Name: Mesure de γHV68 infection chez les souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 22 s
Description: Apprenez à mesurer l'infection γHV68 chez la souris par des tests de plaque et d'infectious center. Cette méthode permet d'évaluer les charges virales aiguës et latentes in vivo.

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Les auteurs tiennent à remercier les conseils techniques et le soutien de Ren Soleil (University of California, Los Angeles) et Seungmin Hwang (université de Washington). Ce travail a été financé par la Fondation Baxter, National Institutes of Health subventions (R01 et R21 CA140964 AI083841 à C. Liang).

Le protocole suivant décrira l'étude de titres de virus et les charges du génome viral dans le cycle d'infection lytique et latente des γHV68 chez la souris, qui peuvent théoriquement être utilisés pour évaluer l'infection par d'autres virus de partage de mode de vie semblable à celle de γHV68. 1. Amplification du γHV68 <ol><li> Dégeler une ampoule congelée d'γHV68 de 37 ° C l'eau de bain. </li><li> Ajouter inoculums viraux pour NIH3T12 ou la culture de cellules 3T3 (~ 50% de confluence) en boîtes de 10 cm et la culture des cellules infectées à 37 ° C dans 5% de CO 2. </li><li> Examiner la culture par microscopie pour effet cytopathogène (ECP) et de recueillir les médias à un moment où plus de 80% des cellules montrent CPE 4 ~ 5 jours après l'infection. Afin de maximiser le rendement de virus, de la culture de cellules infectées peuvent être congelés et décongelés deux fois-pour libérer tous les associés aux cellules γHV68. </li><li> Centrifuger les médias collectées à 1000 rpm pendant 5 min à température ambiante (TA) pour éliminer les débris cellulaires. </li><li> Soigneusement transférer les surnageants de nouveaux tubes (tube de centrifugeuse à haute vitesse) sans toucher les débris cellulaires à la base. </li><li> Haute-vitesse de centrifugation à 12000 rpm (pour Sorvall SA-600) à 4 ° C pendant au moins 1,5 heures pour concentrer les particules virales. </li><li> Jeter le surnageant dans l'eau de Javel 10γ et soigneusement re-suspendre le culot (virus et les débris cellulaires résiduels) avec 1ml DMEM sans sérum. Transférer le concentré remis en suspension dans un micro-1,5 ml tube de centrifugeuse et bien mélanger au vortex. </li><li> Centrifuger pendant 2 min à vitesse maximale pour éliminer les débris cellulaires résiduelle et transférer le surnageant (stock de virus) dans un nouveau tube. Ceci est le stock final de l'infection virale. Le titre du stock de virus est déterminée par dosage de plaque (voir ci-dessous). </li></ol> 2. L'infection intranasale de souris avec γHV68 <ol><li> Infecter des souris à ~ 6 semaines d'âge de 1000 ~ 5000 unités formant plage (UFP) de souris par γHV68. </li><li> Anesthésiersouris par injection de kétamine / xylazine (60 ul / souris d'un mélange de 80 mg / ml de kétamine et 12 mg / ml de xylazine) dans la cavité péritonéale. Moniteur d'anesthésie en pinçant le bout des souris. Il faut généralement min ~ 5-10. Si les souris ne sont pas complètement anesthésiés, ils éternuent le virus. </li><li> Lorsque la souris est totalement anesthésié, l'utilisation d'une pipette pour inoculer ~ 30 pl de PBS contenant γHV68 (15 pi à chaque narine) à des souris au goutte-à-goutte, lentement mais sûrement. Soyez certain que la souris est en effet inhaler les gouttes, sans chercher à former des bulles. </li><li> Laissez la souris pour récupérer pendant 10-15 min et surveiller le bien-être de la souris (par exemple la conscience, la respiration, etc) avant de les retourner à la cage. Les animaux sont contrôlés quotidiennement pour cause de maladie et de l'adéquation de la nourriture, l'eau, et les conditions de la literie. Si les signes cliniques de la maladie, la douleur ou de détresse se développer, le diagnostic de routine afin de déterminer l'étiologie sera menée. Les animaux qui perdent plus de 20% de leur poids corporel sera enregistré pour la perte de poids maximaleet euthanasiés. La décision finale de pratiquer l'euthanasie est à la discrétion du vétérinaire clinique et est faite après consultation avec le chercheur principal. </li></ol> 3. Essai de plaque pour déterminer le titre de virus dans les poumons infectés de façon aiguë <ol><li> Les titres infectieux du virus sont déterminées par la formation de plaque sur des monocouches de cellules Vero. </li><li> Les cellules Vero sont ensemencées à 2.5x10 4 cellules / puits dans 12 puits de plaques de la journée avant le dosage de plaque. Les cellules doivent être répartis uniformément et de la densité cellulaire devrait atteindre 30 - 40% le jour de la plaque assay. </li><li> Préparer 0,5% (p / v) la méthylcellulose (MC) milieu de recouvrement (Tableau 1). </li><li> Sacrifice γHV68 souris infectées 5-7 jours après l'infection intranasale pour déterminer les titres de virus de phase aiguë dans les poumons. Pour l'euthanasie Kétamine HCl (80-100 mg / kg SC, IM, IP) seront administrées IM suivie par surdose intraveineuse de pentobarbital Na (30-50 mg / kg IP). Cette méthode est approuvée par tIl American Veterinary Medical Association. </li><li> Récolter les poumons et rincer deux fois avec 1 x PBS pour éliminer les cellules sanguines. Recueillir un côté des poumons dans 1 ml glacée milieu DMEM complet et de garder sur la glace. Rapidement figer l'autre côté des poumons et de conserver à -80 ° C pour examiner les charges d'ADN viral dans les poumons par qPCR (voir ci-dessous). </li><li> Utilisez un homogénéisateur de tissu afin d'homogénéiser les tissus pulmonaires à une vitesse maximale de 1 sec, gel-dégel et à trois reprises. Laver l'homogénéisateur à l'éthanol 70% à chaque étape lors du changement de l'échantillon. </li><li> Centrifuger les tissus homogénéisés à 3000 rpm pendant 10 min à 4 ° C. Recueillir le surnageant et le transfert à de nouveaux tubes pour le dosage de la plaque. </li><li> Préparer des dilutions en série (généralement de 10 ° à 10 -8) des échantillons pulmonaires dans 1,5 ml d'homogénat de micro-centrifugeuse tubes avec plaine de DMEM par vortex. Prefill le nombre approprié de tubes avec 540 ul de DMEM et diluer 60 homogénat ul dans le premier tube. Transfert 60 ul du premier tube ipas le suivant, et ainsi de suite. </li><li> Aspirer les médias à partir des monocouches préparées Vero dans des plaques à 12 puits et la charge utile de 200 l / homogénat ainsi dilué en série contenant des virus infectieux dans un ordre inverse (de 10 -8 à 10 °). Utilisez deux puits pour chaque titrage (en double). </li><li> Incuber les cellules Vero par le virus inoculums 1 heure à 37 ° C. Mélanger délicatement les plaques toutes les 15 minutes afin de répartir uniformément le virus au cours de la monocouche. </li><li> Retirez les inoculums et le remplacer par 2 ml / puits de milieu de recouvrement (Tableau 1). Incuber les plaques pendant une semaine à 37 ° C. </li><li> Retirer milieu de recouvrement (n'a pas besoin d'être complète) et le remplacer par le correctif / moyen tache de plaque assay (tableau 1) et incuber pendant au moins 1 heure à température ambiante. </li><li> Lorsque les plaques sont séchées, compter le nombre de plaques bien isolées à chaque dilution. Afin de minimiser les erreurs, seuls les puits contenant entre 10 et 100 plaques sont comptées. </li><li> Calculer le titre du virus utilisant le Folloaile formule: titre (UFP / ml) = [(nombre de plaques / puits) / (volume de inoculums / puits)] x facteur de dilution. </li></ol> 4. Assay Centre infectieuses pour déterminer la charge virale dans splénocytes infectées de façon latente <ol><li> Charge latente virale est déterminé par le centre infectieuses (IC) d'essai sur la monocouche de cellules Vero. La veille de cellules test IC semences, Vero dans des plaques 6 puits (1 -. 2,5 X 10 5 cellules / puits Nous utilisons habituellement 11 puits par échantillon rate, 10 puits seront utilisées pour la suspension diluée en série splénocytes et un puits pour les tests réactivation spontanée du virus après cycles gel-dégel. </li><li> Sacrifice de la souris infectées après la latence est établie (12 - 14 jours après l'infection). Récolte de la rate de souris et de les mettre dans 1 ml de DMEM froid. </li><li> Dissociation mécanique de la rate de souris. Transfert de la rate de souris fraîchement isolées dans une plaque de 10 cm et ajouter 10 ml de milieu désiré tel que DMEM avec 2% de FBS. Humides deux en verre dépoli-end microscdiapositives avec OPE glacée à moyen terme. Placer la rate sur le côté givré d'un toboggan et Nick la capsule avec le bord de l'extrémité dépolie de la lame d'autres. Mécaniquement dissocier la rate entre deux diapositives jusqu'à ce que tous touffes rouges sont écrasés (également supprimer les particules de graisse si présent). </li><li> Rincer les lames avec du DMEM à récupérer les cellules restantes sur les deux diapositives. </li><li> Transférer la suspension de tissu ensemble délicatement dans une passoire cellulaire (40 maille de nylon um) dans un conique de 50 ml à bouchon à vis tube. Laver la vaisselle de 10 cm contenant les homogénats de rate avec 10 ml de PBS et de transfert tout en filtrant. </li><li> Centrifuger la cellule unique suspensions 10 min à 375 xg et éliminer le surnageant. Flick les culots pour briser les mottes de cellules existantes. Ajouter 5 ml de tampon ACK (tableau 1) pour lyser les globules rouges. Incuber 5 min et centrifuger à nouveau à 375 x g. </li><li> Jeter le surnageant et remettre en suspension les pellets, à fond, mais en douceur, en PBS avec 2% de FBS. Gardez les cellules à 4 ° C. Utiliser une pipette pourenlever les débris, le cas échéant. Nombre de cellules viables en utilisant un compteur de cellules automatique (Bio-Rad). </li><li> Isoler les splénocytes PBS-resuspendues à 375 g pendant 4 min. Rejeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 4 ml DMEM complet (2 x 1 ml sera utilisé pour le dosage de CI de la suspension d'origine; 0,6 ml utilisée pour série de cinq dilutions dans le dosage IC, 0,4 ml pour la préparation de l'ADN viral et qPCR, et 1 ml de suspension seront utilisés pour évaluer la réactivation spontanée du virus latent après trois cycles gel-dégel) </li><li> Préparer série de cinq dilutions (soit 1 / 5, 1 / 25, 1 / 125, 1 / 250) de la suspension splénocytes en double. Prefill les 15 ml tubes coniques avec 2,4 ml de DMEM et diluer la suspension 600 ul splénocytes dans le premier tube et bien mélanger. Transfert 600 pi du tube précédent dans le tube suivant, etc Ne pas vortexer! </li><li> Aspirer le support de la préparer à 6 puits monocouche de cellules Vero. Graine de 1 ml de splénocytes en série diluée sur des cellules Vero avec chaque dupl de dilutionicated (10 puits seront utilisées pour 0, 1 / 5, 1 / 25, 1 / 125, 1 / 250 dilutions). </li><li> Incuber les plaques 8-12 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. Ne pas dépasser 24 heures. Aspirer la suspension ensemencé splénocytes et de la charge 4 ml de superposition des médias (tableau 1) à chaque puits. Incuber pendant 6 jours supplémentaires. </li><li> Déterminer les niveaux des centres de la rate infectieuses par la coloration des plaques avec 0,2% (p / v) de cristal violet, comme indiqué dans le test de la plaque. </li></ol> 5. La quantification du génome viral <ol><li> Extraire l'ADN génomique total à partir des tissus infectés γHV68, comme les poumons et la rate des échantillons dans cette expérience. Utilisez le sang DNeasy &amp; Kit tissulaire (Qiagen), selon le protocole du fabricant. </li><li> Déterminer la concentration d'ADN de chaque échantillon afin d'assurer la même quantité d'ADN utilisée pour le dosage de qPCR. Conception du virus amorces spécifiques (~ 200 pb amplicon est préféré pour un dosage de qPCR). Nous avons utilisé le γHV68 ORF56 amorces spécifiques (amorce sens: 5 &amp; PRIME; - GTAACTCGAGACTGAAACCTCGCAGAGGTCC - 3 '; amorce reverse: 5'-CCGAAGCTTGCACGGTGCAATGTGTCACAG-3') pour ce test et β-actine amorces (amorce directe: 5'-cacccacactgtggcccatcat-3 'amorce reverse: 5'-gtgaggatcttcatgaggtagtc-3') en tant que un contrôle de la réaction de PCR quantitative. </li><li> Mélanger l'échantillon d'ADN (100 - 500 ng est bon) et des amorces appropriées avec 2 x SYBR master mix (Bio-Rad iQ SYBR Green Supermix). Utiliser le Bio-Rad système en temps réel de PCR de quantifier la charge virale dans les tissus infectés. Effectuer PCR à la condition suivante: 95 ° C pendant 15 min et 45 cycles de 95 ° C pendant 30 min, 60 ° C pendant 30 min, et 72 ° C pendant 30 min, suivi d'une fusion des analyses de courbe, tant pour les virus et amplicons d'actine. </li><li> Pour faire une courbe standard pour la quantification des génomes viraux, série diluer un montant connu d'un ADN γHV68 bacmide avec l'ADN génomique isolé à partir des cellules non infectées. Exécuter qPCR en parallèle avec les ADN extraites de la infectionTed tissus en utilisant les mêmes ensembles de virus des amorces spécifiques. </li><li> Présenter la charge du génome viral dans les tissus comme le nombre de copies d'ADN viral par unité (par exemple 100 ng ou 500 ng) d'ADN génomique après normalisation actine. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: La figure 1 illustre le schéma d'ensemble des expériences pour la mesure de γHV68 infection chez les souris in vivo. Des résultats représentatifs de titres de virus dans les poumons lors d'une infection aiguë de γHV68, telle que déterminée par dosage de plaque, ont été montrées dans la figure 2A. Une souche mutante de γHV68 contenant non fonctionnelles virale Bcl-2 (vBcl-2) reproduit à des niveaux comparables à ceux de type sauvage γHV68 dans les poumons après 7 jours d'infection intranasale de souris BALB / c (6 - 7 souris par groupe). Aucune différence statistiquement significative dans les poumons des titres du virus ont été détectés entre deux groupes. Ces données indiquent que vBcl-2 n'est pas un facteur crucial pour l'infection aiguë des γHV68 ausouris. Cependant, après l'infection de 28 jours, le titre du vBcl-2 virus mutant dans la rate a baissé de 6 - à 10 - fois par rapport au WT, telle que mesurée par dosage de centre infectieux (figure 2B), suggérant que le vBcl-2 mutant du virus γHV68 est défectueux dans le maintien de la latence spléniques après l'infection. En accord avec le centre de réduction des titres infectieux, la charge virale du génome du virus mutant vBcl-2 a été sévèrement réduite par rapport à celle des virus WT à 28 jours dans des expériences répétées, comme le montre la figure 2C. L'étroite corrélation entre les charges génome viral et la fréquence des latente HV68vBcl-2 in vivo le virus mutant ex réactivation au stade de l'infection latente met en évidence un défaut de latence de cette infection par le virus mutant. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3472/3472fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Schéma pour la mesure de γHV68 infection chez les souris par le biais de la formation de la plaque, le centre infectieuses, et le dosage qPCRs. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3472/3472fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Infection lytique et latente de l'γHV68 WT et mutant virus in vivo. Réplication aiguë (A) de la WT et mutant vBcl-2 γHV68 virus dans les poumons des souris BALB / c à 7 dpi (jours après l'infection) a été déterminée par dosage de plaque. (B et C) splénique centres infectieuses (B) et la charge du génome viral (C) dans la rate de souris infectées ont été mesurées à 28 dpi par le dosage du centre infectieuses et qPCR, respectivement. Les lignes rouges, les moyennes des valeurs indiquées. ns, non significatif.

<ol><li>Damania, B., Choi, J. K., Jung, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+activities+of+gammaherpesvirus+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Signaling activities of gammaherpesvirus membrane proteins.</a> J. Virol. 74, 1593-1601 (2000).</li>
<li>Stevenson, P. G., Efstathiou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+mechanisms+in+murine+gammaherpesvirus-68+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Viral.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune mechanisms in murine gammaherpesvirus-68 infection.</a> Viral. Immunol. 18, 445-456 (2005).</li>
<li>Flano, E., Husain, S. M., Sample, J. T., Woodland, D. L., Blackman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latent+murine+gamma-herpesvirus+infection+is+established+in+activated+B+cells%2C+dendritic+cells%2C+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Latent murine gamma-herpesvirus infection is established in activated B cells, dendritic cells, and macrophages.</a> J. Immunol. 165, 1074-1081 (2000).</li>
<li>Sunil-Chandra, N. P., Efstathiou, S., Nash, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+gammaherpesvirus+68+establishes+a+latent+infection+in+mouse+B+lymphocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Murine gammaherpesvirus 68 establishes a latent infection in mouse B lymphocytes in vivo.</a> J. Gen. Virol. 73, 3275-3279 (1992).</li>
<li>Simas, J. P., Swann, D., Bowden, R., Efstathiou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+murine+gammaherpesvirus-68+transcription+during+lytic+and+latent+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Analysis of murine gammaherpesvirus-68 transcription during lytic and latent infection.</a> J. Gen. Virol. 80, 75-82 (1999).</li>
<li>Ganem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KSHV+and+the+pathogenesis+of+Kaposi+sarcoma%3A+listening+to+human+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">KSHV and the pathogenesis of Kaposi sarcoma: listening to human biology and medicine.</a> J. Clin. Invest. 120, 939-949 (2010).</li>
<li>Wen, K. W., Damania, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi+sarcoma-associated+herpesvirus+%28KSHV%29%3A+molecular+biology+and+oncogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Lett%22%5BJournal%5D)">Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (KSHV): molecular biology and oncogenesis.</a> Cancer. Lett. 289, 140-150 (2009).</li>
<li>E, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+Bcl-2-mediated+evasion+of+autophagy+aids+chronic+infection+of+gammaherpesvirus+68%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+Pathog%22%5BJournal%5D)">Viral Bcl-2-mediated evasion of autophagy aids chronic infection of gammaherpesvirus 68.</a> PLoS. Pathog. 5, e1000609-e1000609 (2009).</li>
<li>Marques, S., Efstathiou, S., Smith, K. G., Haury, M., Simas, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+gene+expression+of+latent+murine+gammaherpesvirus+68+in+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Selective gene expression of latent murine gammaherpesvirus 68 in B lymphocytes.</a> J. Virol. 77, 7308-7318 (2003).</li>
<li>McCausland, M. M., Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+PCR+technique+for+detecting+lymphocytic+choriomeningitis+virus+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative PCR technique for detecting lymphocytic choriomeningitis virus in vivo.</a> J. Virol. Methods. 147, 167-176 (2008).</li>
<li>Weck, K. E., Kim, S. S., Virgin, H. I., Speck, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+regulate+murine+gammaherpesvirus+68+latency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">B cells regulate murine gammaherpesvirus 68 latency.</a> J. Virol. 73, 4651-4661 (1999).</li>
<li>Weck, K. E., Kim, S. S., Virgin, H. I., Speck, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+are+the+major+reservoir+of+latent+murine+gammaherpesvirus+68+in+peritoneal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Macrophages are the major reservoir of latent murine gammaherpesvirus 68 in peritoneal cells.</a> J. Virol. 73, 3273-3283 (1999).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

γHV68 a été largement utilisé comme un modèle pour comprendre la pathogenèse de l&#39;humain γ-HVS 2,4,5. Dans ce protocole, nous avons décrit trois méthodes couramment utilisées, y compris essai de plaque pour titre viral infectieux, test de circuits intégrés pour la charge virale latente, et qPCR pour la charge du génome viral, pour évaluer l&#39;infection aiguë et latente de γHV68 après inoculation intranasale chez des souris. Le dosage de la plaque a été largement utilisée pou...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du produit </td><td> Procédure de préparation </td></tr><tr><td> Moyennes Méthylcellulose overlay (MC) pour le dosage de la plaque virale </td><td><ol><li> Heat ~ 250 ml d&#39;eau distillée en bouteille TC&gt; 80 ° C (ébullition pendant 3 minutes au micro-ondes) </li><li> Ajouter progressivement 2,5 g de poudre dans l&#39;eau MC chauffée, en remuant à feu doux jusqu&#39;à dissolution. </li><li> Autoclave immédiatement pour 15 min à cycle de liquide. </li><li> Agitation des médias autoclavé MC à 4 ° C pendant la nuit. </li><li> Combinez 250 ml MC médias avec 200ml 2 x MEM (Gibco-BRL) + 50 ml de FBS pour donner 500 ml de superposition des médias. </li></ol></td></tr><tr><td> Fix / teinture moyenne pour le dosage de la plaque </td><td> 0,2% (p / v) de violet cristallisé dans l&#39;éthanol 20%. </td></tr><tr><td> Lysis Buffer ACK </td><td> NH 4 Cl 0,15, KHCO3 10 mM, 0,1 mM EDTA </td></tr><tr><td> DMEM complet </td><td> Eagle modifié par Dulbecco à moyen(DMEM) supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal (FBS; Invitrogen), 2 mM de L-glutamine et 1% de pénicilline-streptomycine (Gibco-BRL). </td></tr></tbody></table> Les médias le tableau 1. Spécifiques utilisés dans ce protocole <table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> La kétamine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> K2753 </td></tr><tr><td> Xylazine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X1251 </td></tr><tr><td> Méthylcellulose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0512-250g </td></tr><tr><td> 2 x MEM </td><td> Life Technologies </td><td> 11935 </td></tr><tr><td> Tamis cellulaire </td><td> BD Faclon </td><td> 352340 </td></tr><tr><td> Omni tissus homogénéisateur </td><td> Omni International </td><td> TH115 </td></tr><tr><td> Sang DNeasy Tissue Kit &amp; </td><td> QiaGen </td><td> 69504 </td></tr><tr><td> iQTM SYBRH vert Supermix </td><td> BioRad </td><td> 170-8882 </td></tr><tr><td> CFX96 système en temps réel de PCR </td><td> Bio-Rad </td><td> 184-5072 </td></tr><tr><td> Compteur de cellules </td><td> Bio-Rad </td><td> 145-0001 </td></tr><tr><td> Sorvall SA-600 </td><td> Thermo Scientific </td><td> 096-124022 </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Réactifs et équipements spécifiques

mesure de γhv68 infection chez les souris

Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

γ-herpèsvirus (γ-VH) sont remarquables par leur capacité à établir des infections latentes de cellules lymphoïdes 1. La gamme d&#39;hôtes étroite humaine γ-HVS, comme l&#39;EBV et KSHV, a gravement entravé les études détaillées pathogènes. Murin γ-herpèsvirus 68 (γHV68) part importante des similitudes génétiques et biologiques avec les humains et les γ-HVS est un agent pathogène naturel des rongeurs muridés 2. En tant que tel, l&#39;évaluation des γHV68 infection de la souris des souches consanguines à différents stades de l&#39;infection virale constitue un modèle important pour la compréhension du cycle de vie virale et la pathogénèse au cours γ-HVS infection. Après inoculation intranasale, γHV68 résultats d&#39;infection aiguë de la virémie dans les poumons qui est ensuite résolue en une infection latente des splénocytes et des autres cellules, qui peuvent être réactivées pendant toute la durée de l&#39;hôte 3,4. Dans ce protocole, nous allons décrire la façon d&#39;utiliser le dosage de la plaque d&#39;ânestitre s de virus infectieux dans les poumons homogénats sur des monocouches de cellules Vero à un stade précoce (5 - 7 jours) de la post-infection intranasale (ppp). Alors que l&#39;infection aiguë est largement effacé 2-3 après l&#39;infection semaines, une infection latente de γHV68 est établi autour de 14 dpi et maintenue plus tard dans la rate des souris. L&#39;infection latente affecte généralement une très petite population de cellules dans les tissus infectés, par lequel le virus reste dormant et s&#39;éteint la plupart de son expression génique. Splénocytes latente infectée par le virus spontanément réactiver après explantation dans la culture tissulaire, qui peut être récapitulée par un centre infectieuses (IC) d&#39;essai pour déterminer la charge virale latente. Afin d&#39;estimer la quantité de copies du génome viral dans le aiguë et / ou des tissus infectés latents, quantitatifs PCR en temps réel (qPCR) est utilisé pour sa sensibilité maximale et précision. Les analyses combinées des résultats de dosage de qPCR et de la plaque, et / ou le dosage IC va révéler les profils spatio-temporelle des virusla réplication et l&#39;infectiosité in vivo.

γ-herpèsvirus (γ-HVS) établir long de la vie la persistance dans leur hôte. L&#39;infection de souris avec γ-HV68 offre une tractable génétiquement<em&gt; In vivo</em&gt; Modèle pour la caractérisation du cycle de vie / pathogenèse de γHVs. Ce protocole décrit la détection et la quantification de l&#39;infection au γHV68 phases aiguës et latentes après l&#39;infection par le formant plage, centre infectieuses, et des essais qPCR.

Mesure de γHV68 infection chez les souris

Les $\gamma$-herpèsvirus ($\gamma$-HV) sont remarquables par leur capacité à établir des infections latentes dans les cellules lymphoïdes1. L'étroite gamme d'hôtes des...

Dans cette vidéo, les infections aiguës et latentes par le virus de l'herpès sont évaluées après une infection intranasale chez la souris, au moyen de dosages par plaques et par centres infectieux. Pour imiter tout d'abord l'exposition physiologique, les souris sont infectées par administration intranasale du virus de l'herpès gamma neuronal. 68, 5 à sept jours plus tard, le tissu pulmonaire est prélevé et homogénéisé.Ensuite, un dosage par plaque est effectué pour déterminer la charge virale aiguë. Pour déterminer la charge virale latente, la rate est prélevée chez la souris. Douze à quatorze jours après l'infection, une suspension monocellulaire de foyers SPOC infectés est préparée et un dosage des centres infectieux est réalisé. Les résultats de ces dosages révèlent les profils spatiotemporels de la réplication virale et de l'infectiosité in vivo.Ainsi, le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'utilisation du système de culture tissulaire pour l'étude de l'infection virale, réside dans le fait qu'elle exploite l'infection par un gammaherpèsvirus marin chez la souris afin de caractériser in vivo le cycle de vie et/ou la pathogenèse des

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Nous décrivons un protocole pour identifier les rôles clés des molécules de l'hôte de signalisation dans la réplication lytique d'un virus de l'herpès modèle, gamma herpèsvirus 68 (γHV68). L'utilisation de lignées de souris génétiquement modifiées et des fibroblastes embryonnaires de γHV68 réplication lytique, le protocole permet à la fois la caractérisation phénotypique et moléculaire de l'interrogatoire interactions virus-hôte dans la réplication virale lytique.

Dissection hôte-virus interaction dans la réplication lytique d&#39;un virus de l&#39;herpès modèle

Source : Seman, B. G., et al. Un modèle d’imagerie néonatale de septicémie bactérienne à Gram négatif. J. Vis. Exp. (2020)La vidéo présente un modèle murin néonatal pour étudier l’infection systémique à l’aide de bactéries bioluminescentes encapsulées. Les nouveau-nés sont injectés avec des suspensions bactériennes à forte ou faible dose et sont renvoyés à leur mère pour des soins postnataux. Les bactéries encapsulées échappent à la détection immunitaire précoce, se propagent systémiquement et...

Modéliser l’infection chez les souris néonatales à l’aide de bactéries bioluminescentes encapsulées

Dans cette vidéo, nous décrivons un protocole pour tester l’efficacité d’un vaccin acellulaire contre la coqueluche contre l’infection à Bordetella pertussis chez la souris. Après la vaccination, les souris ont été soumises à une infection et leur homogénat de tissu a été cultivé pour analyser les colonies bactériennes afin de déterminer l’immunité protectrice induite par le vaccin.

Évaluation de l’immunité induite par le vaccin contre l’infection bactérienne dans un modèle murin

Nous décrivons un protocole pour mesurer la production de cytokine antivirale chez les souris infectées par un virus de l'herpès modèle murin gamma herpèsvirus 68 (γ HV68) qui est étroitement liée à associé au sarcome de virus de l'herpès de Kaposi humain (KSHV) et le virus d'Epstein-Barr (EBV). L'utilisation de souches de souris génétiquement modifiées et les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF), nous avons évalué la production de cytokines antivirales la fois in vivo et ex vivo.

Dissection Innate Immune signalisation Evasion virale de la production de cytokines

Virus de l’influenza (IAVs) sont des agents pathogènes respiratoires humains importants. Pour comprendre le pouvoir pathogène de IAVs et d’effectuer des essais précliniques de nouveau vaccin approches, modèles animaux imitant la physiologie humaine sont nécessaires. Nous décrivons ici les techniques pour évaluer l’IAV pathogenèse, humorale et l’efficacité du vaccin en utilisant un modèle de souris de l’infection.

Études de Virus influenza de type A dans un modèle murin d’Infection

Nous présentons ici un protocole élégant pour in vivo l’évaluation du vaccin hôte et l’efficacité des réponses immunitaires. Ce protocole peut être adapté pour des modèles de vaccin qui étudient les virus, bactéries ou parasites pathogènes.

Évaluation des réponses de l’hôte-pathogène et l’efficacité du vaccin chez la souris

Ici, nous décrivons une méthode pour induire la méningite méningococcique par une voie intracisternal d'infection chez les souris adultes. Nous présentons un protocole étape par étape de l'infection méningococcique de la préparation de l'inoculum à l'infection intracisternal ; enregistrez ensuite la survie animale et évaluez les charges bactériennes dans les tissus murines.

Induire la méningite méningococcique Sérogroupe C chez les souris par l'intermédiaire de la livraison intracisternal

On décrit ici trois approches expérimentales pour étudier la dynamique de l'infection par le VIH chez les souris humanisées. Le premier permet l'étude des événements d'infection chronique, tandis que les deux derniers permettent l'étude des événements aigus après l'infection primaire ou la réactivation virale.

Infection chronique, aigue et réactivée du VIH dans des modèles de souris immunodéficientes humanisés

Cet article décrit les protocoles d’évaluation de la réponse de Tfh et de GC B dans le modèle murin de l’infection par le virus de la grippe.

Évaluation des cellules d’aide folliculaire t et de la réponse du Centre germinal pendant l’infection virale de la grippe A chez la souris

Nous avons développé un protocole pour la génération et l'évaluation d'un modèle de souris NOG humanisé et infecté par le virus de l'immunodéficience humaine basé sur la greffe de cellules souches, l'exposition intravaginale au virus de l'immunodéficience humaine et l'ARN PCR numérique de gouttelettes Quantification.

Souris NOG humanisées pour l'exposition intravaginale au VIH et le traitement de l'infection par le VIH

Cet article décrit un nouveau modèle murin pour la transition du pneumocoque d’un colonisateur asymptomatique à un agent pathogène pathogène au cours d’une infection virale. Ce modèle peut être facilement adapté pour étudier les interactions polymicrobiennes et hôte-pathogène au cours des différentes phases de la progression de la maladie et entre divers hôtes.

Un modèle murin pour la transition de Streptococcus pneumoniae de colonisateur à pathogène lors d’une co-infection virale récapitule la maladie exacerbée par l’âge

Apprenez à mesurer l'infection γHV68 chez la souris par des tests de plaque et d'infectious center. Cette méthode permet d'évaluer les charges virales aiguës et latentes in vivo.

Mesure de γHV68 infection chez les souris

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