Name: Dérivation de précurseurs gliales restreint de souris E13 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Découvrez la dérivation de précurseurs gliales restreints à partir de moelles épinières fœtales de souris E13. Cette méthode utilise l'immunopanning pour enrichir les populations GRP et étudier la lignée oligodendrocytaire.

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Nous tenons à remercier le Dr Gary Devin pour sa perspicacité et une rétroaction sur l&#39;utilisation de cellules GRP.

Introduction Dans ce protocole, nous montrons comment extraire, sélectionnez et la plaque gliales restreints précurseurs (GRP), les cellules de la moelle épinière de fœtus de souris E13. Ces cellules sont les signes précurseurs au sein des lignées cellulaires oligodendrogliome et astrocytaire et sont définies par leur expression de A2B5. Dans le milieu de GRP complétée avec le FGF-2, les A2B5 GRP + seront commencer à exprimer au début des années oligodendrogliome lignée marqueurs PDGFαR et NG2 1,2. Ces cellules de la lignée des oligodendrocytes passer à travers une série de phases distinctes phénotypiques, chacun d'eux caractérise par des changements morphologiques, ainsi que l'expression de marqueurs spécifiques à des stades de développement. Ces cellules précurseurs sont actuellement à l'étude comme une source potentielle pour la cellule à base approches thérapeutiques dans les troubles de la question du système nerveux central blanc, y compris la sclérose en plaques, les leucodystrophies et la leucomalacie périventriculaire (PVL) 3,4,5,6 6,7,8,9. Ces cellules précurseurs gliales ont aussi été utilisés dans les études d'autres modèles blancs maladie de la substance comme lésion de la moelle épinière et la sclérose latérale amyotrophique 10,11,12,13. Notre laboratoire a mis au point un premier modèle de la souris postnatale hypoxie-ischémie avec laquelle nous évaluons l'efficacité de ces cellules dérivées moelle épinière GRP comme une approche réparatrice en PVL, la principale cause de la paralysie cérébrale 14,15,16. Il ya aussi un cerveau de rongeur modèle dérivé OPC qui a été largement utilisé pour l'étude des blessures de la substance blanche, car les cellules GRP ont tendance à se différencier en la voie astrocytaire 17. Le phénotype OPC est déjà entré dans la voie de la lignée des oligodendrocytes, un phénomène qui semble irreversible. Cependant, nous sommes intéressés à évaluer la réponse d'un spectre plus large de progéniteurs d'oligodendrocytes, y compris PEB et peut-être même les PES dérivés à E10.5. Pour cette raison, nous avons adopté la moelle épinière provenant modèle GRP pour notre travail. En plus de l'utilisation de PEB pour le remplacement des cellules, la dérivation de ces cellules de type sauvage et des modèles de rongeurs transgéniques des maladies de la substance blanche permet une étude plus approfondie dans la différenciation gliale dans des conditions normales et la maladie lors d'un réglage in vitro. Les publications précédentes montrent des signes de vulnérabilité sélective des cellules précurseurs oligodendrogliome lignée à divers facteurs de stress extérieurs tels que l'excitotoxicité du glutamate de maturation dépend, stress oxydatif, et les facteurs impliqués dans certains neuroinflammation 18,19. Nos études ont porté sur la compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires sous-tendent le développement de ces blessures de la substance blanche, d'évaluer la sensibilité des cellules àle spectre lignée oligodendrocyte d'insulter ainsi que l'analyse des approches thérapeutiques putatifs. Matériels Toutes les procédures impliquant des animaux conformes à la politique du PHS et le JHU IACUC. Toutes les procédures doivent être effectuées dans une hotte à flux laminaire afin de maintenir des conditions d'asepsie. Couramment dissection sont réalisées dans une hotte à écoulement horizontal et dans travail vitro dans une hotte à écoulement vertical. Tous les médias utilisés à froid pendant des dissections. Les souris utilisées dans notre étude sont d'un type sauvage souche CD-1 et une GFP transgénique dans un contexte C57/BL6. Un CD-1 du barrage de la souris donne généralement de 10 foetus + qui sont suffisants pour semences 1-2 flacons T25. En règle générale, deux barrages sont sacrifiés à la fois et la moelle épinière du fœtus en commun et étalées dans 1 flacon T25 par barrage. Une fois que les cellules ont été obtenues, ils peuvent être étendues et caractérisées in vitro pour des études ultérieures. 1. Préparation des milieux et des flacons <ul type="disc"><li> GRPmilieu est utilisé comme milieu de dissection: DMEM / F12 1:1 (Invitrogen) + B27 (50x; Invitrogen) N2 (100x; Invitrogen) Suppléments et l'albumine sérique bovine (BSA; 0,5% p / v). </li><li> Du milieu de dissociation: même milieu de dissection. </li><li> Le milieu de culture: milieu de stock de GRP + FGF-2 (10-20 ng / ml; Invitrogen) et l'héparine (1 pg / ml; Sigma). </li><li> PLL / laminine enrobés 75 cm 2 ou 25 cm 2 flacons (T75 ou T25). </li><li> Flacons de culture cellulaire (75 cm 2, Falcon) ont été recouvertes de 15-20μg/ml poly-L-lysine (PLL; Sigma) dans H 2 O distillée, incubées à 37 ° C pendant 1 heure puis aspiré. Flacons sont lavées avec du PBS 1X, puis recouverte d'pg 15-20 / ml laminine (Sigma) dans du PBS à 37 ° C pendant 1 heure, ensuite aspiré et du PBS frais ou les médias ajouté jusqu'à ce que les cellules sont prêtes à être plaquée. Après revêtement, flacons ne devraient jamais être autorisés à sécher, mais peuvent être conservés dans du PBS ou des médias à 4 ° C pendant de brèves périodes avant de les utiliser. </li></ul> 2. Instruments et M Autreatériel <ul type="disc"><li> Des boîtes de Pétri: 4 par des barrages: 3 boîtes de Pétri pour dissection (75 mm), un plat de 20 mm pour la collecte des cordes récoltées épinière. </li><li> Grands ciseaux (43 mm de ciseaux d'exploitation, Roboz) et une pince pour ouvrir l'abdomen tissus du barrage s. </li><li> Petit ciseaux pour disséquer l'utérus et d'éliminer les fœtus (15 mm Micro Ciseaux à dissection, Roboz). </li><li> Micro ciseaux printemps dissection (6 mm) pour disséquer la moelle épinière des fœtus. </li><li> Micro Pinces à disséquer angle pour l'ancrage du corps du barrage et du foetus pendant la chirurgie et plus tard de retirer la moelle épinière une fois exposé. </li><li> 40 ou 70 tamis cellulaire micromètre pour éliminer les débris cellulaires avant l'ensemencement. </li><li> Trypsine 0,05% préchauffé à 37 ° C. </li><li> 10 mg / ml de DNAse 1 (Sigma), préparé comme un stock 100x (1 g / ml). </li><li> Bio-Hazard sac pour cadavres d'animaux. </li><li> 15 et 50 tubes à centrifuger ml pour le traitement des extraits de la moelle épinière. </li></ul> 3. Déterminer Timed Pregnancy Barrages de souris enceintes sont soit commandés auprès de sources commerciales précisant la livraison le jour embryonnaire E12 ou E13 du développement du fœtus ou de grossesse constatée dans la maison. En bref, deux femelles sont placés ensemble avec un mâle dans l'après-midi et laissé une nuit ensemble. Le lendemain, les femelles sont observées pour la présence du bouchon muqueux situé par voie vaginale. Le bouchon muqueux est seulement une indication que l'accouplement a eu lieu pour que les animaux sont ensuite pesés quotidiennement pour surveiller le rythme d'augmentation du poids. Le jour où le bouchon muqueux est observé est défini comme jour embryonnaire un (E1). 4. Dérivation des tissus <ol><li> Travailler sous une hotte à flux horizontal pour maintenir des conditions aseptiques. </li><li> Vaporiser en bas de la hotte et la zone de travail avec de l'éthanol 70%. </li><li> Instruments autoclave ou pulvérisation généreusement avec de l'éthanol 70%. </li><li> Préparer les instruments, les médias et d'un microscope à l'emploi. </li><li> Verser 20 ml de milieu de dissection froide dans Petri stérile dish. </li><li> Anesthésier animal avec l'hydrate de chloral (500 mg / kg) administré par voie intrapéritonéale (IP), suivie par dislocation cervicale ou décapitation. </li><li> Vaporisez la région abdominale de la mère avec de l'éthanol à 70-90% (désinfection) </li><li> Ouvrez l'abdomen avec des ciseaux et des pinces grande. <ol type="a"><li> En CD1 et C57/BL6 souches: Habituellement 8 à 14 fœtus sera à l'intérieur de l'utérus. Le nombre de fœtus est la souche dépendante. </li></ol></li><li> Extrait de l'utérus de souris, y compris les bébés et les placer dans un milieu de dissection douce froide dans un boîte de Petri propre pour se laver du sang et des débris de tissus du foetus. </li><li> Extrait chaque fœtus de la corne utérine et les séparer de la sac embryonnaire et le placenta à l'aide des petits ciseaux. Transfert des foetus extraits dans le milieu de dissection frais dans un nouveau plat de Petri. <ol type="a"><li> Milieu de dissection devrait être à basse température pour réduire l'activité métabolique et préserver la viabilité des cellules dérivées. </li><li> Travailler à partir de maintenant avec deux pinces etmicro dissection printemps-ciseaux. </li></ol></li><li> De travail sous le microscope de dissection, couper la peau le long de la moelle épinière avec des ciseaux chirurgicaux micro et la peau peler pour exposer la moelle épinière. </li><li> Sectionner la moelle épinière avec les ciseaux de microchirurgie à environ C1 et au début de la queue. </li><li> Retirer la moelle épinière avec le forceps émoussé, s'assurer que tous les os et le cartilage sont enlevés et de transférer au 3 boîtes de Pétri de disséquer moyennes. </li><li> Pour prévenir la prolifération de tissu méningé dans les cultures cellulaires ultérieures essayer d'enlever une grande partie des méninges que possible de la moelle épinière. En raison des nerfs périphériques naissantes saillantes ce qui est plus difficile que l'élimination du tissu méningé de cerveau extrait. </li><li> Une fois méninges ont été enlevés, le transfert de la moelle épinière à 20 mm boîte de Pétri </li><li> Nettoyez à fond par la pulvérisation de la zone avec de l'éthanol à 70-90%. </li><li> Les étapes suivantes pour la dissociation doit être fait rapidement pour maintenirune viabilité élevée de la moelle épinière dérivée. </li></ol> 5. Mise en place de la culture <ol><li> La trypsine doit être préchauffée pendant au moins 30 min à 37 ° CH 2 O-bain. Une partie aliquote appropriée devrait être retiré du stock afin de réduire l'exposition de stock aux variations de température. </li><li> Transférer les cordons médullaires récoltés dans un tube à centrifuger de 50 ml contenant 10 ml préchauffé trypsine (0,05%; qualité des produits biologiques) et 100 ul DNAse (10 mg / ml) et triturer brièvement. </li><li> Incuber à 37 ° CH 2 O-marie pendant 10 minutes. </li><li> Triturer et incuber pendant encore 10 min. </li><li> Ajouter 5 ml GRP moyen (défini ci-dessus) et centrifuger pendant 5 min à 1000 RPM. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre en suspension culot avec 10 ml de GRP moyen et ajouter DNAse-1 (10 mg / ml; Sigma). </li><li> Incuber à 37 ° CH 2 O-marie pendant 10 minutes. </li><li> Centrifuger 5 min à 1000 RPM et aspirer le surnageant. </li><li> Resuspendre le culot avec fréquencesh GRP moyen, puis les débris du filtre avec un 40 à 70 um tamis cellulaire. </li><li> Plaque sur PLL / laminine revêtu flacons de 25 cm2 (T25) et incuber à 37 ° C, humidité 95% et 5% de CO 2. </li><li> 100% des médias changer à la suite de la journée. </li><li> À ce stade, GRP ont attachés et ont commencé à étendre les processus. </li></ol> 6. Immunopanning la population GRP <ol><li> Tissus de la moelle épinière dans la plaque PLL / laminine flacons revêtu jusqu'à flacon est de 85-90% de confluence, soit environ une semaine. </li><li> Cellules de récolte par grattage ballon avec une spatule en caoutchouc ou avec de la trypsine 0,05%, triturer à fond, mais doucement, centrifuger à 1000 tours par minute pendant 5 minutes et de manière approfondie Resuspendre le culot avec 3 ml GRP moyen. </li><li> Transférer 1 ml de chaque à 3 flacons T25 ou 3 ml à 1 flacon T75 ajouter des volumes appropriés du milieu pour couvrir complètement les cellules et permettre flacons pour atteindre la confluence de 80-90%. </li><li> Changer les médias tous les jours, plus tôt si le support épuise rapidement. </li><li> Manteau bactériologiques Peplats tri (75 mm) une nuit à 4 ° C avec un anticorps anti-IgM de souris (Southern Biotech), 10 ug / ml dans du PBS. </li><li> Aspirer le tampon en excès et se laver les boîtes de Pétri 3x avec du PBS. </li><li> Ajouter A2B5 anticorps (Millipore) à une concentration de 5 ug / ml dilué dans du PBS et laisser incuber pendant 1 heure à température ambiante (RT). </li><li> Laver les plaques avec du PBS à nouveau 3x puis ajoutez 8 ml de milieu GRP pour éviter le dessèchement de la plaque. </li><li> Transférer 5 ml de milieu de GRP à partir des boîtes de Pétri et les cellules GRP récolte en grattant flacons avec une spatule en caoutchouc pour détacher toutes les cellules </li><li> Triturer suspension cellulaire brièvement pour briser les mottes et de transférer 5 ml de suspension cellulaire aux A2B5 enduits bactériologiques des boîtes de Pétri. </li><li> Incuber 1 h à température ambiante sans agitation. </li><li> Après 1 h aspirés médias et des plaques de lavage avec du PBS 8x. </li><li> Grattez délicatement les cellules avec une spatule en caoutchouc en 2 médias ml GRP puis transfert à PLL / laminine plaques revêtues ou flacons avec le volume approprié de milieu GRP. </li> 7. Congélation et de stockage de cellules dérivées <ol><li> Les cellules sont récoltées à partir d'un 85-90% de confluence T25 ou T75 flacon avec 2 ml de trypsine 0,05%. </li><li> La trypsine est dilué et inactivé avec un milieu de 8ml de stock GRP et centrifugé à 1000 tours par minute pendant 5 min. </li><li> Pellets de flacons T25 sont remises en suspension dans 1 ml de milieu de congélation GRP, (moyenne de stock GRP supplémenté avec 10% (v / v) de DMSO et, éventuellement, FBS 20%). Les granulés de grands flacons T75 sont dilué deux fois. </li><li> Des suspensions cellulaires de 1,5 - 3 x 10 10,11,12,13 cellules sont transférés dans des flacons cryogéniques (Nalgene) et stockée pendant la nuit dans un récipient cryogénique (Nalgene) contenant de l'isopropanol à -80 ° C à geler toute la nuit lentement. </li><li> Après une nuit de gel cellules sont reportées dans les cases de congélation et stockées 6 mois à 1 an à -80 ° C ou à plus long terme en N (l). Les cellules décongelées sont généralement 60-80% viable dépend en grande partie sur la qualité du revêtement PLL / laminine. </li></ol> 8. Les résultats représentatifs CO 2 n'est pas utilisé pour anesthésier l'animal en raison de l'effet possible en aval sur la viabilité des fœtus et, finalement, les cellules dérivées. En outre, il sera très difficile d'éliminer totalement les méninges de la moelle épinière au cours de la procédure de dérivation, mais la combinaison de milieu GRP et immunopanning permettra d'éliminer ces cellules à croissance rapide. De même, le cordon médullaire est récolté toute en dépit d'une plus grande concentration ventrale de la population GRP en raison de sa originaires de la moelle épinière ventrale et dorsale migration 20. Toutefois, le milieu de GRP sélectionne pour le phénotype GRP et que la population est maximisée par A2B5 immunopanning. Après étalement des tissus de la moelle épinière, les cultures in vitro sont incubées pendant deux passages, soit environ une semaine. Après 2 jours de culture, les cellules de morphologies différentes peuvent être observées dans les flacons de culture tissulaire indiquant l'hétérohétérogénéité de la population, mais le milieu de GRP sélectionne pour le phénotype GRP. Ces cellules sont une combinaison de A2B5 + de fibre de verre, E-NCAM + de neuronales précurseurs restreintes (PNR) et nestine +, des cellules neuro-A2B5 et éventuellement la fibronectine + méningés cellules. En outre, les phénotypes les plus matures peuvent être présents y compris les marqueurs exprimant doublecortine et Tuj1 pour la lignée neuronale, GFAP pour les astrocytes et PDGFaR et GalC pour la lignée oligo Afin de maximiser hautement enrichi GRP de la population de la piscine à partir hétérogène (figure 1A), les cellules peuvent être à double-immunopanned pour sélectionner et d'éliminer les E-NCAM + de cellules suivie par la sélection pour la A2B5 + de la population GRP fois la densité des cellules a augmenté à environ 85-90% de confluence dans des flacons T75. Ces cellules GRP maintenir leur capacité à devenir des astrocytes en dépit d'être dans un milieu qui sélectionne pour le phénotype des oligodendrocytes afin ultérieure A2B5 immunopanning peut être nécessaire pour maintenir une population hautement enrichi GRP. Immunopanning GENERrendements allié jusqu'à 95% A2B5 + de cellules, mais pour le rendement encore plus A2B5 billes magnétiques conjuguées (Miltenyi Biotec Inc) peut être utilisé pour fournir un rendement de jusqu'à 97%. Vigilance dans les cultures GRP de maintenance telles que les changements de supports réguliers permettra de minimiser la prolifération des types de cellules non-GRP. Même en l'absence de la BMP-4 astrocytes peuvent encore être trouvés et appauvri les médias, en particulier, semble induire la différenciation d'un phénotype astrocytaire. Bien que le supplément B27 contient l'hormone de tri-iodothyronine (T3), il n'y a pas la tendance observée à se différencier en oligodendrocytes dans la population GRP, uniquement lorsque des niveaux plus élevés de T3 sont ajoutés au milieu de ce phénomène ne se produit. Toutefois, un T3 libre B27 supplément peut être substitué si il ya une préoccupation pour la contamination par les oligodendrocytes matures (figure 1B). Ces cellules GRP peuvent être facilement identifiés par leur morphologie du soma petite avec 2 ou 3 processus courts, mais à l'écran pour d'autres types cellulaires qui peuvent être présents, immunocytochemistry peut être effectuée que pour les communes précédemment cités marqueurs de type de développement et de la cellule spécifiques. Il y aura généralement une petite population persistante de A2B5 des cellules qui sont neuroépithéliale (NEP) et capable de devenir soit GRP ou PNR. Heureusement, les cellules les plus longues sont maintenues dans le milieu GRP plus il est probable que le milieu sera sélectionné pour le phénotype GRP. <img alt="Figure 1." src="/files/ftp_upload/3462/3462fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 1."> Figure 1. A) plaqué cellules de la moelle épinière de morphologie hétérogène sont observées après 2 jours de culture. B) Immunopanning maximise une très GRP enrichi la population de la piscine à partir hétérogène. </ol>

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</ol>

Cette étude a été financée par le National Institute of Health [P30HD024061 NICHD (AWP), NINDS K08NS063956 (AF), et R01NS028208 (MVJ)] et la Fondation Child Neurology. Le contenu de ce rapport n&#39;engagent que la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de l&#39;Institut national de la Santé, DHHS. Les auteurs n&#39;ont aucun conflit d&#39;intérêt pertinent pour cette étude.

<p class="jove_content"&gt; Les troubles de la matière blanche du système nerveux central comprend un grand nombre d&#39;étiologies, y compris génétiques, les causes inflammatoires, ischémiques et toxiques<sup&gt; 19,21,22,23,24</sup&gt;. Bien que la sclérose en plaques et vasculopathies sont la principale cause de la maladie de la substance blanche chez les adultes, la leucomalacie périventriculaire associée à la prématurité est la cause la plus fréquente de blessures de la substance blanche dans la population infantile. Afin de mieux délimiter les mécanismes des maladies une étude plus approfondie de la lignée des cellules ofoligodendrocytic, qui sont fortement touchés par l&#39;insulte périnatale, est nécessaire. PEB ont été isolés à partir de la moelle épinière des rongeurs embryonnaire et se sont révélés tripotential dans la nature, donnant lieu à des oligodendrocytes et astrocytes deux populations distinctes, mais ne se différencient en neurones<sup&gt; 2,25,26</sup&gt;. De même, les cellules précurseurs d&#39;oligodendrocytes (OPC) provenant du nerf optique chez le rat et à la fin du cerveau embryonnaire ou postnatale précoce chez le rat ont été démontrées à échéance en oligodendrocytes qui fonctionnent dans les conditions appropriées médias<sup&gt; 27,28</sup&gt;. En outre, fœtales ou adultes dérivées de l&#39;homme OPC ont encore été manipulés en plus matures phénotypes oligodendrocytes<sup&gt; 29,30</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Cellules GRP ont été isolés à la fois de la moelle épinière de rats et E13.5 E12-13.5 chez la souris. Dans les différences de rat ont été signalés entre les cellules GRP dorsale et ventrale-dérivé dans leur réponse à des conditions qui favorisent la production d&#39;oligodendrocytes, les astrocytes ou avec ventrale dérivés PEB présentant une plus grande propension à se différencier en des phénotypes plus matures<sup&gt; 25,26,28</sup&gt;. C&#39;est peut être dû à la face ventrale de la migration dorsale des cellules GRP naissantes, qui pourraient être moins réceptifs aux signaux de différenciation. Immunopanning permet de la sous-population qui exprime A2B5 à être isolées et recueillies pour le maintien en culture.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Nos souris cultures GRP sont dérivées de tissus de la moelle épinière qui donne au total un groupe hétérogène, la population regroupée de cellules à partir desquelles les cellules GRP sont sélectionnés par des méthodes chimiques (moyennes) et les techniques de base d&#39;anticorps. Bien que nos études ont utilisé la moelle épinière de souris des cellules dérivées GRP, il a plus récemment été rapporté la dérivation de cellules de cerveau de souris progénitrices oligodendrocytes dérivées qui sont également capables de développer en oligodendrocytes matures<sup&gt; 31</sup&gt;. Ici, les cellules dérivées sont initialement cultivées comme oligospheres que l&#39;utilisation du milieu de culture approprié sont manipulées dans un PDGFαR enrichi +, la population OPC<sup&gt; 31</sup&gt;. Nos études ont porté sur l&#39;effet de notre modèle de hypoxique-ischémique insulte sur les cellules dans le spectre de la lignée des oligodendrocytes A2B5 + et PDGFαR-GRP précurseurs de la protéine basique de myéline (MBP exprimant +) oligodendrocytes matures. En effet, notre<em&gt; In vitro</em&gt; Caractérisation a montré que ces cellules immatures GRP matures dans les cellules exprimant MBP soit en monoculture ou en co-cultures avec les neurones corticaux. Ces cellules peuvent être manipulées dans la culture en matière de voies de différenciation spécifiques pour étudier les mécanismes impliqués dans la question des blessures périnatale blanc. Il ya plusieurs modèles murins de maladies de la substance blanche impliquant des cellules de la lignée des oligodendrocytes et la disponibilité de cette population permet une enquête approfondie sur les mécanismes qui causent des blessures ainsi que d&#39;explorer l&#39;utilité des options possibles de thérapie cellulaire.</p

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Entreprise </th><th> Numéro de catalogue </th></tr><tr><td> DMEM / F12 01:01 </td><td> Invitrogen </td><td> 11320033 </td></tr><tr><td> B27 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504044 </td></tr><tr><td> N2 </td><td> Invitrogen </td><td> 17502048 </td></tr><tr><td> rH-FGF-base </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0026 </td></tr><tr><td> Trypsine (0,05%) EDTA </td><td> Qualité biologique, Inc </td><td> 118-087-721 </td></tr><tr><td> POLY-L-LYSINE HBr </td><td> Sigma </td><td> P1274-25MG </td></tr><tr><td> La laminine </td><td> Sigma </td><td> L2020-1MG </td></tr><tr><td> DNase 1 </td><td> Sigma </td><td> DN25 </td></tr></tbody></table>

dérivation de précurseurs gliales restreint de souris e13

Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice

Il s&#39;agit d&#39;un protocole pour la dérivation de la gliales restreints précurseurs (GRP), les cellules de la moelle épinière de fœtus de souris E13. Ces cellules sont les signes précurseurs de la lignée cellulaire oligodendrogliome. Récemment, ces cellules ont été étudiées en tant que source potentielle de thérapies réparatrices dans les maladies de la substance blanche. Leucomalacie périventriculaire (PVL) est la principale cause de non-maladie génétique de la substance blanche dans l&#39;enfance et touche jusqu&#39;à 50% des grands prématurés. Les données suggèrent une sensibilité accrue du cerveau en développement à l&#39;hypoxie-ischémie, le stress oxydatif et l&#39;excitotoxicité qui cible sélectivement naissante de la substance blanche. Gliales précurseurs restreintes (GRP), des cellules progénitrices oligodendrocytes (OPC) et les oligodendrocytes immatures (preOL) semblent être des acteurs clés dans le développement de PVL et font l&#39;objet de poursuite d&#39;études. En outre, des études antérieures ont identifié un sous-ensemble du tissu du SNC qui a augmenté la sensibilité au glutamate excitotoxicité queainsi que d&#39;un modèle de développement à cette sensibilité. Notre laboratoire étudie actuellement le rôle de progéniteurs d&#39;oligodendrocytes dans les cellules PVL et l&#39;utilisation à l&#39;étape de GRP de développement. Nous utilisons ces cellules dérivées GRP dans plusieurs paradigmes expérimentaux pour tester leur réaction à sélectionner des contraintes compatibles avec PVL. Cellules GRP peut être manipulé in vitro dans les OPC et preOL pour des expériences de transplantation avec des modèles de souris et de PVL dans les modèles in vitro de PVL-comme les insultes, y compris l&#39;hypoxie-ischémie. En utilisant des cellules en culture et dans les études in vitro il serait réduit la variabilité entre les expériences qui facilite l&#39;interprétation des données. Les cellules cultivées permet également à l&#39;enrichissement de la population GRP, tout en minimisant l&#39;impact de contaminer les cellules de phénotype non-GRP.

Ce protocole décrit la dérivation de précurseurs gliales fœtales restreintes de la moelle épinière et maintenues in vitro, soit à la transplantation ou à l&#39;étude de la lignée oligodendrogliome.

Dérivation de précurseurs gliales restreint de souris E13

Ceci est un protocole pour la dérivation de cellules précurseurs restreintes aux glies (GRP) à partir de la moelle épinière de fœtus de souris au stade E13. Ces cellules sont des précurseurs précoces...

L'objectif général de cette procédure est d'obtenir des précurseurs restreints aux cellules gliales, ou cellules GRP, à partir de moelles épinières fœtales. Cette étape est réalisée en extrayant les moelles épinières de fœtus à J 13 et en les transférant dans des plaques de culture contenant un milieu sélectif pour les cellules GRP. Ensuite, une immunopanning est utilisée pour enrichir la population de cellules GRP et éliminer les cellules n'appartenant pas à la lignée GRP.Les cellules GRP purifiées peuvent être congelées et placées en stockage à long terme. Les cellules GRP purifiées peuvent être décongelées et utilisées pour des expériences futures, telles que la mise en évidence de la migration de cellules GRP transplantées à travers un passage large d'une seule cellule. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes chirurgicales peuvent être difficiles à apprendre, notamment pour un œil inexpérimenté.Pour la démonstration d'aujourd'hui, Roche De Silva et Joel Marx, étudiants dans notre laboratoire. Obtenez des souris gestantes aux jours embryonnaires E 12 ou E 13 du développement fœtal auprès d'une source commerciale ou préparées en interne. Le jour E 1 est défini par la présence d'un bouchon de mucus situé au niveau vaginal.Le jour suivant, une femelle en chaleur est logée avec un mâle après avoir désinfecté tous les instruments et la hotte de culture tissulaire. Préparez une boîte de Pétri propre contenant 20 millilitres de milieu de dissection froid. Ensuite, préparez la souris à l’aide d’une injection anesthésiante de chloral hydrate.Une fois que la souris ne présente plus de réflexe de douleur à la pincée des orteils, par exemple, euthanasiez-la par dislocation cervicale ou par décapitation. Nous préférons ne pas utiliser de CO2 pour anesthésier l'animal en raison de ses effets secondaires possibles sur la viabilité des fœtus et, par conséquent, sur les cellules obtenues. Après avoir désinfecté la région abdominale, ouvrez l'abdomen à l’aide de grandes ciseaux et d’une pince pour retirer l’utérus. Selon la souche, l’utérus contiendra de huit à quatorze fœtus.Placer l'utérus dans un milieu de dissection froid et frais dans une boîte de Pétri propre pour isoler les fœtus. Tout d'abord, éliminer le sang et les tissus excédentaires. Ensuite, extraire chaque fœtus de la corne utérine et le séparer du sac embryonnaire et du placenta.À l’aide de petites ciseaux, transférez les fœtus dans une boîte contenant du milieu de dissection frais et froid. Le milieu froid réduira l’activité métabolique et préservera la viabilité des cellules obtenues. Sous un microscope stéréo, utilisez une pince et des ciseaux à ressort pour inciser la peau le long de la moelle épinière, la décoller délicatement et exposer la moelle épinière.Transecter la moelle épinière autour de C1 et au début de la queue. Ensuite, retirer soigneusement la moelle épinière avec tous ses os et cartilages, puis transférer et recueillir chaque moelle épinière préparée dans un même plat. À l’aide d’un milieu de dissection frais, nous récoltons l’ensemble de la moelle épinière, même s’il existe une population plus importante de cellules GRP à cet endroit.Cependant, le milieu GRP sélectionne finalement le phénotype GRP, et cette population est davantage maximisée par l'immunotraitement H deux B cinq afin d'éviter la surcroissance du tissu méningé. Dans les cultures cellulaires ultérieures, retirez autant que possible les méninges de la moelle épinière en raison des nerfs périphériques naissants qui en émergent. Cette étape est plus difficile que le retrait du tissu méningé du cerveau extrait.Une fois que la majeure partie des méninges a été retirée, transférez les moelles épinières dans une boîte de Pétri de 20 millimètres et procédez à la dissociation. Les cellules en préparation. Préchauffez un aliquot de trypsine pendant au moins une demi-heure dans un bain-marie à 37 degrés Celsius.Les étapes suivantes doivent être effectuées rapidement afin d'améliorer la viabilité du tissu médullaire obtenu. Transférez les moelles épinières dans un tube de centrifugeuse de 50 millilitres contenant de la trypsine et des ADN. Ensuite, homogénéisez brièvement le mélange à l’aide d’une pipette.Incuber le mélange pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Agiter à nouveau, puis poursuivre l'incubation pendant 10 minutes supplémentaires. Ajouter ensuite cinq millilitres de milieu GRP dans un tube d'ultracentrifugation et centrifuger pendant cinq minutes.À 1000 tr/min, aspirez le surnageant et resuspendez. Suspendez le culot dans 10 millilitres de milieu GRP avec DNAs one. Incubez ensuite pendant 10 minutes supplémentaires et centrifugez les cellules à 1000 tr/min pendant cinq minutes.Aspirez le surnageant et resuspendez le culot dans du milieu GRP frais. Faites passer les cellules à travers un tamis cellulaire de 40 à 70 microns et ensemencez-les dans des flacons T25 revêtus de PLL-laminine.Incuber les cellules et changer 100 % du milieu le lendemain, puis tous les deux jours ou plus fréquemment si les nutriments sont épuisés. À ce stade, les GRP se sont fixés et ont commencé à émettre des prolongements, et ils peuvent être optimisés par immunopanning. Continuer la culture des cellules jusqu'à ce qu'elles atteignent une confluence de 85 à 90 % ou qu'une semaine se soit écoulée.Ensuite, récoltez les cellules à l’aide d’un racloir en caoutchouc ou de trypsine. Resuspendez les cellules dans un milieu frais et amplifiez-les dans trois flacons T25, en changeant le milieu au moins toutes les 48 heures. Lorsque les flacons ont atteint la confluence, récoltez-les comme précédemment dans cinq millilitres de milieu GRP. Agitez la suspension cellulaire pour dissocier les agrégats et transférez-la dans une boîte bactériologique A2B5 revêtue.Incuber les cellules dans des boîtes de Pétri sur des plaques A deux B pendant une heure à température ambiante sans agitation. Ensuite, aspirer le milieu et laver les plaques de quatre à huit fois avec du PBS afin de maintenir une forte stringence contre la liaison non spécifique des cellules à la plaque. À l’aide d’un racloir en caoutchouc.Récupérez les cellules lavées dans deux millilitres de milieu GRP, puis transférez la suspension dans des plaques ou flacons revêtus de lamines PLL contenant du milieu GRP. Une fois que les cellules ont atteint une confluence de 85 à 90 %, récoltez-les à l’aide de trypsine, diluez et inactiverez ensuite la trypsine avec huit millilitres de milieu GRP stock, puis récupérez les cellules sous forme de culot. Resuspendez le volume de cellules provenant d’un flacon T25 dans un millilitre de milieu de congélation GRP ou celui des cellules provenant d’un flacon T75 dans deux millilitres de milieu de congélation GRP.Ajustez la concentration de la suspension cellulaire si nécessaire, puis transférez les cellules dans des flacons cryogéniques. Congelez lentement les cellules pendant la nuit dans un conteneur cryogénique contenant de l'isopropanol à moins 80 degrés Celsius. Le jour suivant, transférez les cellules en stockage à long terme. Les cellules présenteront une viabilité de 60 à 80 % après décongélation, six mois à un an plus tard.La viabilité dépend largement de la qualité du revêtement de laminine PLL. Après deux jours en culture, des cellules de la moelle épinière présentant différentes morphologies ont été observées avec un enrichissement maximal. Les cellules de la population GRP sont immunopancréatiques pour sélectionner la population A deux B cinq.En cas de contamination par des cellules épithéliales neuroépithéliales, un double panning immuno peut être utilisé pour éliminer d'abord la population positive pour NCA, suivie d'une sélection A deux B cinq. Un supplément B 27 sans T trois a été ajouté afin de réduire la contamination par les oligodendrocytes matures. Les cellules GRP purifiées étaient identifiables par leur petit corps cellulaire et leurs deux ou trois prolongements courts.Souvent, il existait également une petite population persistante de cellules négatives pour A deux B cinq, de type neuroépithélialles et capables de devenir soit des GRP soit des N rp. Heureusement, plus les cellules étaient maintenues en milieu GRP, plus elles adoptaient probablement le phénotype GRP. Les techniques de base de cette procédure peuvent être utilisées pour obtenir d'autres types cellulaires, ce qui permettrait de répondre à d'autres questions, comme savoir quelle cellule est mieux adaptée à une thérapie par remplacement cellulaire ou si des neurones dérivés du cortex peuvent constituer de bons modèles pour la myélinisation in vitro.

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Cette vidéo décrit la méthode utilisée pour l'isolement de neuroprecursors du cortex en développement de souris embryonnaires. La procédure pour la suppression des embryons dans l'utérus, la dissection du tissu cortical, et digérant le cortex cérébral est démontré isolés.

Culture de la souris de neurones précurseurs de cellules souches

La vidéo a démontré la méthode d’isolement et de culture de cellules à partir du cerveau d’une souris néonatale. Il impliquait une dissociation enzymatique et mécanique du cerveau, suivie d’une culture dans un milieu de croissance dépourvu de facteur de croissance neuronale pour obtenir une population gliale mixte.

Obtention d’une culture mixte de cellules gliales à partir d’un cerveau de souris néonatale

La transplantation de cellules souches / progénitrices neurales (PNJ) détient de grandes promesses en neurologie régénérative. L'administration systémique de PNJ est devenu faible invasive, et thérapeutique très efficace protocole efficace, pour fournir des cellules souches dans le cerveau et la moelle épinière des rongeurs et des primates non humains touchés par les dégâts inflammatoire chronique expérimentale du système nerveux central.

Injection systémique de cellules neurales souches / progénitrices chez des souris atteintes d&#39;EAE chronique

Cette procédure montre comment cibler les interneurones dans le cerveau antérieur de souris en développement au moyen de l’électroporation in utero. Cette technique s’est avérée particulièrement efficace pour obtenir une expression génique sélective dans des sous-types d’interneurones destinés aux couches superficielles du cortex.

Sous-sélective électroporation corticaux Interneurones

Génération de cellules souches pluripotentes induites offre des perspectives fascinantes pour la dérivation de la greffe autologue. Toutefois, la progression à travers un état pluripotent et laborieux re-différenciation entrave encore la traduction clinique. Nous décrivons ici la dérivation des fibroblastes humains adultes et leur conversion directe dans des cellules progénitrices neurales induites et la différenciation ultérieure dans les lignées neurales.

Dérivation des adultes fibroblastes humains et de leur conversion directe dans les cellules progénitrices neurales extensible

Ce protocole décrit une méthode pour générer des progéniteurs interneurones corticaux et des interneurones post-mitotiques précurseurs de cellules souches embryonnaires de souris à l’aide d’une méthode modifiée de corps-à-monocouche embryoïdes. Ces cellules souches/précurseurs peuvent être utilisés in vitro fluorescent triés et transplantés dans le néocortex néonatal pour l’étude de détermination de sort ou utilisés dans des applications thérapeutiques.

Différenciation des cellules souches embryonnaires de souris en précurseurs des interneurones corticaux

Nous décrivons ici l’isolement de cellules gliales-entérique de la sous-muqueuse intestinale à l’aide des incubations EDTA séquentielles pour chélater les cations divalents, puis incubation dans une solution de récupération non enzymatique cellulaire. Placage de la suspension de cellules qui en résultent sur le poly-D-lysine et de la laminine se traduit par une culture fortement enrichie des cellules gliales sous-muqueux analyse fonctionnelle.

Isolement des cellules gliales entériques de la sous-muqueuse et de la Lamina Propria de la souris adulte

Ici, nous présentons une nouvelle technique microchirurgicale pour isoler des cellules souches neurales de l’éminence E13 souris embryon ganglionnaire.

Isolement et Culture des embryons de souris des cellules souches neurales

Nous présentons ici un protocole pour l’isolement in vitro de plusieurs populations de cellules gliales à partir d’un SNC de souris. Cette méthode permet la ségrégation de la microglie régionale, des cellules précurseurs d’oligodendrocytes et des astrocytes pour étudier les phénotypes de chacun dans une variété de systèmes de culture.

Dissection et isolement de la glie murine de plusieurs régions du système nerveux central

Nous décrivons la procédure de différenciation in vitro des cellules souches embryonnaires de souris en cellules neuronales en utilisant la méthode de la goutte suspendue. De plus, nous effectuons une analyse phénotypique complète par RT-qPCR, immunofluorescence, séquençage de l’ARN et cytométrie en flux.

Différenciation et caractérisation des progéniteurs neuronaux et des neurones à partir de cellules souches embryonnaires de souris

Au cours du développement du cortex cérébral, les neurones et les cellules gliales proviennent de la zone ventriculaire qui tapisse le ventricule et migrent vers la surface du cerveau. De nombreux gènes sont impliqués dans ce processus. Ce protocole introduit la technique d’imagerie en accéléré des neurones en migration et des progéniteurs gliaux.

Imagerie en accéléré de neurones migrateurs et de progéniteurs gliaux dans des tranches de cerveau de souris embryonnaires

Découvrez la dérivation de précurseurs gliales restreints à partir de moelles épinières fœtales de souris E13. Cette méthode utilise l'immunopanning pour enrichir les populations GRP et étudier la lignée oligodendrocytaire.

Dérivation de précurseurs gliales restreint de souris E13

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