Name: Verser et exécution dun gel de protéine en réutilisant Cassettes commerciaux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Découvrez comment réutiliser des cassettes Invitrogen Nupage Novex pour couler vos propres gels de polyacrylamide. Cette méthode économique permet de stocker les gels à 4°C pendant plusieurs semaines et réduit les déchets plastiques en laboratoire.

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Les auteurs tiennent à remercier l&#39;Institut médical Howard Hughes pour une science UF pour l&#39;attribution de la vie à AH

1. Préparation des cassettes <ol><li> Avant et arrière Clean plaques d'un employé Invitrogen NuPAGE cassette de Novex minigel, ou d'autres cassettes minigel commerciale. </li><li> Préparer ml environ 1-3 de plastique époxy et bien mélanger selon les instructions du fabricant. </li><li> Appliquer la résine époxy à l'arête intérieure de la plaque avant, où les deux plaques ne viennent en contact lorsque la cassette est assemblé. </li><li> Coulisser un morceau de papier filtre ou de carton à travers la fente inférieure de la plaque arrière lors de l'assemblage de la cassette pour éviter l'excès de résine époxy sceller l'ouverture. Retirez le papier du filtre dès que les deux plaques sont assemblées. </li><li> Placez clips liant le long des bords pour un joint étanche, et laissez-les reposer toute la nuit cassettes pour l'époxy pour durcir complètement. </li><li> Sceller la fente sur le bas de la plaque arrière avec du ruban électrique. </li></ol> 2. Coulage du gel de résolution <ol><li> Pour un flacon de 125 ml côté du bras, ajouter ce qui suit:2,25 ml de 4X Tris-Base gel de résolution tampon pH 8,70, 3,50 ml d'acrylamide 30,8% / bisacrylamide, 3,25 ml de type I eau de qualité réactif (IRG-H 2 O) pour un volume total de 9 ml. </li><li> Dégazer la solution pendant 10 min en attachant le bras latéral du récipient à un appareil à vide, et placer un bouchon inversé sur le dessus de la fiole. </li><li> Transférer le 9 ml de solution dégazée à un 50 ml polypropylène centrifugeuse tube jetable et ajouter 30 ul de persulfate ammounium 10% (APS) et 6 ul de N, N, N ', N',-tétraméthyléthylènediamine (TEMED) et mélanger ainsi en agitant la solution pour éviter l'introduction de bulles. </li><li> Verser immédiatement la solution dans la cassette, ce qui lui permet de fonctionner sur le côté de la cassette pour éviter toute formation de bulles entre les plaques de gel. Remplissez la cassette à environ 2 cm du bord supérieur de l'avant (plus courte) plaque. </li><li> Doucement, ajoutez 0,5 ml de 1-butanol saturé d'un tampon 1X gel de résolution et de laisser le gel polymériser pour 1heures. </li></ol> 3. Verser le gel d'empilement <ol><li> Ajoutez le code suivant dans une fiole de 125 ml côté du bras: 0,75 ml de 4X Tris-Base pH du gel de tampon d'empilage 6,80, 0,40 ml d'acrylamide 30,8% / bisacrylamide, 1,85 ml de l'IRG-H 2 O pour un volume total de 3 ml. </li><li> De-gaz de la solution pendant 10 min comme décrit dans l'étape 2. </li><li> Alors que la solution de gel d'empilement est de dégazage, verser le 1-butanol saturé d'un tampon 1X gel de résolution à partir du haut du gel de résolution. Rincez la partie supérieure du gel résoudre une fois avec du GRI-H 2 O. Verser l 'eau et utiliser un papier absorbant ou filtre Whatman pour absorber tout le liquide restant. </li><li> Retirer 3 ml de votre solution dégazée et ajouter 9 pi de l'APS 10% et 2 pi de TEMED et bien mélanger. </li><li> Verser rapidement la solution dans la cassette, ce qui lui permet de fonctionner sur le côté de la cassette jusqu'à ce qu'il se trouve à proximité du bord supérieur de la plaque de gel plus courte devant. </li><li> Insérer un peigne gel propre dans la partie supérieure de la cassette de gel,placez un clip liant sur la cassette sur le peigne pour le maintenir en place. Laissez le gel d'empilement polymériser pendant 1 heure ou toute la nuit. </li></ol> 4. Stockage du gel <ol><li> Lorsque le gel est complètement polymérisée, retirer les clips de liant et placer la cassette dans un sachet en plastique thermosoudable, ou un sac en plastique refermable. </li><li> Verser 20 ml de tampon 1X gel d'empilement qui contient de l'azide de sodium à 0,1% dans la poche. </li><li> Chauffer sceller le sachet pendant 5 secondes et assurez-vous qu'il n'ya aucune fuite dans le sac. </li><li> Conserver le gel à 4 ° C. </li></ol> 5. Préparation des échantillons <ol><li> Dans un microtube à paroi mince, ajouter jusqu'à 6,5 ul de l'échantillon de protéines, 7,5 ul de 2x Novex Tris-Glycine tampon d'échantillon SDS, 1 pl de 100 mM (DTT) et dithiothréitol GRI-H 2 O (si nécessaire) pour un volume total de 15 pi. </li><li> Mélanger l'échantillon par vortex, et brièvement centrifuger l'échantillon pour amener le contenu de la partie inférieure du tube. </li> &lt;p&gt; Dénaturer l'échantillon à 70 ° C pendant 10 min. </ol> 6. Exécution du gel <ol><li> Mettre en place l'appareil à gel Novex. </li><li> Ajouter 200 ml de tampon de migration Tris-Glycine qui contient 500 ul d'antioxydant NuPAGE à la chambre intérieure, et 300 ml de Tris-Glycine Running tampon à la chambre extérieure. </li><li> Chargez les échantillons de protéines dénaturées (15 pi) dans les puits en utilisant un gel de chargement pointe de pipette. </li><li> Exécutez le gel à 200 V pour 60-70 min. </li></ol> 7. La coloration du gel <ol><li> Retirer la cassette de l'appareil de gel et rompre le joint époxy en faisant levier les deux plaques de gel de plastique en dehors aide d'un couteau de gel ou d'une spatule rigide. Soigneusement séparer le gel des plaques, en prenant soin de ne pas déchirer le gel. </li><li> Rincer le gel avec du GRI-H 2 O trois fois avec une légère agitation. </li><li> Colorer le gel avec Invitrogen SimplyBlue SafeStain pendant 1 heure sous agitation douce. </li><li> Décanter la solution de coloration et dedécolorer le gel avec du GRI-H 2 O. </li></ol> 8. Nettoyage des cassettes <ol><li> Utilisez une spatule en métal pour gratter ou peler tout l'époxy sur les cassettes afin qu'ils puissent être réutilisés à nouveau. </li><li> Laver chacun des plaques de gel de plastique avec une solution de détergent doux, et rincez bien avec de l'eau du robinet puis à l'eau distillée. </li></ol> 9. Les résultats représentatifs Parce époxy formera un joint étanche à l'eau, (Figure 1), les cassettes ne fuira pas quand la solution d'acrylamide est versé dans les. En outre, les cassettes de gel peut être facilement ouverte pour récupérer le gel pour la coloration, et la résine époxy peut être enlevée des cassettes pour permettre leur maintien réutilisation. Comme le montre la figure 2, le gel montre une séparation claire des marqueurs protéiques et des bandes d'échantillons appropriés pour l'électrophorèse des protéines de routine. <img src="/files/ftp_upload/3465/3465fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Applications d'époxy pour sceller des cassettes MiniGel. une couche mince de résine époxy est appliquée à l'arête de l'une des cassettes avant le montage. Afin de souligner l'époxy, il était faux de couleur rouge sur cette image. <img src="/files/ftp_upload/3465/3465fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Séparation des protéines sur un gel SDS-Tris-glycine versait à l'aide réutilisés cassettes MiniGel. SDS-PAGE a été réalisée comme décrit ci-dessus. Après électrophorèse du gel a été retiré de la cassette minigel, teinté en SimplyBlue SafeStain selon les instructions du fabricant, et photographiées à l'aide de la lumière blanche transmise. Lane M contient SeeBlue normes Plus2 protéines pré-teint. Les masses moléculaires des protéines dans piste M sont indiqués sur le côté droit du gel en kilodaltons (kDa). Les autres voies montrent protéines à partir d'un lysat clarifié à partir de bactéries exprimant une glutathion-S-transférase (GST)-protéine marquée. Les protéines indiquées sont celles lavé de la gperles lutathione avant élution de la protéine GST-étiquetés.

<ol><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Raymond, S., Weintraub, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acrylamide+gel+as+a+supporting+medium+for+zone+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis.</a> Science. 130, 711-711 (1959).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricine-sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+proteins+in+the+range+from+1+to+100+kDa%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.</a> Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).</li>
<li>Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+weight+estimation+of+polypeptide+chains+by+electrophoresis+in+SDS-polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 28, 815-820 (1967).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Électrophorèse sur gel des protéines est une méthode indispensable pour les laboratoires de biologie moléculaire les plus. Minigels disponibles dans le commerce de fournir un niveau élevé de confort, mais peuvent être coûteux. Ici, nous montrons comment réutiliser les cassettes MiniGel à partir d&#39;une marque populaire de minigels disponibles dans le commerce. Cette méthode conserve la commodité d&#39;avoir une source prête à l&#39;emploi de gels, mais à une fraction du coût de minigels disponibles dans le commerce. U...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Invitrogen NuPAGE Novex minigel cassette (1,0 mm) </td><td> Invitrogen </td><td> NC2010 </td><td> Disponible en 2, 5, 10, 12, 15 et 2D puits </td></tr><tr><td> Epoxy plastique </td><td> Loctite </td><td> 108771 </td><td></td></tr><tr><td> Ruban électrique </td><td> Scotch </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 125 ml flacon bras latéral </td><td> Pyrex </td><td> 5360 </td><td></td></tr><tr><td> 4X Tris-Base gel de résolution du tampon </td><td></td><td></td><td> 1,5 M Tris-base pH 8,7 </td></tr><tr><td> acrylamide </td><td> Fisher Scientific </td><td> 01065-500 </td><td></td></tr><tr><td> Bis-acrylamide </td><td> MP Biomedicals, Inc </td><td> 800173 </td><td></td></tr><tr><td> Solution d&#39;acrylamide 30,8% </td><td></td><td></td><td> 30:0.8 acrylamide: bis-acrylamide dans les GRI-H 2 O </td></tr><tr><td> APS 10% </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP179-25 </td><td> 0,1 g de persulfate d&#39;ammonium dans 1 ml O GRI-H 2, préparée immédiatement avant utilisation </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> Organics Arcos </td><td> 138450500 </td><td></td></tr><tr><td> 1-butanol saturé avec un tampon 1X gel de résolution </td><td></td><td></td><td> 05:02 1-butanol à 1X gel de résolution du tampon </td></tr><tr><td> 4X Tris-Base tampon de gel d&#39;empilement </td><td></td><td></td><td> 1,5 M Tris-base pH 6,8 </td></tr><tr><td> Gel peigne </td><td> Invitrogen </td><td> NC3015 </td><td> 15 bien, 1,0 mm d&#39;épaisseur </td></tr><tr><td> Scellant Impulse </td><td> Equipement TEW Chauffage électrique </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pochette de chaleur plombable </td><td> Kapak / Scotchpak </td><td></td><td> 1 taille pinte (6,5 &quot;x 8&quot;) </td></tr><tr><td> Tampon de stockage Gel </td><td></td><td></td><td> 1X tampon de gel d&#39;empilement avec de l&#39;azoture de sodium à 0,1% </td></tr><tr><td> Novex SDS tampon d&#39;échantillon Tris-Glycine (2X) </td><td> Invitrogen </td><td> LC2676 </td><td></td></tr><tr><td> TNT </td><td> FisherBiotech </td><td> BP172-5 </td><td></td></tr><tr><td> 10X tampon de migration Tris-Gylcine </td><td> Invitrogen </td><td> LC2675 </td><td> 1L de bouillon 10X: 29,0 g de Tris-Base, 144,0 g de glycine, 10,0 g de SDS </td></tr><tr><td> XCell SureLock Mini-Cell </td><td> Invitrogen </td><td> EI0001 </td><td></td></tr><tr><td> Couteau Gel </td><td> Invitrogen </td><td> EI9010 </td><td></td></tr><tr><td> SimplyBlue Safe Stain </td><td> Invitrogen </td><td> LC6065 </td&gt; <td></td></tr></tbody></table>

verser et exécution d&#39;un gel de protéine en réutilisant cassettes commerciaux

Pouring and Running a Protein Gel by reusing Commercial Cassettes

L&#39;évaluation des protéines à l&#39;aide de sodium dodécyl polyacrylamide gel de sulfate de l&#39;électrophorèse (SDS-PAGE) l&#39;analyse est une technique couramment utilisée par les chercheurs en biologie moléculaire et de biochimie 1-4. Pour les laboratoires qui effectuent des analyses quotidiennes de protéines, le coût de gels de polyacrylamide disponibles dans le commerce (~ $ 10/gel) peuvent être considérables au fil du temps. Pour atténuer ce coût, certains chercheurs à préparer leurs propres gels de polyacrylamide. Les méthodes traditionnelles de verser ces gels utilisent généralement l&#39;équipement spécialisé et des plaques de gel de verre qui peuvent être coûteux et s&#39;oppose versant gels de nombreuses et de les stocker pour une utilisation future. En outre, la manipulation de plaques de verre pendant le nettoyage ou le gel versant peut se traduire par un bris accidentel de créer un danger pour la sécurité, ce qui peut empêcher leur utilisation dans les classes de premier cycle en laboratoire. Notre protocole montre comment verser gels de protéines multiples simultanément par recyclage Invitrogen cassettes NuPAGE MiniGel Novex, et peu coûteux mariaux achetés à un magasin de rénovation domiciliaire. Cette méthode économique et rationalisé comprend un moyen de stocker les gels à 4 ° C pendant quelques semaines. En réutilisant les cassettes de gel en plastique à partir de gels disponibles dans le commerce, les laboratoires qui exécutent des gels de protéine fréquents peuvent réduire les coûts importants et aider l&#39;environnement. En outre, cassettes de gel en plastique sont extrêmement résistants à la rupture, ce qui les rend idéal pour les salles de classe en laboratoire de premier cycle.

Notre protocole montre comment verser gels de protéines multiples à la fois par le recyclage Invitrogen cassettes NuPAGE MiniGel Novex, et des matériaux peu coûteux achetés dans un magasin de rénovation domiciliaire. Cette méthode économique et rationalisé comprend un moyen de stocker les gels à 4 ° C pendant quelques semaines. En réutilisant les cassettes de gel en plastique à partir de gels disponibles dans le commerce, les laboratoires qui exécutent des gels de protéine fréquents peuvent réduire les coûts importants et aider l&#39;environnement.

Verser et exécution d&#39;un gel de protéine en réutilisant Cassettes commerciaux

L'évaluation des protéines par analyse par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE) est une technique courante utilisée en biochimie...

Je m'appelle David Oppenheimer et je travaille au Département de biologie de l'Université de Floride. L'achat de gels de polyacrylamide pré-remplis pour l'électrophorèse protéique courante est pratique, car vous pouvez toujours disposer de gels prêts à l'emploi. Toutefois, les gels commerciaux peuvent être coûteux si votre laboratoire réalise un grand nombre de gels.De plus, les gels commerciaux sont généralement coulés dans des cassettes en plastique conçues pour être jetées après usage, ce qui génère des déchets plastiques qui finissent habituellement dans une décharge. Aujourd'hui, nous allons vous montrer comment réutiliser ces cassettes en plastique pour couler vos propres gels de polyacrylamide, que vous pourrez stocker pendant plusieurs semaines, offrant ainsi à votre laboratoire une source de gels prêts à l'emploi peu coûteux pour l'électrophorèse protéique de routine. Bon, commençons.Préparez une nouvelle page propre en Vitrogen avec des cassettes de gel mini Novak. Prélevez environ une cuillère à café de résine époxy et mélangez complètement la solution à l’aide d’une pointe de pipette. Une fois le mélange de la résine époxy terminé, appliquez-la à l’arrière de la cassette avant, là où la partie avant et arrière seront en contact.Lorsque vous avez terminé d'appliquer l'époxy, assurez-vous qu'il n'y a aucune interruption dans la ligne. Insérez une feuille de papier d'une épaisseur équivalente à celle de l'ouverture inférieure et placez l'arrière de la cassette par-dessus. Déplacez ensuite le papier afin d'empêcher tout époxy de pénétrer dans l'ouverture inférieure du classeur.Clippez les bords pour obtenir un joint étanche et laissez la cassette reposer toute la nuit pour un durcissement complet. Pour préparer le gel de séparation, ajoutez 2,25 ml de tampon pour gel de séparation Forex triase à un pH de 8,7 dans un ballon à branché latéral. Ajoutez ensuite 3,50 ml d'acrylamide à 30,8 %.Ensuite, ajoutez 3,25 mils d'eau doublement distillée pour un volume total de neuf mils. Débarrassez la solution des gaz pendant 10 minutes. Une fois la dégazéification terminée, retirez neuf mils de la solution d'acrylamide dans un tube de 50 mils à bouchon orange.Ensuite, ajoutez 30 microlitres de PS à 10 % avec six microlitres de temid. Pour démarrer le processus de polymérisation, assurez-vous de bien mélanger avant de commencer à verser le gel de séparation. Assurez-vous de couvrir l'ouverture inférieure avec du ruban adhésif électrique.Ensuite, versez la solution à l'intérieur de la cassette en la laissant couler sur le côté afin d'éviter la formation de bulles. Arrêtez de verser lorsque vous êtes à environ un centimètre du bord supérieur. Puis ajoutez 0,5 mL de butanol saturé avec un tampon de gel de révélation 1x pour recouvrir complètement le dessus.Préparez le gel de concentration de la même manière que vous préparez le gel de séparation. Dans un flacon à col latéral, ajoutez le tampon de gel de concentration à base de Forex tris contenant 30,8 % d'acrylamide et doublez le volume avec de l'eau distillée, pour un volume total de trois millilitres. Dégazez pendant 10 minutes, puis ajoutez neuf microlitres de APS à 10 % et deux microlitres de TEMED.Et assurez-vous de bien mélanger après une heure. Le un al. Laissez la gélose de séparation polymériser en ligne droite.Versez soigneusement l'al et rincez le gel avec de l'eau doublement distillée. Éliminez l'eau et utilisez du papier absorbant pour retirer tout liquide résiduel. Versez rapidement la solution de gel de concentration dans la cassette et remplissez-la autant que possible.Insérez ensuite délicatement un peigne à gel et utilisez une grande pince à levier pour maintenir le peigne en place. Laissez le gel reposer de une heure à un jour. Pour conserver le gel, placez-le dans une pochette scellable à chaud. Versez 20 mL de tampon de gel de concentration 1x contenant 0,1 % d'azoture de sodium. Scellez complètement la pochette et vérifiez qu’il n’y a aucune fuite.Conservez le gel à quatre degrés Celsius. Pour préparer vos échantillons de protéines, ajoutez une quantité appropriée de protéine dans un tube microcentrifugee à paroi mince. Ici, nous utilisons 6,5 µL.Ensuite, ajoutez 7,5 microlitres de tampon d'échantillonnage SCS sans vx trix glycine. Ajoutez ensuite un microlitre de DTT à 100 millimolaire et, si nécessaire, doublez la quantité d'eau distillée pour obtenir un volume total de 15 microlitres afin de dénaturer votre protéine. Incubez vos échantillons à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes.Installez l'appareil pour gel et versez 200 ml de tampon de migration au tris glycine 1 x contenant 500 microlitres d'antioxydant NewAge dans la chambre intérieure. Ensuite, versez 300 ml de tampon de migration au glycine 1 x dans la chambre extérieure. Ajoutez soigneusement votre échantillon protéique de 15 microlitres dans un puits à l'aide d'une pointe de pipette adaptée au chargement des gels.Lorsque vous avez terminé le chargement de vos échantillons, faites migrer le gel à 200 volts pendant 60 à 90 minutes. Dès le début de l'électrophorèse, les protéines commenceront à migrer à travers le gel de polyacrylamide en fonction de leur taille. Les protéines plus petites migreront plus rapidement que les protéines plus grandes.Retirez soigneusement le gel de la cassette et lavez le gel trois fois avec de l'eau doublement distillée pendant cinq minutes en agitant doucement. Après le troisième lavage, coloriez le gel avec du colorant in vitro gin, simplement bleu sûr, et agitez doucement pendant une heure. Versez le colorant résiduel et fixez le gel avec de l'eau doublement distillée.Si vous souhaitez des bandes plus courtes et plus foncées, vous devez faire migrer le gel pendant une période plus courte. Mais si vous voulez étirer les bandes, faites-le migrer plus longtemps afin d'éliminer l'époxy pour que les cassettes puissent être réutilisées. Utilisez un couteau à gel pour gratter l'époxy restant.Aujourd'hui, nous vous avons montré comment réutiliser les cassettes en plastique fournies avec les gels de polyacrylamide disponibles dans le commerce. Il est important d'utiliser une résine époxy conçue pour le plastique afin d'étanchéifier les cassettes à gel. Utilisez également des réactifs de haute qualité et portez toujours des gants lors de la manipulation de l'acrylamide non polymérisée.Merci et bonne chance avec vos expériences.

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