajuster en fonction des besoins expérimentaux. </li><li> Début d'enregistrement time-lapse. Effectuer une variation moyenne et réajuster la tension, selon les besoins, toutes les heures. Un milieu frais, les médicaments, les agents chimiques peuvent être ajoutées aux réservoirs, au besoin. Lorsque effectuer changement de milieu, deux options peuvent être considérées comme ci-dessous: <ol><li> Option n ° 1 - Pour mettre en pause l'enregistrement time-lapse temporairement, retirer soigneusement les ponts en verre de la chambre à éviter de perturber Couvercle, utiliser un stérilisés pipette Pasteur doucement remplacer tout le milieu par du milieu frais et de mettre les ponts de verre arrière, puis reprendre l'enregistrement. </li><li> Option n ° 2 - Par ailleurs, fait sur mesure Couvercle avec 4 trous (deux positionné au-dessus de chaque réservoir de la chambre de la migration) peut également être utilisé à des fins de changement de milieu. Deux ponts pour le verre de connexion, les deux autres pour changer à moyen terme. Option 2 permet l'enregistrement en continu, sans ingérence lors du changement de support. </li></ol></li></ol> 4. Préparation de la tranche la moelle épinière organotypique <ol><li> Disséquer lumbcordons ar la colonne vertébrale de 2 semaines vieille BL C57 / 6 souris. </li><li> Trancher la moelle épinière en sections um d'épaisseur 500 avec un hachoir de tissus McIlwain. </li><li> Tranches distinctes sous un microscope anatomique et sélectionner des tranches avec intacte sagittale / axiale structure de la moelle épinière. </li><li> Plate tranches dans un plat de 35 mm de Pétri contenant 30 ul Matrigel et les placer aussi près que possible du centre et de les maintenir dans un 5% de CO 2 incubateur à 37 ° C pendant au moins 30 min jusqu'à ce que le Matrigel protéines s'auto-assemblent pour produire un film mince qui recouvre la surface de la tranche la moelle épinière. Il est très important de s'assurer que Matrigel a été entièrement assemblé, incuber la boîte de Pétri à 37 ° C pendant 30 min si nécessaire. </li><li> Ajouter 4-6 ml DMEM/F-12 milieu contenant 25 mM de tampon HEPES et 15-20% de sérum de veau foetal doucement de manière à éviter un écoulement moyen directement sur la tranche. Veiller à ce que la tranche n'est pas entièrement submergée dans le milieu, laissant la surface des explants bien exposée aul'air. Changer le milieu de deux fois par semaine. </li></ol> 5. L'injection de Hoechst 33342 PNJ marquées dans la tranche la moelle épinière organotypique <ol><li> Préparer la suspension NPC à 1 × 10 6 cellules / ul. </li><li> Pré-incuber la suspension de cellules dans un milieu avec 5 uM Hoechst 33342 pour 30 min. </li><li> Utilisez tube capillaire en verre de micro-injection 2 pi de suspension dans la tranche la moelle épinière lentement sous un microscope. Assurez-vous que le tube capillaire en verre passe à travers le Matrigel (partie rose sous le microscope) et d'atteindre à l'intérieur de la tranche la moelle épinière (tissu gris sous le microscope), restent à l'intérieur de la tranche la moelle épinière pendant au moins 30 secondes pour éviter la suspension de cellules de fonctionner plus. Mettez la boîte de Pétri contenant tranche la moelle épinière en incubateur (37 ° C 5% CO 2) et laissez-le pendant la nuit. </li><li> Le lendemain, appliquer une EF de 500 mV / mm à la tranche la moelle épinière contenant Hoechst 33342-labellisés PNJ dans la chambre electrotactic (en utilisant les méthodes décrites dans3). </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Quand les PNJ ont été exposés à une gamme de FE physiologiques qu'ils ont montré la migration des cellules fortement dirigée vers la cathode (Figure 1). La même observation a également été faite au niveau de la cellule unique sur le modèle organotypique tranche la moelle épinière ex vivo, une imitation environnement 3D dans des conditions in vivo (figure 2). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3453/3453fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. PNJ montrent la migration dirigée dans FE. PC a montré la migration hautement orienté vers la cathode lors de l'exposition pour les CE, les lignes rouges et les flèches bleues représentent les trajectoires et la direction de mouvement de la cellule (A). B montre les voies de migration des PNJ. Bar: 50 pm. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3453/3453fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. PNJ transplantés afficher migration dirigée vers la cathode dans la tranche la moelle épinière organotypique

<ol><li>Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+with+electric+potential%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Wound healing with electric potential.</a> N. Engl. J. Med. 356, 303-303 (2007).</li>
<li>McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+cell+behavior+electrically%3A+current+views+and+future+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Controlling cell behavior electrically: current views and future potential.</a> Physiol. Rev. 85, 943-943 (2005).</li>
<li>Borgens, R. B., Jaffe, L. F., Cohen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+and+persistent+electrical+currents+enter+the+transected+lamprey+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Large and persistent electrical currents enter the transected lamprey spinal cord.</a> PNAS. 77, 1209-1209 (1980).</li>
<li>Shapiro, S., Borgens, R., Pascuzzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillating+field+stimulation+for+complete+spinal+cord+injury+in+humans%3A+a+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosurg.+Spine%22%5BJournal%5D)">Oscillating field stimulation for complete spinal cord injury in humans: a phase 1 trial.</a> J. Neurosurg. Spine. 2, 3-3 (2005).</li>
<li>Zhao, M., Song, B., Pu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+signals+control+wound+healing+through+phosphatidylinositol-3-OH+kinase-gamma+and+PTEN%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-gamma and PTEN.</a> Nature. 442, 457-457 (2006).</li>
<li>Yao, L., Shanley, L., McCaig, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+applied+electric+fields+guide+migration+of+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Small applied electric fields guide migration of hippocampal neurons.</a> J. Cell. Physiol. 216, 527-527 (2008).</li>
<li>Li, L., El-Hayek, Y. H., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct-current+electrical+field+guides+neuronal+stem%2Fprogenitor+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Direct-current electrical field guides neuronal stem/progenitor cell migration.</a> Stem Cells. 26, 2193-2193 (2008).</li>
<li>Meng, X., Arocena, M., Penninger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K+mediated+electrotaxis+of+embryonic+and+adult+neural+progenitor+cells+in+the+presence+of+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors.</a> Exp. Neurol. 227, 210-210 (2011).</li>
<li>Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+stromal+cells+promote+neurite+extension+in+organotypic+spinal+cord+slice%3A+significance+for+cell+transplantation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurorehabil.+Neural+Repair%22%5BJournal%5D)">Bone marrow stromal cells promote neurite extension in organotypic spinal cord slice: significance for cell transplantation therapy.</a> Neurorehabil. Neural Repair. 22, 447-447 (2008).</li>
<li>Shichinohe, H., Kuroda, S., Tsuji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+stromal+cells+promote+neurite+extension+in+organotypic+spinal+cord+slice%3A+significance+for+cell+transplantation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurorehabil.+Neural+Repair%22%5BJournal%5D)">Bone marrow stromal cells promote neurite extension in organotypic spinal cord slice: significance for cell transplantation therapy.</a> Neurorehabil. Neural Repair. 22, 447-447 (2008).</li>
<li>Song, B., Gu, Y., Pu, j <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+direct+current+electric+fields+to+cells+and+tissues+in+vitro+and+modulation+of+wound+electric+field+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo.</a> Nature Protocol. 2, 1479-1479 (2007).</li>
</ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Les protocoles que nous utilisons sont basés sur des études antérieures 5,11. L&#39;utilisation de ces méthodes, la culture stable et électrique conditions actuelles peut être maintenue tout en appliquant un EF par des ponts d&#39;agar, la solution de Steinberg, et Ag / AgCl électrodes, à des cellules cultivées ou en tranches dans des chambres electrotactic conçus sur mesure de dimensions normalisées et précis. La profondeur de chambres peut être ajusté pour tenir compte d&#39;échantillon différentes épaisseu...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> FGF-base humaine recombinante </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0026 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td> EGF humain recombinant </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0311 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td> N2-Supplément (100X) de liquide </td><td> Invitrogen </td><td> 02048 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 (taux élevé de glucose) </td><td> Invitrogen </td><td> 31330-095 </td><td></td></tr><tr><td> Poly-D-Lysine </td><td> Millipore </td><td> A-003-E </td><td></td></tr><tr><td> Naturelle laminine de souris </td><td> Invitrogen </td><td> 23017-015 </td><td></td></tr><tr><td> Facteur de croissance réduit la membrane basale Matrix (Matrigel) </td><td> BD Biosciences </td&gt; <td> 354230 </td><td></td></tr><tr><td> Tampon HEPES </td><td> Gibco </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue chopper McIlwain </td><td> Le Laboratoire Mickle Engineering Co Ltd </td><td> TC752-PD </td><td></td></tr><tr><td> Dow Corning graisse silicone de haute-vide </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z273554 </td><td></td></tr></tbody></table>

champ électrique contrôlé par les migrations des réalisé cellules progénitrices neurales dans des environnements 2d et 3d

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Endogènes des champs électriques (FE) sont naturellement présents in vivo et jouent un rôle crucial lors de tissus / organes de développement et de la régénération, y compris celle de la 1,2 du système nerveux central. Ces FE endogènes sont générées par la régulation cellulaire de transport ionique combinés à la résistance électrique de cellules et de tissus. Il a été rapporté que le traitement appliqué EF peut favoriser la réparation fonctionnelle des lésions de la moelle épinière chez les animaux et les humains 3,4. En particulier, la migration des cellules EF-dirigée a été démontrée dans une grande variété de types cellulaires 5,6, y compris les cellules progénitrices neurales (PNJ) 7,8. Demande de courant continu (DC) FE n&#39;est pas une technique couramment disponible dans la plupart des laboratoires. Nous avons décrit des protocoles détaillés pour l&#39;application de la FE DC à cultures cellulaires et tissulaires préalablement 5,11. Nous présentons ici une vidéo de démonstration de méthodes standards basées sur une intensité de champ calculée à mettre en place une 2Dd environnements 3D pour les PNJ, et d&#39;enquêter sur les réponses cellulaires à la stimulation EF dans les deux conditions de croissance des cellules simples en 2D, et la tranche cordon organotypique épinière en 3D. Le cordslice épinière est un tissu receveur idéal pour étudier les comportements des PNJ ex vivo, post-transplantation, parce que l&#39;organisation des tissus cytoarchitectoniques est bien conservé au sein de ces cultures 9,10. En outre, ce modèle ex vivo permet également des procédures qui ne sont pas techniquement possible de suivre des cellules in vivo en utilisant time-lapse d&#39;enregistrement au niveau cellule unique. Il est essentiel d&#39;évaluer de façon critique les comportements cellulaires, non seulement dans un environnement 2D, mais aussi dans un état ​​3D organotypique qui imite l&#39;environnement in vivo. Ce système permettra l&#39;imagerie haute résolution en utilisant la couverture à base de verre plats dans les tissus ou organes de la culture avec un suivi en 3D de la migration cellulaire unique in vitro et ex vivo et peut constituer une étape intermédiaire avant de passer à en viparadigmes VO.

Ce protocole illustre des méthodes utilisées pour établir des environnements 2D et 3D dans les chambres electrotactic conçus sur mesure, qui permettent de suivre les cellules<em&gt; In vivo / ex vivo</em&gt; En utilisant time-lapse d&#39;enregistrement au niveau cellule unique, afin d&#39;enquêter sur galvanotaxie ou électrotaxie et d&#39;autres réponses cellulaires à diriger à courant continu) des champs électriques (EFS).

Champ électrique contrôlé par les migrations des Réalisé cellules progénitrices neurales dans des environnements 2D et 3D

Les champs électriques (CE) endogènes apparaissent naturellement in vivo et jouent un rôle critique lors du développement et de la régénération des tissus et des organes, y compris celui du...

L'objectif général de cette procédure est d'enregistrer l'effet des champs électriques appliqués sur la migration des cellules progénitrices neuronales dans des modèles de culture en 2D et ex vivo en 3D. Cela est réalisé en isolant et en amplifiant d'abord les cellules progénitrices neuronales in vitro. La deuxième étape consiste à préparer une suspension monocellulaire de cellules progénitrices neuronales.Ensuite, pour la préparation de cultures en 2D, les cellules progénitrices neuronales sont ensemencées dans des chambres électrotactiques conçues sur mesure. Alternativement, pour la préparation d'un modèle ex vivo en 3D, les cellules progénitrices neuronales sont marquées avec les sondes 3, 3, 3, 4, 2, puis injectées dans un modèle organotypique de tranches de moelle épinière. Enfin, un champ électrique est appliqué aux chambres électrotactiques et un enregistrement en lapse de temps est effectué afin de montrer que les cellules progénitrices migrent vers la cathode du champ électrique, tant dans les environnements en 2D qu'en 3D.Le principal avantage de cette technique est qu'elle offre une méthode innovante pour le suivi en temps réel de la migration induite par un champ électrique de cellules individuelles après leur transplantation dans un modèle organotypique tridimensionnel, proche de l'environnement naturel. Cette méthode peut non seulement fournir des informations sur la technique électro-cinétique, migration de cellules neuro-entériques transplantées dans une tranche de moelle épinière, mais peut également être appliquée à d'autres systèmes, tels que les modèles de tranches cérébrales plus petits. Pour commencer cette procédure, préparez des bandes de verre de 22 par 11 millimètres en divisant au milieu des verres de 22 par 22 millimètres stérilisés au autoclave.Couper en deux des lamelles d'épaisseur n°1 à l’aide d’un crayon diamanté. Ensuite, créer une chambre en verre autoportante de dimensions intérieures de 22 sur 10 millimètres en collant quatre bandes verticales de 22 sur 11 millimètres ensemble à l’aide de graisse de silicone pour vide élevé, puis laisser durcir complètement toute la nuit. Le jour suivant, fixer deux bandes de verre de 22 sur 11 millimètres parallèlement l’une à l’autre, en laissant un espace de 10 millimètres, sur le fond d’une boîte de culture de 100 millimètres à l’aide de graisse de silicone.Ensuite, obturer la région entre ces bandes en fixant une lame de 22 sur 22 millimètres avec de la graisse silicone. Placer la chambre en verre sur les lames de façon que les parois intérieures créent un espace confiné pour la mise en place des cellules. Étanchéifier toutes les jonctions avec de la graisse silicone.Recouvrir cette région restreinte séquentiellement avec de la poly-d-lysine, suivie de laminine, comme décrit dans le manuscrit accompagnant. Dans cette procédure, obtenir les cerveaux de souris E14 à E16 et les placer dans un milieu basal D-M-E-M-F12 froid. Ensuite, retirer les méninges au microscope anatomique.Ensuite, transférez les cerveaux dans une boîte de Pétri de 35 millimètres. Utilisez la pince fine pour dissocier les cerveaux en fragments tissulaires. Puis transférez-les dans un tube centrifuge de 15 millilitres.Échantillons à 800 tr/min pendant trois minutes pour éliminer les débris D. Ensuite, ajouter A-D-M-E-M-F 12 contenant BFDF et DGF aux échantillons. Les triturer avec une pipette de un millilitre.Ensuite, obtenir la suspension monocellulaire à l’aide d’un tamis cellulaire. Ensemencer les cellules dans les fioles à raison de 20 000 à 50 000 cellules par millilitre. Effectuer ensuite un changement complet de milieu tous les trois jours, ce qui implique de centrifuger les cellules à 1 300 tr/min pendant cinq minutes.Éliminer le surnageant, suspendre le tissu conjonctif dans un milieu frais et remettre les cellules dans le flacon tous les six jours après au moins cinq passages. Transférer les NEUROSPHÈRES dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres à 1 500 tr/min pendant cinq minutes. Éliminer le surnageant.Resuspendre le culot dans des trips contenant du EDTA pour obtenir une suspension monocellulaire. Avant d'effectuer un décompte cellulaire, préparer un millilitre de suspension contenant 10 000 cellules. Ensuite, retirer la laminine du puits en verre et laisser sécher complètement.Remplacez-le par un millilitre de suspension cellulaire. Ensuite, placez la boîte dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant au moins quatre heures pour permettre l’attachement. Une fois que les cellules sont suffisamment confluentes, retirez le milieu de la chambre.Retirez soigneusement le verre. Formez ensuite une couverture au-dessus des cellules en fixant délicatement une lame de verre de 22 par 22 millimètres entre deux bandes de 22 par 11 millimètres à l’aide de graisse de silicone. N’oubliez pas de recouvrir les cellules de quelques gouttes de milieu afin d’éviter qu’elles ne s’assèchent.Ensuite, former un réservoir de milieu isolé à chaque extrémité de la chambre en créant deux barrières étanches en graisse silicone qui s'étendent d'une extrémité de la boîte à l'autre. Remplir la chambre avec du milieu frais, en veillant à établir un écoulement allant d'un réservoir de milieu à l'autre. Par la suite, replacer la boîte dans l'incubateur pendant 12 heures afin de permettre la récupération des cellules.À l'étape suivante, préparez un couvercle pour recouvrir la boîte en perçant deux trous, un positionné au-dessus de chaque réservoir de la chambre de migration. Ensuite, remplacez le milieu dans la chambre par un milieu de culture contenant du tampon hippies à 25 millimètres. Puis, transférez la boîte vers le système d'imagerie contrôlé en température.Réglez les paramètres expérimentaux pour l’enregistrement temporel et multicellule. Alignez la chambre de manière à ce que la cathode et l’anode soient respectivement à gauche et à droite, afin de garantir que le vecteur du champ électrique s’étende horizontalement, tel qu’il apparaît au microscope et est enregistré par le système d’imagerie. Ensuite, remplissez deux béchers.Avec la solution de Steinberg. Relier un bécher séparé à chaque réservoir de milieu à l’aide des ponts de verre préparés contenant une solution d’agar à 2 % dans la solution de Steinberg. Ensuite, placer les électrodes d’argent reliées à une alimentation en courant continu dans la solution de Steinberg.Dans chaque bécher, régler le bouton de tension de l'alimentation électrique sur zéro et l'allumer. Mesurer la tension aux bornes de la chambre électrotactique à l'aide d'un voltmètre tout en augmentant progressivement le bouton de tension. Puis ajuster la tension en fonction des exigences expérimentales.Après cela, démarrez l'enregistrement en mode laps de temps. Effectuez un changement de milieu et réajustez la tension électrique selon les besoins. Toutes les heures, du milieu frais, des médicaments ou des agents chimiques peuvent être ajoutés aux réservoirs selon les besoins.À l'aide de trous supplémentaires percés dans le couvercle de la boîte de culture, un situé au-dessus de chaque réservoir de milieu. À cette étape, disséquez les moelles épinières lombaires de souris âgées de deux semaines. Ensuite, découpez les moelles épinières en sections de 500 microns d'épaisseur à l'aide d'un hachoir à tissus machel wane sous un microscope anatomique.Séparez les tranches et sélectionnez celles présentant une structure médullaire axiale sagittale intacte. Ensuite, placez les tranches dans une boîte de Pétri de 100 millimètres contenant 30 microlitres de gel MA. Disposez-les aussi près que possible du centre.Les maintenir dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant au moins 30 minutes. Pour que les protéines de matrigel s'auto-assemblent et forment un film mince recouvrant la surface des tranches de moelle épinière, il est très important que le matrigel soit complètement polymérisé. Incuber la boîte de Pétri à 37 degrés Celsius pendant encore 30 minutes si nécessaire, puis ajouter quatre à six millilitres de milieu D-M-E-M-F 12 contenant 25 millimolaire de tampon hepes et 15 à 20 % de sérum de veau fœtal.Très doucement, afin d'éviter que le milieu ne s'écoule directement sur les tranches, veillez à ce que celles-ci ne soient pas complètement immergées dans le milieu, en laissant la surface des aubergines bien exposée à l'air. Changez le milieu deux fois par semaine. Incubez maintenant la suspension de cellules progénitrices neuronales dans le milieu contenant cinq micromoles de hooks.3, 3, 3, 4, 2 pendant 30 minutes. Sous un microscope, utilisez un tube en verre capillaire pour micro-injecter deux microlitres de suspension dans la tranche de moelle épinière. Veillez lentement à ce que le tube en verre capillaire traverse le matrigel et atteigne l'intérieur de la tranche de moelle épinière.Gardez le tube en verre à l'intérieur de la tranche de moelle épinière pendant au moins 30 secondes afin d'éviter la suspension cellulaire. Passez rapidement, puis placez la boîte de Pétri contenant la tranche de moelle épinière dans l'incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 cent de dioxyde de carbone pendant la nuit. Le jour suivant, construisez une chambre électrotactique autour de la tranche de moelle épinière contenant des cellules de neurogenèse marquées 3 3 3 4 2 avant d'appliquer un champ électrique mesurant 500 millivolts par millimètre.Ici, les cellules progénitrices neuronales montrent une migration fortement dirigée vers la cathode lorsqu'elles sont exposées à des champs électriques ; les lignes rouges et les flèches bleues représentent respectivement les trajectoires et le sens du déplacement cellulaire. Et voici le tracé des parcours de migration illustrés. Voici les cellules progénitrices neuronales marquées avec les anticorps 3 3, 3, 4 2.Ils ont été transplantés dans la tranche organotypique de moelle épinière au point de départ du traitement par champ électrique. Après que les cellules progénitrices neuronales se soient déplacées de manière directionnelle vers la cathode pendant 2,5 heures, la polarité du champ électrique a été inversée. L'inversion de la polarité du champ électrique a déclenché un brusque retournement de l'axe en direction de la nouvelle cathode.Voici une image des cellules progénitrices neuronales transplantées au sein d'une coupe de moelle épinière. À la fin de l'enregistrement en lapse de temps, une reconstruction 3D des cellules progénitrices neuronales transplantées au sein de la coupe de moelle épinière est présentée ici. Maîtrise réussie.Cette technique peut être réalisée en deux semaines si elle est correctement effectuée après son développement. Elle ouvre désormais la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie cellulaire pour explorer la migration des cellules progénitrices neuronales dans des systèmes de culture en 2D et en 3D en réponse à un champ électrique.

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