Name: Analyse de la situation du cycle cellulaire dans les cellules de mammifères (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Apprenez à analyser les phases du cycle cellulaire dans les cellules de mammifères par cytométrie en flux avec marquage BRDU et iodure de propidium. Cette méthode permet de quantifier précisément les populations en G1, S et G2/M.

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Les auteurs tiennent à remercier les Instituts canadiens de recherche en santé (IRSC) et la Société canadienne du cancer pour financer la recherche du cycle cellulaire dans leur laboratoire. MJC est récipiendaire d&#39;une bourse MD / PhD des IRSC. MJC et MA sont membres du programme de formation CaRTT.

1. L'étiquetage et la fixation des cellules <ol><li> Ajouter 1 ul de réactif de marquage prolifération cellulaire (BrdU) par ml de milieu de culture cellulaire (1 à 1000 de dilution) 1 heure avant la récolte. La période d'étiquetage peut être nécessaire de rallongée pour plus lent des cellules en croissance. </li><li> Pour les cellules de la récolte, un milieu de culture, aspirer et laver soigneusement avec du tampon phosphate salin (PBS). Répéter pour bien enlever les traces de milieu. </li><li> Lavez rapidement les cultures une troisième fois avec du PBS contenant 3 mM EDTA et aspirer à fond. </li><li> Ajouter un petit volume de PBS contenant 3 mM EDTA à chaque plat, 0,5 ml pour un plat de 6 cm est idéale. Incuber à 22 ° C pendant environ 5 minutes pour détacher les cellules. Transférer dans un tube de 15 ml conique. </li><li> Centrifuger les cellules à 500 xg pendant 5 minutes pour obtenir un culot, enlever le surnageant et remettre soigneusement dans 100 ul de PBS. </li><li> Fixer les cellules en ajoutant 5 ml d'EtOH à 95%, goutte à goutte, tout en vortex. À cette étape, les cellules peuvent être conservés à 4 ° C pendant au moins unemois. </li></ol> 2. La dénaturation et la coloration de BrdU et l'ADN <ol><li> Centrifuger les cellules à 500 xg pendant 5 minutes pour sédimenter les cellules et enlever EtOH 95%. Remettre en suspension dans 1 ml de HCl 2N et 0,5% Tx-100 par l'ajout d'une manière goutte à goutte tout en vortex. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes. </li><li> Centrifuger comme avant dans la section 2.1 et aspirer délicatement le surnageant puisque les cellules forment un très lâche granules à cette étape. Doucement remettre en suspension dans 1 mL de 0,1 M NaB 4 O 7 (pH 8,5) et incubées pendant au moins 30 minutes à température ambiante. </li><li> Pellet cellules comme ci-dessus dans la section 2.1 et remettre en suspension dans 0,5 ml de solution d'anticorps (PBS contenant 1% et BSA 0,2% de Tween-20) avec des anticorps de souris anti-BrdU dilué de 1 à 50. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes. </li><li> Cellules Pellet à nouveau et remettre en suspension dans 50 ml de solution contenant des anticorps de lapin anti-souris des anticorps secondaire conjugué au FITC dilué 1 à 25. Incuber pendant 30 minutes surpaillasse et de protéger de la lumière. </li><li> Centrifuger les cellules une dernière fois et remettre en suspension dans 0,5 ml d'iodure de propidium et RNase solution (PI-RNAse solution PBS avec 1% de BSA, 10 mg / mL d'iodure de propidium, 0,25 mg / mL de RNase A) et incuber à l'obscurité à 37 ° C pendant 30 minutes. Alternativement ARN peut être digéré une nuit à 4 ° C dans l'obscurité. </li><li> Passe solution à travers une passoire pour enlever les agrégats de cellules et de recueillir des cellules individuelles dans un tube approprié pour l'absorption de l'échantillon sur votre cytomètre en flux. Encore une fois, les échantillons doivent être protégés de toute exposition directe à la lumière. </li></ol> 3. Analyse par cytométrie en flux <ol><li> Les cellules doivent être analysés par un cytomètre en flux standard qui est capable de discriminer des doublets (deux cellules qui passent à travers la cellule de flux comme l'une) avec une capacité de détection approprié pour l'iodure de propidium et FITC. Les cellules individuelles peuvent être détectés dans cette demande de la cytométrie de flux par gating pour des événements basés sur dispersent vers l'avant et côté pop de dispersionulations, et en utilisant les propriétés de coloration de l'ADN par l'iodure de propidium. L'apparition d'un nuage de points discriminant doublet varie entre cytomètres de flux et s'appuie sur les propriétés de propidium coloration iodure, voir votre installation locale de cytométrie en flux pour des conseils sur la mise en place d'un discriminateur doublet dans votre analyse. En général, dans une population asynchrone prolifération des cellules, des cellules simples sont habituellement les deux sommets les plus abondants (2N et 4N ADN) dans le complot doublet discriminant et une porte devrait être établi autour d'eux. Cela permet de sélectionner des événements cellule unique qui sont utilisés pour toutes les analyses ultérieures ci-dessous. </li><li> Le premier échantillon à analyser doit être une culture asynchrone proliférant qui sert de contrôle positif pour la coloration et cytomètre en flux set-up. Réglez la sensibilité de tubes photomultiplicateurs pour la coloration de l'iodure de propidium tels que les pics 2N et 4N partir de cellules de singulet sont centrées à 200 et 400 (unités arbitraires) sur l'axe X. Nous avons souvent une tache s abondanteupply de ces cellules pour s'assurer que tous les paramètres du cytomètre en flux ont été ajustés de manière appropriée sans utiliser cet échantillon. Ce contrôle positif est également utile pour les nouveaux utilisateurs de se familiariser avec le fonctionnement du cytomètre de flux. </li><li> Réglez la sensibilité du tube photomultiplicateur pour la détection de FITC tels que les populations G1 et G2 / M sont au-dessus de fond. Cellules BrdU positives devraient être environ 10 fois plus lumineux et l'axe Y doit être affichée comme une échelle logarithmique. Il est parfois utile d'inclure un contrôle négatif pour la coloration BrdU (en remplaçant les anticorps anti-BrdU avec des non-IgG spécifiques à l'étape 2.3 ci-dessus) afin de distinguer clairement les cellules colorées positivement. </li><li> Ajuster la compensation entre l'iodure de propidium et FITC tels que des événements simples capturé par la forme cytomètre en flux d'un arc en forme de fer à cheval à partir de G1 en bas à gauche jusqu'à la phase S et vers le bas dans le coin inférieur droit pour G2 / M. S'il vous plaît voir la référence suivante pour un plus en profondeur DISdiscussion sur les principes et l'utilisation de la cytométrie de flux et de références là dans des applications spécifiques 2. </li></ol> 4. L'analyse des données <ol><li> 5 000 à 10 000 événements cellule unique avec la gamme souhaitée du contenu en ADN devraient être recueillies pour chaque échantillon afin d'avoir confiance que la population de cellules dans la culture ont été soigneusement échantillonnés. </li><li> Une fois que les cellules ont été mesurés pour l'iodure de propidium et le contenu de BrdU ils ont besoin pour être affecté à des phases G1, S ou G2 / M. Pour ce faire, le dessin des barrières autour des populations BrdU deux négatifs centré à 200 et 400 (G1 et G2 / M, respectivement). Tout au dessus de ces boîtes doivent être inclus dans une seule porte que les mesures de la phase S (fig. 1A). Le pourcentage de cellules dans chaque porte représente le nombre relatif de cellules en G1, S et G2 / M (Fig. 1B). </li></ol> 5. Protocole alternatif pour l'analyse du cycle cellulaire dans une population mixte de cellules <ol><li> Ce protocole alternatif estplus utile quand la transfection de vecteurs d'expression couramment traduit par un faible pourcentage de cellules exprimant le produit du gène d'intérêt, ou lorsque le traitement médicamenteux de sélectionner une population pure de cellules est impraticable. Il en résulte une proportion relativement faible de cellules d'intérêt étant contaminé par une grande population de cellules untransduced. Dans ce cas, la co-transfection de plasmides exprimant votre gène ou de shRNA d'intérêt avec un plasmide qui exprime un marqueur pour la détection de cellules transfectées par cytométrie en flux, comme une membrane ancrée GFP 3, ou un marqueur de cellule étrangère de surface tels que CD19 4 ou CD20 5. </li><li> Aux fins du présent protocole, nous allons utiliser CD20 coloration comme un exemple, cependant, la coloration pour CD19 est essentiellement identique. Dans le cas de transfection avec le CD20, il n'est pas nécessaire d'étiqueter BrdU, les cellules de récolte simplement comme décrit dans les étapes 1.2 à 1.5 ci-dessus et les taches en ajoutant 20 uL FITC conjugué anticorps anti-CD20 sur les cellules sur les iCE pendant 20 minutes dans l'obscurité. Fixer les cellules comme décrit en 1.6 étape. Les cellules peuvent à nouveau être stocké pendant au moins un mois à 4 ° C dans l'obscurité. Pour la détection de la GFP, omettre la coloration des anticorps de cette étape et de fixer et de stocker les cellules comme décrit. </li><li> Réhydrater les cellules par granulation dans la centrifugeuse à 500 xg pendant 5 minutes et remettre en suspension dans 5 ml de PBS contenant 1% de BSA. </li><li> Re-granulés les cellules à 500 xg pendant 5 minutes et remettre les cellules dans 0,5 ml d'iodure de propidium et la solution de RNase comme décrit plus haut dans la section 2.5. </li><li> Continuez à suivre les instructions de préparation de cellules dans 2,6 et l'analyse des instructions en 3.1 et 3.2. </li><li> Réglez la sensibilité du tube photomultiplicateur pour la détection de FITC telles que cellules non colorées sont au-dessus de fond. Idéalement, CD20-FITC des cellules positives seront 10X à 100X plus intensément colorés que les antécédents et l'axe des Y de cette parcelle doit être affichée comme une échelle logarithmique (figure 2A). CD20 des cellules positives qui sont plus brillantes que les 10X backgrond (et avec coloration iodure de propidium entre 200 et 400) devraient être sélectionnés pour affichage dans un iodure de propidium par rapport numérations cellulaires histogramme, comme indiqué dans la Fig. 2C. Pour les lignées cellulaires qui expriment des marqueurs qui sont facilement tachés vives (c.-à-10X à 100X dessus du fond), le CD20 positif de coupure doit être réglé à fond 10X. L'inclusion des cellules présentant une coloration plus faible augmente la variabilité de ces expériences, sans doute parce que le gène d'intérêt est également faiblement exprimés dans ces cellules. Pour les lignées cellulaires qui ne donnent que faiblement teinté CD20 positifs (c.-à moins de fond 10X), la détermination d'une large coupe doit être faite en utilisant un témoin négatif constitué de CD20 tachés, les cellules non transfectées. </li><li> Au moins 1000 CD20 événements positifs devraient être recueillies pour chaque échantillon. Les expériences avec moins que 1000 va produire des événements forte variabilité. Les logiciels tels que ModFit LT (Verity Software), cycle AV Multi (Phoenix Flow Systems), et les flux de Jo (Arbre Étoile) utilisent les estimations des mathématiquesles populations G1, S et G2 / M qui contribuent à la forme de la courbe des histogrammes tels que ceux montrés dans la Fig. 2B et C. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: Nous fournissons trois exemples d'analyses expérimentales du cycle cellulaire en utilisant nos approches. La première utilise l'expression de la cycline rétroviraux inhibiteurs de kinases dépendantes dans p27KIP1 fibroblastes embryonnaires de souris. Vingt quatre heures après la sélection des médicaments pour une infection virale a été complète, les cellules ont été étiquetés avec impulsion de BrdU pendant une heure. Dans cette expérience, l'expression ectopique de l'inhibiteur est utilisé pour arrêter la prolifération des cellules (Fig. 3A et B). Comme indiqué dans la Fig. 3B petits événements de BrdU positives sont évidentes dans la porte de la phase S en réponse à p27. De même, le pourcentage de cellules en phase S de cellules exprimant p27 est assez faible comme schématisé dans la Fig. 3C. Ce type d'analyse a été très efficace dans la caractérisation des défauts dans le contrôle du cycle cellulaire des cellules dérivées de diverses souches de gène-souris ciblées 6, 7, 8. Dans la deuxième expérience, les cellules épithéliales mammaires non transformées (MCF10A) ont été traités avec la cytokine la croissance inhibitrices, transforming growth factor beta un (TGF-β1) pendant 24 heures. Les cellules ont été marquées avec BrdU pendant quatre heures immédiatement avant la récolte. Comme indiqué dans la Fig. 4 marquage BrdU dans les cellules en phase S est fortement diminuée par le TGF-β1 de signalisation, la spécificité de notre coloration est également validé par un contrôle négatif IgG (figure 4C). Quantification des différentes phases du cycle cellulaire confirme que le TGF-β1 inhibe la prolifération surtout dans la phase G1 du cycle cellulaire, conduisant à une accumulation dans cette phase. Dans notre dernier exemple, PRB déficient cellules Saos-2 sont transfectées par un vecteur CMV-CD20 expression et soit CMV-RB ou CMV-β-Gal comme un contrôle. Trois jours après transfection, les cellules ont été récoltées, taché, et fixe. L'analyse par cytométrie de flux de ces celluless est montré dans la Fig. 5. Cela démontre la distribution du cycle cellulaire des cellules transfectées de contrôle négatif (Fig. 5A) en comparaison avec la répartition suivante 72 heures d'expression pRB (Fig. 5B). Après ajustement de courbe par un logiciel de cycle pluriannuel, une comparaison directe de la proportion des phases du cycle cellulaire est montré dans la Fig. 5C. Cela révèle l'accumulation de cellules en G1 pRB expression suivante et l'épuisement relatif de cellules à partir des phases S et G2 / M. Nous avons utilisé des variations sur ce test pour sonder les mécanismes d'arrêt G1 abondamment 9, 10, 11, 12, 13. Ces exemples montrent comment le contrôle du cycle cellulaire peut être mesurée en réponse à une variété de stimuli ou de manipulations cellulaires. Cette approche peut donc être adapté à de nombreuses applications qui nécessitent la mesure de la position du cycle cellulaire dans des expériences de type de culture. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig1.jpg"> Figure 1. Quantittion des phases du cycle cellulaire par l'iodure de propidium combinés et coloration BrdU (PI-BrdU). (A) Ce panneau affiche trois dimensions de la cytométrie de flux et de l'iodure de propidium cellules colorées BrdU. Notez que les cellules avec du contenu en ADN 2N et 4N sont centrées sur les 200 et 400 marques sur l'échelle de l'axe X pour l'intensité de coloration de propidium iodure. Intensité de coloration BrdU est mesurée sur une échelle logarithmique sur l'axe Y. Notez la position des portes utilisées pour quantifier les cellules dans les phases G1, S et G2 / M du cycle cellulaire. (B) la proportion relative de cellules dans chacune des portes G1, S et G2 / M de A sont représentées sur ce graphique. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig2.jpg"> Figure 2. Quantification des phases du cycle cellulaire dans les cellules sélectionnées en utilisant l'iodure de propidium et le marqueur CD20 à la surface cellulaire. (A) Ce panneau indique l'iodure de propidium et CD20 coloration pour un mélange de cellules, dont certaines expriment le CD20 ectopique et pRB. Notez que les cellules avec2N et de l'ADN 4N (les populations les plus abondantes) sont centrées sur les 200 et 400 marques sur l'axe X. La position de la porte de CD20 + sélectionne les cellules qui sont colorées d'au moins 10X plus brillamment que de fond. (B) Un graphique de la numération cellulaire par rapport coloration iodure de propidium est indiqué pour le CD20 des cellules négatives dans le panneau A qui sont en mode asynchrone prolifèrent. (C) Un graphique similaire est indiqué pour le CD20 des cellules positives à partir du panneau A qui ont été induits à l'arrestation à l'expression de pRB et contiennent des cellules avec du contenu en ADN principalement 2N. Cela démontre que l'arrêté sous-population peuvent être distinguées des autres cellules de cette culture en utilisant cette technique de coloration. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig3.jpg"> Figure 3. Inhibition de la prolifération cellulaire par p27KIP1. (A) PI-BrdU analyse est utilisée pour mesurer les phases du cycle cellulaire dans une population asynchrone prolifération de cellules qui ont été transduites avec une vecto vides rétroviraux pBABER. (B) Une analyse similaire des cellules transduites avec pBABE-p27. Notez l'absence de cellules dans la phase S et une plus grande intensité des événements dans G1 et G2 / M portes. (C) La quantification des cellules dans les phases respectives du cycle cellulaire en mode asynchrone prolifèrent de contrôle et des cellules exprimant p27. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig4.jpg"> Figure 4. Inhibition de la prolifération cellulaire par le TGF-β1 (A) PI-BrdU analyse de manière asynchrone cellules proliférantes MCF10A. (B) Analyse des cellules traitées avec 100 pM de TGF-β1 pendant 24 heures. Notez l'accumulation de cellules principalement dans la phase G1 du cycle cellulaire. (C) Validation de la coloration BrdU en remplaçant l'anticorps anti-BrdU primaire avec un contrôle non-IgG spécifiques dans les cellules prolifèrent de manière asynchrone. (D) quantification graphique des phases respectives du cycle cellulaire de A et B. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig5.jpg"> Figure 5. Inhibition de la prolifération cellulaire par pRB. (A) par rapport comptages cellulaires coloration iodure de propidium de CD20 et de ß-gal cellules transfectées est montré. Ceci est un contrôle important que la transfection peut partiellement synchroniser les cellules, ce qui rend la population non transfectées (CD20 - cellules) comme un contrôle inapproprié pour le transfectées sous-population. Les cellules transfectées ont besoin d'être comparé à d'autres cellules transfectées de façon analogue. (B) comptages cellulaires par rapport graphe d'iodure de propidium CD20 et pRB cellules transfectées. A noter la présence quasi exclusive d'un pic de 2N. (C) Représentation graphique des proportions du cycle cellulaire de phase déterminée à partir de A et B en utilisant des méthodes d'ajustement des courbes dans le logiciel cycle pluriannuel.

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Dans notre expérience, le succès de ces techniques dépend de quelques contrôles clés et des conditions expérimentales. L&#39;un est l&#39;établissement d&#39;un contrôle de la prolifération de manière asynchrone pour une utilisation dans ces expériences. Ce contrôle sert trois objectifs importants. D&#39;abord, il s&#39;assure que les conditions de culture utilisé pour tous les échantillons expérimentaux sont adéquates pour soutenir la prolifération continue en l&#39;absence de traitement. Cet échantillon sert également l&#39;objectif d&#39;un contrôle positif pour la méthodologie de coloration pour s&#39;assurer que BrdU ou CD20 des cellules positives peuvent être détectés quand ils sont présents. Enfin, cet échantillon est utilisé pour étalonner le cytomètre en flux. Cet échantillon de contrôle peuvent être utilisés pour ajuster l&#39;intensité de propidium coloration iodure pour détecter les cellules 2N et 4N à 200 et 400 respectivement. Par ailleurs, la sensibilité de détection de BrdU ou CD20 peut être ajustée de sorte que les signaux négatifs et positifs sont centrés, comme indiqué dans les figures 1A et 2A. Lorsque tous les échantillons ont une concentration similaire de cellules dans PI-RSolution de Nase, puis quelques ajustements à l&#39;cytomètre sont nécessaires que les échantillons ultérieurs sont exécutés. Ceci est important pour des raisons indiquées dans la Fig. 4B et 5B où l&#39;accumulation G1 forte crée essentiellement un pic G1 unique qui pourrait être interprétée comme G2 / M. Les expériences représentatives aussi faire d&#39;autres points importants. Tout d&#39;abord, ils montrent que l&#39;absorption de BrdU et l&#39;étiquetage peut varier entre les types cellulaires. Pour cette raison il est important de déterminer empiriquement la longueur des impulsions et des conditions de coloration nécessaire pour détecter adéquatement les cellules en phase S. En général, les types de cellules qui doublent dans la culture en 24 heures ou moins peuvent être étiquetés avec BrdU dans une heure. Ralentissement des types de cellules peuvent exiger plus de croissance des légumineuses et des altérations des conditions de coloration des anticorps et la durée. Cellules MCF10A sont un excellent exemple à cet égard comme ils ont été marqués avec BrdU pendant quatre heures et colorées avec le double de la concentration de l&#39;étalon d&#39;anticorps pour quatre fois plus longtemps. Les enquêteurs ontdevraient faire attention à ne pas dépasser 6 heures de marquage au BrdU, même avec des cellules croissance très lente, car cela peut conduire à tort inclusion de G2 / M cellules dans la population en phase S. Deuxièmement, en comparant les effets de l&#39;expression p27KIP1 avec ceux du TGF-β1, il est clair que p27 peut induire une accumulation dans les deux G1 ou G2 / M phases de TGF-β1 tout de signalisation induit un arrêt en G1. Les moyens traditionnels de détection de la prolifération tels que 3 H-thymidine et de comptage à scintillation sont incapables de distinguer ces possibilités. Dans notre protocole alternatif, nous démontrons la détection d&#39;une sous-population de cellules dans une population plus large non transfectées. Il est important de déterminer empiriquement le journaliste le plus approprié pour la détection de cellules transfectées. Dans notre expérience certains types de cellules, soit la surface des cellules expriment des marqueurs mal, ou ne peut pas correctement leur trafic vers la membrane plasmique, résultant en une incapacité à détecter les cellules transfectées. Likewise, toutes les cellules ne tolèrent la forme membranaire liée de la GFP. Sélection de la journaliste la plus appropriée devrait être fait en évaluant l&#39;efficacité de transfection du journaliste ainsi que l&#39;intensité relative de l&#39;expression par rapport aux contrôles non transfectées. Idéalement, l&#39;expression hétérologue de ces molécules sera bien toléré et ceci est suggestive que les marqueurs ont peu ou pas d&#39;effet sur la distribution du cycle cellulaire. Une limitation de ces types d&#39;approches de cytométrie en flux est qu&#39;ils ne sont capables d&#39;établir des abondances relatives des phases du cycle cellulaire par rapport à l&#39;autre. Pour cette raison, il est ambigu si l&#39;expression de p27 dans la Figure 3 induit un véritable arrêt en phase G1 et G2 / M, ou si elle ralentit la progression juste à travers ces phases relatives à la phase S. Ces possibilités peuvent être étudiées plus loin en traitant un échantillon parallèle de cellules avec un inhibiteur mitotique, comme le nocodazole, ou G1 / S, comme inhibiteur de aphidicoline. Étant donné que ces médicaments créent une dominant dans l&#39;arrestation de M-phase ou au début de la phase S, respectivement, les cellules prolifèrent lentement vont s&#39;accumuler au point d&#39;arrêt d&#39;origine médicamenteuse. Pour les cellules en G1 par exemple été arrêtés en raison de l&#39;expression pRB restera en G1, malgré le traitement tandis que les cellules de contrôle nocodazole va s&#39;accumuler dans la phase M-13. Pris ensemble, ces approches expérimentales offrent une méthodologie flexible qui peut être appliquée à un large éventail de questions de recherche de cellules de mammifères cycle. Ils peuvent facilement détecter les altérations de la progression du cycle cellulaire et de quantifier les différences par rapport aux témoins.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif / équipements </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> Réactif de marquage prolifération cellulaire </td><td> GE Amersham </td><td> RPN201 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorps anti-BrdU </td><td> BD Biosciences </td><td> 347580 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorps anti-souris conjugué FITC </td><td> Vector Labs </td><td> FI-2000 </td><td></td></tr><tr><td> Filtres souche cellulaire </td><td> BD Falcon </td><td> 352235 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorps anti-CD20 </td><td> BD Biosciences </td><td> 347673 </td><td></td></tr><tr><td> Cycle Software multi </td><td> Phoenix Flow Systems </td><td> N / A </td><td></td></tr></tbody></table>

analyse de la situation du cycle cellulaire dans les cellules de mammifères

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

La régulation de la prolifération cellulaire est au cœur de la morphogenèse des tissus durant le développement des organismes multicellulaires. Par ailleurs, la perte de contrôle de la prolifération cellulaire sous-tend la pathologie des maladies comme le cancer. En tant que tel il ya grand besoin d&#39;être en mesure d&#39;enquêter sur la prolifération cellulaire et à quantifier la proportion de cellules dans chaque phase du cycle cellulaire. Il est également d&#39;importance vitale pour indistinctement identifier les cellules qui se répliquent leur ADN au sein d&#39;une population plus large. Depuis la décision d&#39;une cellule à proliférer est faite dans la phase G1 immédiatement avant d&#39;initier la synthèse d&#39;ADN et de progresser dans le reste du cycle cellulaire, la détection de synthèse d&#39;ADN à ce stade permet une détermination sans ambiguïté du statut de régulation de la croissance en culture cellulaire expériences. Le contenu en ADN dans les cellules peuvent être facilement quantifié par cytométrie en flux des cellules colorées avec de l&#39;iodure de propidium, un colorant fluorescent intercalant l&#39;ADN.De même, synthèse de l&#39;ADN active peut être quantifiée par la culture de cellules en présence de thymidine radioactive, la récolte des cellules, et en mesurant l&#39;incorporation de la radioactivité en une fraction insolubles dans l&#39;acide. Nous avons une expertise considérable en analyse du cycle cellulaire et de recommander une approche différente. Nous enquêtons sur la prolifération cellulaire à l&#39;aide bromodésoxyuridine / fluorodésoxyuridine (abrégée simplement comme BrdU) coloration qui détecte l&#39;incorporation de ces analogues thymine dans l&#39;ADN récemment synthétisée. Étiquetage et marquage des cellules avec BrdU, combiné avec coloration de l&#39;ADN total par l&#39;iodure de propidium et l&#39;analyse par une cytométrie en flux offre la mesure la plus précise des cellules dans les différentes phases du cycle cellulaire. Il est notre méthode préférée parce qu&#39;elle combine la détection de la synthèse de l&#39;ADN actif, grâce à une coloration à base d&#39;anticorps de BrdU, avec du contenu en ADN total de l&#39;iodure de propidium. Cela permet la séparation claire des cellules en G1 de phase précoce, S ou S fin de phase de G2 / M.Par ailleurs, cette approche peut être utilisée pour étudier les effets de plusieurs stimuli cellulaires différents et des agents pharmacologiques sur la régulation de la progression à travers ces différentes phases du cycle cellulaire. Dans ce rapport, nous décrivons des méthodes de marquage et de coloration des cellules en culture, ainsi que leur analyse par cytométrie en flux. Nous incluons également des exemples d&#39;expérimentation de la façon dont cette méthode peut être utilisée pour mesurer les effets des signaux d&#39;inhibition de la croissance des cytokines comme le TGF-β1, et les inhibiteurs de prolifération tels que l&#39;inhibiteur de kinase cycline-dépendantes, p27KIP1. Nous incluons également un autre protocole qui permet l&#39;analyse de la position du cycle cellulaire dans une sous-population de cellules au sein d&#39;une culture plus large 5. Dans ce cas, nous montrons comment détecter un arrêt du cycle cellulaire dans les cellules transfectées avec le gène rétinoblastome, même si beaucoup plus nombreux que par les cellules non transfectées dans la même culture. Ces exemples illustrent les nombreuses façons coloration de l&#39;ADN et que lescytométrie en flux peut être utilisé et adapté pour étudier des questions fondamentales de contrôle du cycle cellulaire des mammifères.

Déterminer la position du cycle cellulaire d&#39;une population de cellules, ou de comprendre comment les signaux affectent la prolifération, peut être facilement mesurée par cytométrie en flux en utilisant ce protocole. Nous rapportons une approche expérimentale simple pour coloration des cellules et de quantifier leur position dans le cycle cellulaire.

Analyse de la situation du cycle cellulaire dans les cellules de mammifères

La régulation de la prolifération cellulaire est centrale pour la morphogenèse tissulaire lors du développement des organismes multicellulaires. De plus, la perte de contrôle de...

L'objectif de cette procédure est de pouvoir déterminer la proportion de cellules dans les différentes phases du cycle cellulaire. Cela est réalisé en ajoutant d'abord le réactif de marquage de la prolifération cellulaire BRDU à une culture cellulaire viable afin qu'il s'incorpore à l'ADN nouvellement synthétisé, puis en marquant le BRDU présent dans les cellules ayant intégré le réactif, ensuite l'ADN est coloré avec de l'iodure de propidium. La dernière étape consiste à évaluer la proportion de cellules dans les différentes phases du cycle cellulaire par cytométrie en flux.En fin de compte, la distribution du cycle cellulaire d'une population de cellules expérimentales peut être visualisée par analyse cytométrique en flux de cellules marquées au BRDU. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l'incorporation de tritium à la thymidine et le comptage par scintillation, est qu'avec le marquage au BRD, la proportion de cellules dans chaque phase du cycle cellulaire peut être déterminée. La démonstration visuelle de ce message est essentielle, car l'analyse cytométrique associée est difficile à expliquer sans images accompagnant les différents paramètres devant être ajustés.La procédure sera démontrée par deux étudiants diplômés de mon laboratoire, Matt Chii et moi, Miri. AJOUTER DU BRDU à une dilution de un pour 1000 dans les cultures cellulaires expérimentales, puis incuber pendant une heure. Récolter les cellules, aspirer le milieu de culture, puis laver soigneusement les cellules deux fois avec du PBS afin d'éliminer toutes les traces de milieu. Cette fois, rincer rapidement les cultures une fois supplémentaire avec du PBS supplémenté de trois millimolaires de EDTA, puis aspirer complètement la solution de P-B-S-E-D-T-A pour détacher les cellules.Ajouter environ 0,5 millilitre de P-B-S-E-D-T-A dans chaque boîte de culture de six centimètres et incuber les boîtes à 22 degrés Celsius pendant environ cinq minutes. Ensuite, transférer les cultures cellulaires de chaque plaque dans des tubes coniques individuels de 15 millilitres. Centrifuger ensuite les cellules à 500 × g pendant cinq minutes à température ambiante, puis éliminer le surnageant, puis resuspendre les cellules dans 100 microlitres de PBS.Enfin, fixer les cellules en ajoutant cinq millilitres d'éthanol à 95 % goutte à goutte tout en vortexant, puis centrifuger les cellules à 500 ×g pendant cinq minutes à température ambiante. Une fois encore, éliminer l'éthanol et resuspendre le culot dans un millilitre de HCl deux fois normal contenant 0,5 % de Triton X-100 en ajoutant la solution aux cellules de manière goutte à goutte tout en vortexant, puis incuber les cellules à température ambiante pendant 30 minutes. Après avoir recentrifugé les cellules, aspirer le surnageant S en prenant un soin particulier, car les cellules forment un culot très lâche à cette étape.Ensuite, redisperser délicatement le culot dans un millilitre de tétraborate de sodium 0,1 molaire et incuber à nouveau les cellules. Centrifuger à nouveau les cellules puis, cette fois, les incuber dans 0,5 millilitre de solution d'anticorps contenant des anticorps primaires anti-BRDU de souris dilués au 1/50. Après une nouvelle centrifugation des cellules, redisperser ce culot dans 50 microlitres de solution d'anticorps contenant des anticorps secondaires conjugués anti-US ZI de lapin, dilués au 1/25.Incubez ensuite les cellules à l'obscurité pendant 30 minutes à température ambiante. Après la centrifugation finale, incubez-les dans 0,5 millilitre de solution d'iodure de propidium et d'ARN à l'obscurité à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Enfin, faites passer la solution de cellules digérées à travers un filtre cellulaire pour éliminer les agrégats.Ensuite, transférez les cellules individuelles dans un tube approprié pour la prise d'échantillon sur le cytomètre en flux pour des populations cellulaires se divisant de manière asynchrone, comme celle illustrée. Dans cet exemple, placez une fenêtre autour des deux pics les plus abondants sur le tracé de discrimination des doubles afin de sélectionner les événements correspondant à des cellules uniques pour toutes les analyses ultérieures. Analysez ensuite un échantillon de culture se divisant de manière asynchrone afin de servir de contrôle positif pour la coloration et le réglage des paramètres du cytomètre en flux.Régler la sensibilité du tube photomultiplicateur pour la coloration par l'iodure de propidium de manière à ce que les pics à deux N et quatre N provenant des cellules uniques soient centrés aux unités arbitraires 200 et 400 sur l'axe des x. Ensuite, régler la sensibilité du tube photomultiplicateur de détection du FXI de sorte que les cellules négatives pour le FXI soient au-dessus des niveaux de fond. Les cellules positives pour le BRDU doivent être environ 10 fois plus brillantes, et l'axe des x doit être affiché selon une échelle logarithmique.Les événements individuels capturés par le cytomètre en flux forment un arc en forme de fer à cheval, partant de la phase G1 en bas à gauche, passant par la phase S, puis redescendant en bas à droite pour la phase G2/M. Comme le montre cette figure représentative, collectez entre 5 000 et 10 000 événements cellulaires individuels afin d'obtenir la gamme souhaitée de contenu en ADN. Après avoir mesuré la teneur en iodure de propidium et en BrdU, attribuez les cellules aux phases G1, S ou G2/M à l’aide de fenêtres entourant les deux populations négatives pour le BrdU, centrées sur 200 pour la phase G1 et sur 400 pour la phase G2/M. Incluez tous les événements situés au-dessus de ces deux fenêtres dans une seule fenêtre destinée à la mesure de la phase S ; le pourcentage de cellules dans chaque fenêtre représentera le nombre relatif de cellules présentes dans les phases G1 et G2/M, comme illustré ici sur ce graphique en barres correspondant à la figure précédente du nuage de points.Après coloration pour un marqueur cellulaire d'intérêt, dans cet exemple CD20, centrifuger les cellules à 500 × g pendant 10 minutes à 22 degrés Celsius, puis resuspendre le culot dans cinq millilitres de PBS supplémenté avec 1 % de BSA. Après avoir à nouveau centrifugé les cellules à 500 × g pendant cinq minutes à température ambiante, utiliser 0,5 millilitre de la solution d'iodure de propidium et d'ARN pour réhydrater les cellules. Ensuite, colorer et digérer les cellules comme indiqué précédemment, puis sélectionner les pics de cellules uniques à 2n et 4n, et régler la sensibilité du tube photomultiplicateur pour la détection de FXI de sorte que les cellules non colorées soient au-dessus des niveaux de fond.Idéalement, les cellules positives pour le CD 20 FXI doivent présenter une coloration 10 à 100 fois plus intense que le fond. Encore une fois, l'axe des abscisses doit être affiché sur une échelle logarithmique. Enfin, sélectionnez les cellules positives pour le CD 20 qui sont 10 fois plus brillantes que les niveaux de fond et dont la coloration par l'iodure de propidium se situe entre 200 et 400, afin de les afficher sur un histogramme représentant l'iodure de propidium en fonction du nombre de cellules, comme illustré dans cet exemple de figure. Collectez au moins 1000 événements positifs pour le CD 20 par échantillon afin de limiter la variabilité de cette figure.L'analyse tridimensionnelle par cytométrie en flux des cellules marquées au propidium iodure et au BRDU est présentée. Notez que les cellules ayant un contenu d'ADN de deux n et quatre n sont centrées sur les repères 200 et 400 de l'échelle de l'axe X. L'intensité de marquage au propidium iodure et l'intensité de marquage au BRDU sont mesurées sur une échelle logarithmique.Sur l'axe Y, notez les positions des fenêtres utilisées pour quantifier les cellules dans les phases G1 s et G2 M du cycle cellulaire. La proportion relative des cellules dans chacune des fenêtres G1 s et G2 M de la figure précédente est indiquée ici. Ici, le propidium, l'iodure et le CD 20.La coloration provenant d'un mélange de cellules, dont certaines expriment de façon ectopique CD20 et PRB, est présentée. Notez que les cellules ayant deux n et quatre ADN, qui constituent les populations les plus abondantes, sont centrées sur les repères 200 et 400 de l'axe des x. La position des cellules sélectionnées positives pour CD20 correspond à celles qui sont colorées au moins 10 fois plus intensément que le fond. Cet histogramme représente les décomptes cellulaires en fonction de la coloration par l'iodure de propidium pour les cellules CD20 négatives issues du nuage de points précédent qui prolifèrent de manière asynchrone, tandis que dans cet histogramme, les cellules CD20 positives provenant du précédent nuage de points CD20, induites à l'arrêt par l'expression de pRb, et contenant principalement des cellules à contenu ADN 2N, sont montrées. Ces données démontrent qu'une sous-population arrêtée peut être distinguée des autres cellules en culture à l'aide de cette technique de coloration. Dans les trois figures suivantes, les données d'analyse cytométrique en flux de l'expression rétrovirale de l'inhibiteur des kinases dépendantes des cyclines p27KIP1 dans des fibroblastes embryonnaires de souris sont présentées ici.L'analyse par iodure de propidium et BRDU a été utilisée pour mesurer les phases du cycle cellulaire dans une population de cellules se divisant de manière asynchrone, transduites avec un vecteur rétroviral P babe vide comme indiqué ici. Peu d'événements BRDU positifs étaient visibles dans la fenêtre de la phase S en réponse à P 27. Remarquez également l'intensité accrue des événements dans les fenêtres G un et G deux M.De même, le pourcentage de cellules en phase S pour les cellules exprimant P 27 est assez faible, comme illustré sur cette figure. Ce type d'analyse s'est révélé très efficace pour caractériser les déficits de contrôle du cycle cellulaire dans des cellules provenant de diverses souches de souris génétiquement modifiées. Sur ces deux figures suivantes, des cellules épithéliales de la mémoire non différenciées ont été traitées pendant 24 heures avec la cytokine inhibitrice de croissance TGF bêta un.Comme le montre cette première figure, le marquage par le BRDU dans les cellules en phase S est fortement réduit par la signalisation de TGF bêta un. Notez l'accumulation de cellules principalement en phase G un du cycle cellulaire, telle qu'observée dans le panneau central. La quantification des différentes phases du cycle cellulaire confirme que TGF bêta un inhibe principalement la prolifération en phase G un du cycle cellulaire, entraînant une accumulation dans cette phase.Dans cette dernière série d'analyses expérimentales, des cellules SAS deux déficientes en PRB ont été transfectées avec un vecteur d'expression CMV CD 20 et soit avec CMV RB, soit avec CMV bêta GAL comme témoin. Ce premier graphique illustre la distribution du cycle cellulaire des cellules transfectées avec le témoin négatif comparée à leur distribution après 72 heures d'expression de PRB. Remarquez la présence quasi exclusive d'un pic à 2N dans le panneau droit ; dans ce dernier graphique, l'ajustement des courbes par un logiciel multi-cycle a révélé que les cellules s'accumulaient principalement en phase G1 suite à l'expression de PRB.Alors que les populations en phases S et G2/M étaient relativement appauvries. Une fois maîtrisée, cette technique peut être adaptée pour étudier d'autres marqueurs du cycle cellulaire, tels que les histones phosphorylées en Mph. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de déterminer la distribution dans le cycle cellulaire d'une population de cellules.N'oubliez pas que l'acide chlorhydrique normal est caustique et que l'iodure de propidium est un cancérogène potentiel. Ils peuvent présenter un danger en cas d'.Des précautions doivent toujours être prises lors de l'utilisation de ces produits chimiques.

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Suivi des changements subtils dans la progression et la cinétique des étapes du cycle cellulaire peut être accompli par l'utilisation d'une combinaison de marquage métabolique des acides nucléiques avec BrdU et totale coloration de l'ADN génomique par l'iodure de propidium. Cette méthode évite la nécessité de la synchronisation chimique des cellules de cyclisme, empêchant ainsi l'introduction de dommages à l'ADN non-spécifique, ce qui affecte à son tour la progression du cycle cellulaire.

Mesure cinétique cellulaire avec la progression du cycle marquage métabolique et cytométrie de flux

Métaphase anaphase de transition est déclenchée par l'anaphase de promotion de complexe (APC / C) en fonction de l'ubiquitination et la destruction subséquente de la cycline B. Ici, nous avons mis en place un système qui, à la suite pulse-chase étiquetage, permet de suivre la cycline B protéolyse dans des populations de cellules entières et facilite la détection des interférences par le checkpoint mitotique.

L&#39;étude de la protéolyse de la cycline B au niveau de la cellule unique dans les populations de cellules entières

miARN ou microARN sont des régulateurs clés de la progression du cycle cellulaire. Cette vidéo décrit une analyse du cycle cellulaire basée sur la cytométrie en flux de cellules cancéreuses du poumon transfectées avec des miARN, afin d’étudier l’effet des miARN sur la régulation du cycle cellulaire. L’inhibition de la prolifération en arrêtant la progression du cycle cellulaire s’est avérée être une approche prometteuse pour le traitement du cancer.

Analyse du cycle cellulaire : une approche pour étudier la régulation du cycle cellulaire des cellules cancéreuses du poumon transfectées par des miARN

Ce protocole décrit l'utilisation de bromodésoxyuridine (BrdU) absorption pour permettre le suivi temporel des cellules qui étaient en phase S à un moment précis dans le temps. Addition de colorants d'ADN et de l'étiquetage d'anticorps facilite l'analyse détaillée du sort des cellules en phase S au temps plus tard.

Suivi temporel de la progression du cycle cellulaire par cytométrie en flux, sans la nécessité pour la synchronisation

Nous rapportons deux protocoles de synchronisation cellulaire qui fournissent un contexte pour étudier les événements liés à des phases spécifiques du cycle cellulaire. Nous montrons que cette approche est utile pour analyser la régulation de gènes spécifiques dans un cycle cellulaire non perturbé ou lors de l'exposition à des agents affectant le cycle cellulaire.

Étude de l&#39;expression génétique régulée par un cycle cellulaire par deux protocoles complémentaires de synchronisation cellulaire

Nous présentons un protocole pour la synchronisation de la thymidine double de cellules HeLa suivie d’analyse à l’aide de la microscopie confocale haute résolution. Cette méthode est essentielle pour obtenir le grand nombre de cellules qui procèdent de façon synchrone de la phase S de mitose, permettant des études sur les rôles mitotiques de protéines multifonctionnelles qui possèdent également des fonctions de l’interphase.

Combinant la synchronisation cellulaire mitotique et microscopie confocale haute résolution pour étudier le rôle des protéines multifonctionnelles Cycle cellulaire au cours de la mitose

On décrit une méthode axée sur l’imagerie qui peut être utilisé pour identifier la phase S et analyser la dynamique du cycle cellulaire dans le c. elegans de germline hermaphrodite à l’aide de la thymidine EdU analogique. Cette méthode ne nécessite aucun transgènes et est compatible avec la coloration par immunofluorescence.

Analyse du Cycle cellulaire dans la lignée germinale de c. elegans avec la Thymidine Analog EdU

Ce protocole décrit comment isoler les kératinocytes cutanés des modèles de souris, les tacles avec des anticorps marqués en métal, et analyser les cellules tachées par cytométrie de masse afin de profiler le modèle d'expression des protéines d'intérêt dans les différentes phases du cycle cellulaire.

Isolement et coloration des kératinocytes de peau de souris pour l'analyse spécifique de cycle cellulaire de l'expression cellulaire de protéine par cytométrie de masse

Ce protocole détaille deux méthodes d’arrêt du cycle cellulaire de levure et de libération facultative, et développe l’utilisation de la microscopie à fluorescence pour étudier les processus dépendants du cycle cellulaire chez S. cerevisiae.

Manipulation et analyse des processus dépendants du cycle cellulaire chez les levures bourgeonnantes

Cellules d&#39;imagerie à long terme des mammifères en utilisant la microscopie à champ large

Apprenez à analyser les phases du cycle cellulaire dans les cellules de mammifères par cytométrie en flux avec marquage BRDU et iodure de propidium. Cette méthode permet de quantifier précisément les populations en G1, S et G2/M.

Analyse de la situation du cycle cellulaire dans les cellules de mammifères

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