La détection de l'hypoxie dans le cortex de souris microrégionale cérébrale par imagerie à deux photons de fluorescence endogène NADH

L’objectif global de cette procédure est de visualiser directement l’hypoxie des tissus microrégionaux dans le cortex de la souris in vivo. Ceci est accompli en préparant d’abord une fenêtre crânienne ouverte chez une souris anesthésiée. Ensuite, un colorant fluorescent est injecté par voie intraveineuse pour marquer les vaisseaux sanguins cérébraux.

Enfin, l’imagerie simultanée aux photons de la fluorescence intrinsèque du NADH et de la microvascularisation corticale marquée par fluorescence est réalisée. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent une hypoxie fonctionnelle dans les microrégions du parenchyme cérébral en visualisant la présence de la forme réduite de nicotinamide, l’adénine dinucléotide. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que les électrodes de style Clark est qu’elle donne une haute résolution spéciale sur le grand champ de vision, et qu’elle est également moins invasive.

Cette méthode peut être réalisée sur un système standard à deux photos avec deux canaux fluorescents. Bonjour, je suis Steve Hurst, professeur et président de la microbiologie et de l’immunologie à l’Université de Rochester, démontrant la procédure aujourd’hui sera le fils d’Anita du laboratoire Kishka, ainsi qu’Oxana Paulka, professeure adjointe de recherche de mon laboratoire, le Dr Kishka, qui a été le pionnier de la technique d’imagerie NADH, ne peut pas être ici aujourd’hui car il a récemment déménagé en Allemagne. Après avoir préparé le site chirurgical avec les instruments nécessaires qui ont été autoclaves ou désinfectés avec de l’éthanol à 70 % et que la souris a été anesthésiée avec 5 % de fluor, placez-la sur un coussin chauffant et appliquez un masque facial pour délivrer 1,3 à 1,5 % de fluor dans l’air.

Vérifiez le niveau d’anesthésie en effectuant un pincement de la queue. Ensuite, insérez une sonde rectale et mesurez en continu la température corporelle de l’animal tout au long de la procédure. Appliquez du gel lacrymal artificiel sur les yeux de la souris pour éviter qu’ils ne se dessèchent.

Ensuite, retirez les cheveux de la tête et des deux cuisses, appliquez un épilateur sur la cuisse pendant deux minutes pour enlever les cheveux restants, la cuisse sera utilisée pour l’oxymétrie. Enfin, désinfectez le cuir chevelu à l’aide d’une solution de povidone iodée à 10 % et d’éthanol à 70 %. Pour faire une fenêtre crânienne à partir de cinq millimètres dorlotée au crâne avec des ciseaux.

Faites une incision dans le cuir chevelu et avancez d’un centimètre. Déplacez la peau sur les côtés pour exposer le crâne Pour retirer les membranes sur le dessus du crâne. Appliquer une solution de chlorure ferrique à 10 %.

Essuyez l’excès de solution et grattez les membranes avec un angle de 45 degrés. Numéro cinq, pince à épiler À l’aide d’un microscope à dissection, identifiez la zone d’intérêt. Appliquez une fine couche de colle rapide sur les bords de la fenêtre de la plaque de tête.

Positionnez la plaque de tête de manière à ce que la zone d’intérêt soit exposée dans la fenêtre et appliquez une légère pression sur la plaque de tête. Appliquez une petite quantité de ciment dentaire pour polymériser rapidement la colle. Maintenez la position pendant 10 secondes pendant que la colle polymérise.

Appliquez une petite quantité de colle rapide sur les bords de la fenêtre pour sceller la plaque de tête et le crâne. Vissez ensuite la plaque de tête sur le support d’animal sous la lunette de dissection. Utilisation du jeu de forets micro torque two à 6 000 tr/min et du foret IRF 0 0 5.

Retirez tout le surplus de colle du crâne et de la plaque de tête. Ensuite, réglez la perceuse à mille tr/min et commencez à percer le crâne en faisant un cercle à l’intérieur de la fenêtre de la plaque de tête d’un diamètre d’environ cinq millimètres. Utilisez de légers mouvements de balayage comme si vous dessiniez avec un crayon très doux.

Arrêtez de forer toutes les 20 à 30 secondes et utilisez de l’air comprimé pour enlever la poussière d’os. Au fur et à mesure que le forage progresse, un terrier se forme autour du crâne intact au centre. Prenez soin de ne pas percer le crâne mince, mais assurez-vous que ce terrier est d’épaisseur uniforme.

De plus, soyez très prudent autour des gros vaisseaux sanguins. Ils ne doivent pas être compromis et, si possible, même pas touchés Avec une pince à épiler, soulevez l’os au centre de la fenêtre et appliquez une goutte de liquide céphalo-rachidien artificiel sur la fenêtre. À l’aide du coin d’une lingette Kim, essuyez doucement le liquide céphalo-rachidien artificiel en utilisant un angle de 45 degrés.

Numéro cinq, une pince à épiler. Localisez une région de dure-mère endommagée le long du bord de la fenêtre et soulevez-la pour la retirer. En cas de saignement, appliquez une goutte de LCR artificiel et attendez deux à trois minutes pour que les saignements mineurs cessent.

Ensuite, préparez 10 millilitres d’aéro à faible point de fusion à 0,07 % dissous dans du liquide céphalo-rachidien artificiel. Amenez les aéros fondus à la température du corps. Essuyez l’excès de liquide céphalo-rachidien artificiel de la surface du cerveau.

Versez les aéros dans la fenêtre et couvrez-la d’une lame de verre. Appuyez ensuite doucement sur le verre pour établir le contact entre le verre et la plaque de tête et attendez 10 à 20 secondes jusqu’à ce que l’aéro soit solide. À l’aide d’une pince à épiler et de papier de soie doux, retirez l’excès d’aéro du couvercle en verre.

Mettez une petite quantité de colle rapide autour du verre pour le coller à la plaque de tête. Appliquez ensuite une petite quantité de ciment dentaire pour solidifier la colle à injecter dans la veine fémorale. Retournez partiellement l’animal pour exposer l’intérieur de la cuisse gauche.

Utilisez du ruban adhésif pour fixer l’animal. Dans cette position, appliquez un gommage antiseptique, puis de l’éthanol à cent pour cent sur la peau. Ensuite, faites une incision le long de la cuisse médiale du genou jusqu’à la synthèse pubienne.

Si nécessaire, séparez les tissus mous par dissection émoussée. Remplissez une seringue d’un millilitre avec 130 microlitres de rouge du Texas. Fixez une nouvelle aiguille de calibre 30 et pliez-la soigneusement à un angle de 30 degrés, en maintenant le biseau vers le haut.

Remplissez l’aiguille avec Texas Red Solution sous un microscope de dissection, insérez l’aiguille dans la veine fémorale et injectez une centaine de microlitres de Texas red. Retirez l’aiguille et appuyez légèrement sur la veine avec de la gaze pour arrêter le saignement. Fermez la peau à l’aide de quatre sutures pour une surveillance continue de la saturation en oxygène du sang.

Placez la sonde de l’oxymètre sur la cuisse droite dont les poils ont été précédemment retirés. Pour commencer l’imagerie, transférez la souris préparée chirurgicalement à l’étape du microscope. Prenez une première photo du site de la fenêtre crânienne à l’aide d’un éclairage en champ clair à un grossissement de quatre x pour l’utiliser comme carte de référence pour l’enregistrement avec un grossissement plus élevé des anies photoniques.

Zoomez sur la zone d’intérêt à l’aide d’un grossissement de 10x. Sélectionnez une zone d’intérêt dans les couches corticales. Un ou deux commencent à enregistrer la série chronologique.

Nous vous recommandons d’utiliser en moyenne trois à cinq images pour augmenter la qualité de l’image. Ensuite, induisez l’hypoxémie en ajoutant 50 % d’azote à l’air que l’animal respire. Cela portera le niveau d’oxygène à 10 %Vérifiez l’hypoxémie en surveillant les données de l’oxymètre.

Continuez à enregistrer la série chronologique pendant l’hypoxémie pendant environ 30 secondes et après que le niveau d’oxygène normal est rétabli. Collectez des données pour le calcul de la distribution de l’oxygène en détectant, mesurant et quantifiant la zone d’hypoxie et les cylindres de tissus oxygénés autour des vaisseaux sanguins. Pour déterminer le rayon R du cylindre du tissu croaquement, mesurez la distance entre le centre du vaisseau sanguin et la limite à laquelle une fluorescence élevée de NADH est détectée.

Reportez-vous au protocole écrit pour les méthodes de traitement des données. Cette figure montre des images concomitantes du NADH et de la géographie à partir d’une vidéo enregistrée pendant une hypoxémie transitoire, la concentration d’oxygène inspirée a été abaissée de 21 % à 10 % pendant une période de trois minutes. Ce niveau d’hypoxémie induite expérimentalement est suffisant pour induire une hypoxie sévère dans le cortex cérébral.

L’hypoxie a entraîné une augmentation de la fluorescence du NADH indiquée en vert, initialement dans les zones les plus éloignées de l’approvisionnement en sang artériel. Notez les limites tissulaires nettes du NADH, qui représentent les limites tissulaires observables de la diffusion de l’oxygène à partir de la microcirculation corticale indiquée en rouge. Voici une image simultanée des microvaisseaux marqués par fluorescence du cortex en rouge, et de la fluorescence intrinsèque du NADH à partir de la matière grise du cortex en vert, la distribution de l’intensité de la fluorescence du NADH est binaire.

Il y a des zones où la fluorescence du NADH est uniformément faible et des zones où la fluorescence du NADH est uniformément élevée. Les lignes jaunes représentent les limites tissulaires entre les zones où la fluorescence du NADH est faible et élevée. Ces limites tissulaires présentent une relation spatiale avec les microvaisseaux voisins.

Cette relation est déterminée par la diffusion de l’oxygène des microvaisseaux dans les tissus. Dans certains cas, la nature cylindrique ou le cylindre tissulaire CRO de ces limites tissulaires peut être directement reconnue, comme l’indiquent les lignes bleues. Ici, la limite tissulaire est de forme circulaire avec un vaisseau sanguin central concentrique Une fois maîtrisé.

Cette technique peut être réalisée en 1,5 heure si elle est correctement exécutée. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de coller le verre de couverture sur la plaque métallique pour éviter le mouvement vertical de la surface corticale dû à l’œdème. À la suite de cette procédure, des analyses supplémentaires peuvent être effectuées, telles que des mesures de l’hyperémie fonctionnelle, dans le but de répondre à des questions supplémentaires telles que la relation entre l’hypoxie tissulaire et le couplage cérébrovasculaire.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de visualiser l’hypoxie des tissus microrégionaux dans le cortex de la souris.