Annotation de la fonction des gènes des plantes par l'intermédiaire de génomique, la métabolomique et combinés informatique

L'objectif général de l'expérience suivante est de découvrir et de caractériser de nouvelles fonctions géniques à l'aide de l'annotation des gènes par une analyse combinée du profilage des métabolites et de l'analyse de la co-expression. Ceci est réalisé en tenant compte de la conception expérimentale, en mettant l'accent sur des voies métaboliques spécifiques et des espèces végétales particulières. Dans un deuxième temps, des approches analytiques sont utilisées pour reconstruire la voie métabolique complète à partir des structures chimiques des composés détectés.

Ensuite, la structure du chemin métabolique prédit est intégrée à une analyse de co-expression afin de restreindre les gènes candidats, qui indiquent vraisemblablement les gènes clés du métabolisme. En fin de compte, les résultats sont obtenus en réalisant un nombre minimal d'expériences avec une utilisation efficace de plusieurs ressources biologiques afin de caractériser l'identification fonctionnelle des gènes. Nous avons eu l'idée de cette méthode lorsque nous avons observé une corrélation très élevée entre les gènes Abosi OID bio cystiques dans la base de données de co-expression nommée ate.

Nous considérons que cette stratégie constitue l'un des moyens les plus rapides pour identifier les fonctions de nouveaux gènes à l'aide des données disponibles publiquement dans des bases de données et pour utiliser efficacement les ressources biologiques. Pour commencer l'extraction, récoltez les échantillons végétaux et congélez-les immédiatement dans de l'azote liquide. Une fois congelés en poudre, utilisez un broyeur à billes pour prélever des aliquotes du matériau végétal congelé dans des tubes EOR de deux millilitres, puis ajoutez une bille métallique dans chaque tube.

Ajoutez 250 microlitres de tampon d'extraction pour chaque 50 milligrammes d'échantillon. Le tampon d'extraction contient l'étalon interne utilisé pour la normalisation. Ensuite, homogénéisez la poudre congelée à l’aide du broyeur à billes pendant deux minutes.

À une fréquence de 25, centrifuger l'échantillon à 12 000 tr/min pendant 10 minutes. Ensuite, transférer le surnageant dans un filtre centrifuge. Après avoir effectué un deuxième cycle de centrifugation, transférer le surnageant dans un nouveau tube einor.

Ensuite, configurez la CPG en vérifiant d'abord que la température du four de colonne est de 35 degrés Celsius et que celle du plateau d'échantillons est de 10 degrés Celsius. Configurez les conditions de spectrométrie de masse et vérifiez l'état du vide et du capillaire chauffant. Effectuez une calibration en masse surcharge de détecteur MS par injection par infusion du mélange de solution d'étalonnage.

Utiliser l'application de calibration automatique dans le logiciel. Ensuite, transférer 50 microlitres des extraits dans un flacon en verre. Pour la HPLC, effectuer au moins cinq injections de tampon d'extraction avant de réaliser l'analyse du premier échantillon, comme décrit dans la procédure écrite.

Après avoir configuré un outil d'analyse par spectrométrie de masse, sélectionnez les données à traiter. Préparez un tableau des pics détectés d'intérêt conformément à la classe de composés indiquée dans le protocole écrit. Identifiez les pics par co-évolution avec des composés standards, annotez les pics détectés à l'aide de l'analyse Ms.MS, de la littérature, d'une revue bibliographique et de recherches dans des bases de données de métabolites à cette étape.

La prédiction de la voie métabolique doit être basée sur les structures chimiques en reliant la fonction enzymatique à la voie métabolique. Ainsi, ces étapes doivent être réalisées par une attribution précise des pics des composés détectés. Les bases de données sur les voies métaboliques générales, telles que la base de données KEGG et PlantCyc, sont très efficaces pour prédire la voie métabolique d'intérêt.

Pour préparer une liste de gènes avec les gènes orthologues d'Arabidopsis, téléchargez d'abord une liste d'identifiants de gènes à partir de la base de données génomique. Ajoutez l'identifiant du gène d'Arabidopsis des gènes orthologues si la plante cible n'est pas Arabidopsis. Préparez ensuite une liste des gènes impliqués dans la voie métabolique d'intérêt.

L'annotation des données sur les voies d'Arabidopsis et les données sur les familles de gènes est disponible sur le site web TAAR. Les listes de gènes orthologues d'Arabidopsis peuvent ensuite être combinées. Réalisez une analyse de réseau de co-expression en utilisant la liste de gènes préparée pour interroger la meilleure base de données afin de prédire la voie.

Vérification de la corrélation de paires de gènes bien connues dans le chemin biologique d'intérêt. Si la base de données d'expression concomitante ou la base de données d'expression génique n'est pas disponible, dans le plan d'intérêt, la base de données d'expression concomitante d'Arabidopsis doit être utilisée avec une liste de gènes orthologues d'Arabidopsis.

Ensuite, construisez le cadre du réseau de co-expression cible. Sur la base des connexions des gènes bien connus dans la voie d'intérêt, ajoutez les gènes candidats corrélés et vérifiez leur annotation génique au sein des familles prédites en les rattachant à ce réseau afin d'identifier le meilleur candidat.

Le seuil des gènes pour la valeur du coefficient doit être ajusté en fonction de la structure du réseau et de la densité des gènes corrélés. Établissez maintenant une liste de gènes pouvant être restreinte à ceux spécialisés dans la voie cible. À l’aide de cette liste, vérifiez l’expression des gènes en fonction des spécificités organiques et des réponses au stress des gènes candidats.

Commencez l'intégration des informations en ajoutant des gènes bien caractérisés, qui ont été utilisés comme requête pour l'analyse de co-expression, au chemin métabolique prédit. Effectuez une recherche bibliographique afin de vérifier si les parties non caractérisées de ce chemin sont nouvelles, notamment les étapes enzymatiques non caractérisées, les protéines de transport et les facteurs de transcription. À ce stade, prédisez l'annotation génique la plus appropriée pour ces étapes manquantes non caractérisées.

Combiner les résultats du profilage des métabolites et des gènes candidats d'expression génique in silico basés sur la voie prédite. Ensuite, organiser les gènes candidats sur la voie prédite en fonction de la fonction du gène. Par exemple, acétyltransférase pour le métabolite acétylé, glycosyltransférase pour le glycoside et P quatre 50 pour le composé oxydé.

Vérifiez la concordance des spécificités tissulaires ou des réponses au stress entre l'accumulation de métabolites et le niveau d'expression génique des gènes candidats. Examinez également les connexions avec d'autres voies métaboliques fournissant des substrats ainsi que les gènes répondant au stress. Enfin, réalisez une expérience visant à identifier la fonction du gène à l'aide de bioressources telles qu'une bibliothèque de mutants d'insertion (knockout) et une bibliothèque d'ADNc pleine longueur.

Voici un exemple d'analyse de réseau de co-régulation de la voie des anthocyanes. Des analyses de co-expression ont été réalisées à l'aide de l'indice de co-expression PRAM basé sur le jeu de données de la version trois enrichie, avec le programme PX affichant en rouge 12 gènes enzymatiques des anthocyanes et deux facteurs de transcription impliqués dans la production d'anthocyanes utilisés pour la recherche de gènes candidats. Un réseau de co-expression comprenant 68 gènes candidats corrélés et 14 gènes interrogés a été reconstruit par une interconnexion d'ensemble à l'aide de la base de données Prime, produisant des fichiers de sortie T net qui ont été tracés à l'aide du logiciel PX.

Les nœuds bleus indiquent les gènes candidats qui sont corrélés aux gènes d'anthocyane après son développement. Cette stratégie nous donnera une bonne indication pour prédire et déterminer de nouvelles fonctions géniques dans le métabolisme des plantes.