Dynamique présynaptique de la dopamine dans le striatum avec des tranches de cerveau de voltampérométrie cyclique à balayage rapide

L'objectif général de cette procédure est d'illustrer un protocole général pour la télémétrie à balayage rapide par tranches en voltammétrie cyclique. Cela est réalisé en préparant d'abord le tissu cérébral pour des coupes coronales. Ensuite, des électrodes sont placées sur la région cérébrale discrète d'intérêt.

L'étape suivante consiste à appliquer une tension sous forme d'onde triangulaire via l'électrode afin de détecter la dopamine. Enfin, un agent pharmacologique d'intérêt est appliqué sur la tranche de cerveau et son effet sur la dynamique présynaptique de la dopamine est observé. En définitive, ce protocole met en évidence des modifications de la dynamique présynaptique de la dopamine, telles que la libération de dopamine induite et les taux de captation de la dopamine par voltampérométrie cyclique rapide.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la dynamique de la dopamine présynaptique, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, y compris des animaux et des neurotransmetteurs, tels que les rats et les mouches drosophiles, ainsi que la sérotonine et la norépinéphrine. La démonstration de la procédure sera effectuée par Francis Mena, MEA Khalid et Erin oo, étudiants diplômés de mon laboratoire. Pour commencer cette procédure, conformément au manuscrit accompagnant, préparez trois types de solutions de liquide céphalorachidien artificiel : une solution de saccharose A-C-S-F-A-C-S-F pour les enregistrements voltamétriques et une solution A CSF modifiée pour l'étalonnage des électrodes. Ensuite, transférez 10 millilitres de la solution de saccharose A CSF dans un petit bécher et placez-le dans un seau à glace. Puis placez l'adhésif instantané Loctite dans un seau à glace.

Ensuite, préparez une lame de rasoir et les outils nécessaires à la dissection, tels que des pinces, une spatule et des ciseaux, en les essuyant avec un tampon imbibé d'alcool. Puis sacrifiez une souris par décapitation et retirez rapidement son cerveau. Placez le cerveau dans un bécher contenant du saccharose glacé, une ASC pendant environ 10 minutes.

Entre-temps, préparez le VIBRAM pour la découpe. Placez de la glace pilée dans le bain d'échantillons. Ensuite, placez la chambre à échantillons dans le Vibram et fixez-la fermement.

Ajoutez plus de glace autour de la chambre à échantillons pour combler les espaces et veillez à ce qu'aucune glace n'entre dans la chambre. Ensuite, placez une lame de rasoir nettoyée dans le porte-lame. Puis remplissez la chambre à échantillons avec du LCR au saccharose glacé.

Ensuite, versez un peu de solution de saccharose froide A CSF sur un morceau de papier absorbant placé sur une boîte de Pétri retournée. Transférez-y le cerveau de souris fraîchement disséqué à l’aide d’une pince. Puis retirez le cervelet en coupant le long de l’axe médio-latéral avec une lame de rasoir.

Cela crée une base plate qui peut être fixée sur la platine vibram. Ensuite, ajoutez une goutte d'adhésif Loctite sur la platine de l'échantillon. Fixez immédiatement l'extrémité plate du cerveau préparé sur la platine, en la maintenant aussi droite que possible.

Ensuite, placer la platine dans la chambre d'échantillons et serrer la vis. S'assurer que le cerveau est complètement immergé dans la solution de Ringer au saccharose dans la chambre. Après cela, régler la platine à l'aide de la commande afin que la lame de rasoir soit alignée avec le sommet du cerveau.

Les paramètres optimaux pour le vibrotron sont obtenus en réglant la fréquence et la vitesse sur faible. Ensuite, réglez l'épaisseur des tranches à 400 micromètres. Les premières tranches ne contiennent généralement pas le striatum.

Répétez la section jusqu'à l'obtention des tranches contenant le striatum. Une fois la région AAL du striatum atteinte, utilisez un pinceau pour soulever la tranche et la placer dans un bécher contenant du liquide céphalorachidien (CSF) oxygéné à température ambiante.

Typiquement, on peut obtenir trois à quatre tranches contenant le complexe striatal dans lesquelles sont inclus le putamen caudé et le noyau accumbens. Laisser les tranches s'acclimater dans un liquide ACSF saturé avec un mélange de 95 % O₂ et 5 % CO₂, à température ambiante, pendant au moins une heure avant de commencer l'expérience. Pour débuter cette procédure, raccorder le tube au caisson d'enregistrement par immersion.

Ensuite, pompez le LCR A oxygéné à température ambiante à raison d'un millilitre par minute. Réglez le contrôleur de température à 32 degrés Celsius une fois que le LCR A a rempli le support sur mesure pour tranches. Éliminez toute bulle d'air située sous le maillage à l'aide d'une seringue munie d'une aiguille.

Créez une pression négative dans le tube de sortie à l’aide d’une seringue afin de démarrer l’écoulement pour contrôler le trop-plein de tampon. Placez un essuie-tout Kim sur le bord du support de coupe pour servir de mèche. Transférez ensuite une coupe vers le support de coupe dans la chambre d’enregistrement, qui est continuellement perfusée avec un liquide céphalorachidien artificiel (ACSF) oxygéné à température ambiante.

Immergez l'électrode de référence au chlorure d'argent dans le support de tranches et connectez-la à l'étage de tête à l'aide d'une pince crocodile. Fixez l'électrode microfibre en carbone au micromanipulateur et reliez-la à l'étage de tête à l'aide d'une pince crocodile. Ensuite, abaissez l'électrode de stimulation en tungstène et l'électrode microfibre en carbone jusqu'à la surface de la tranche cérébrale de sal.

L'électrode de stimulation sera utilisée pour délivrer soit une impulsion unique, soit plusieurs impulsions de stimulations électriques à la tranche afin d'induire la libération de neurotransmetteurs, permettant ainsi de mesurer la dopamine évoquée électriquement à l'aide de la voltammétrie cyclique à balayage rapide, ou FSCV, en appliquant une tension sous forme d'onde triangulaire à l'électrode. Maintenir le potentiel de l'électrode microfibre de carbone à -0,4 volt. L'augmenter jusqu'à une limite positive de 1,2 volt.

Ensuite, ramener la tension à moins 0,4 volt à une vitesse de balayage de 400 volts par seconde. Stimuler la tranche toutes les cinq minutes et effectuer la mesure volumétrique du FLX de dopamine résultant pendant 15 secondes à chaque fois, après au moins trois stimulations. Les enregistrements de libération de dopamine stimulée électriquement stables sont définis comme présentant une différence inférieure à 10 % entre les hauteurs des pics.

Passer à la perfusion de la coupe avec un LCR contenant l'agent pharmacologique d'intérêt à un débit de un millilitre par minute pendant 30 minutes afin d'obtenir un effet maximal similaire à l'enregistrement de base. Mesurer la libération de dopamine induite électriquement toutes les cinq minutes pendant la perfusion pharmacologique. La figure A illustre un exemple de mesure de la libération de dopamine évoquée électriquement par VSCF, suite à une stimulation par impulsion unique dans le corps strié.

La figure B montre un tracé tridimensionnel en fausses couleurs qui combine les informations provenant à la fois des tracés du courant en fonction du temps et de la voltammétrie cyclique de Graham. De même, les figures A et C illustrent la libération de dopamine induite par une impulsion unique de stimulation électrique dans le noyau accumbens, respectivement dans la partie centrale (core) et dans la coquille (shell), tandis que les tracés tridimensionnels en fausses couleurs correspondant au noyau accumbens, partie centrale et coquille, sont indiqués respectivement dans les figures B et D. Sont représentés ici des tracés typiques obtenus après traitement de la coupe par un agent pharmacologique pendant 30 minutes, suivie d'une stimulation par impulsion unique afin d'induire la libération de dopamine dans le striatum dorsal (caudate putamen).

Les agents utilisés dans les expériences sont la quinolone, la méthamphétamine et le facteur neurotrophique dérivé du cerveau. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation de tranches coronales de cerveau de souris afin d'obtenir et de mesurer la dynamique présynaptique de la dopamine à l'aide de la télémétrie rapide et probablement fiable.