Isolement et étude biophysique des cuticules de fruits

Cette expérience utilise des techniques biophysiques pour évaluer la capacité de réticulation du polymère cuticulaire du tomate, ainsi que pour surveiller l'élimination sélective des cires épi- et intracuticulaires des cuticules de fruits. L'isolement de la cuticule à partir du fruit entier est réalisé par un traitement enzymatique des peaux de tomate et des parois cellulaires associées. Dans une deuxième étape, une extraction au tétrachlorure de carbone est utilisée pour déparaffiner complètement la cuticule du fruit, afin d'obtenir la caractérisation moléculaire du cutine isolé.

Le biopolyester est analysé par résonance magnétique nucléaire à l'état solide. L'analyse spectrale par RMN à l'état solide révèle que, dans la cutine provenant des cuticules de fruits de tomate de type sauvage et génétiquement modifiés, il existe des différences dans les proportions relatives des motifs aliphatiques oxygénés capables de former des liaisons croisées. Alternativement, le fruit entier est enduit et pelé à l'aide de gomme arabique afin d'éliminer les cires épicuticulaires, puis plongé dans du chloroforme pour extraire les cires intracuticulaires de la cuticule du fruit.

Ensuite, les cuticules partiellement déparaffinées, isolées par le même traitement enzymatique que les peaux de tomate, sont examinées par résonance magnétique nucléaire à l'état solide et par microscopie à force atomique. En fin de compte, la suppression séquentielle des cires épicuticulaires et intracuticulaires apparaît par l'observation d'un pic de cire progressivement atténué dans les spectres RMN et par des modifications du profil de surface de la cuticule du fruit observées grâce à l'imagerie simultanée par MFA. Les organes aériens des plantes sont protégés par un assemblage de cire en polyester biologique appelé cuticule. Nous présenterons des protocoles permettant d'évaluer la suppression sélective des cires internes et externes des cuticules de fruit de tomate à l'aide de la résonance magnétique nucléaire à l'état solide et de la microscopie à force atomique.

Ces méthodes peuvent également être utilisées pour évaluer la capacité de réticulation de matériaux cuticulaires conçus. La démonstration des procédures sera assurée par trois membres du groupe Stark : le Dr Ishish Chatterjee, la candidate au doctorat Shantani Sarkar et l'ancienne élève de lycée Julia Tik. Un autre démonstrateur est le Dr Olivia Nisau, chercheuse postdoctorale dans le laboratoire de notre collègue en génie chimique, le Dr Alexander S. Pour commencer l'isolement enzymatique de la peau de tomate, placez trois fruits commerciaux ou cultivés dans un bol, retirez la peau en larges morceaux et jetez les tissus internes du péricarpe.

Ensuite, lavez les peaux de tomate avec de l'eau déionisée et conservez-les sous l'eau dans un bécher, en immergeant complètement la peau de tomate pelée dans un cocktail enzymatique préparé comme décrit dans le protocole écrit. Incubez à 31 degrés Celsius pendant 24 heures avec agitation continue. Récupérez les peaux de tomate à l'aide d'un entonnoir Büchner ou d'une passoire de cuisine et rincez-les avec de l'eau déionisée.

Après avoir placé les peaux dans une étuve sous vide à température ambiante pendant une heure, les peaux séchées peuvent être conservées dans un flacon étiqueté et bouché. Pour les procédures ultérieures de déparaffinage, remplir un thimble en verre centré ou jetable environ à moitié avec l'échantillon de cuticule de tomate, puis utiliser une pince pour le placer soigneusement à la base de la colonne d'extraction destinée à l'extraction solide. Continuer à mettre en place l'appareil d'extraction en utilisant du méthanol comme solvant, tel que décrit dans le protocole écrit.

Surveillez le processus pendant une heure, en ajustant la tension du variac de manière à ce que le réservoir accumule environ une goutte par seconde et que le siphonnage se produise à l'intérieur des chaussettes de l'appareil. Lorsque le creuset est plein, après une extraction de 12 heures, laissez l'appareil refroidir, puis abaissez le chauffe-ballon et retirez l'extracteur et le réservoir comme une seule unité afin d'éliminer le solvant après l'extraction. Inclinez la colonne pour permettre le siphonnage dans le flacon situé en dessous.

Utilisez une pince pour soulever le creuset juste en dessous du col de la colonne d'extraction. Éliminez le solvant excédentaire et placez le creuset sur une surface propre. Débranchez le ballon et versez les déchets dans un récipient pour solvant étiqueté.

Répétez la procédure d'extraction avec des solvants successifs de polarité progressivement décroissante, tels que le chloroforme et le taxane, pendant 12 heures chacun. Une fois l'échantillon de cuticule de tomate sec, mesurez-en la masse et conservez-le à température ambiante dans un flacon à vis fermé avec du parafilm. Pour préparer l'échantillon pour la RMN, placez quatre à six milligrammes de cuticules de tomate entièrement déparaffinées, appelées cutine, dans un rotor en zircone de 1,6 millimètre pour MAS rapide, en utilisant l'outil de chargement fourni par le fabricant.

Après avoir installé le bouchon supérieur, peignez la moitié du bouchon avec un feutre à encre noire afin de permettre la mesure de la vitesse de rotation. La configuration initiale de l'expérience de RMN à l'état solide est un processus techniquement exigeant qui s'effectue sous la supervision du personnel expérimenté. Commencez par régler l'homogénéité du champ magnétique et optimiser les paramètres expérimentaux à l'aide d'un composé modèle, comme décrit dans le protocole écrit. Insérez le rotor contenant l'échantillon et bien tassé dans la sonde, puis placez la sonde dans l'aimant.

Augmentez progressivement la vitesse de rotation jusqu'à 10 kilohertz afin de vérifier un bon tassement de l'échantillon et la capacité du rotor à tourner de manière stable avec une variation inférieure à 20 hertz. Ajustez itérativement les condensateurs de réglage et d'adaptation d'impédance de la sonde pour obtenir une réflexion de puissance minimale aux fréquences RMN du proton et du carbone 13. Réglez la température expérimentale à 25 degrés Celsius.

Lancez l'expérience CPMA préalablement optimisée correspondant à la condition d'ajustement proton-carbone de Hartman-Hahn déterminée à une fréquence de rotation de 10 kilohertz. Après avoir acquis 4 096 transitoires, conditionnez le spectre avec un élargissement exponentiel de la ligne de 50 à 100 hertz et effectuez une transformation de Fourier afin de générer un spectre RMN de l'intensité du signal en fonction du déplacement chimique, exprimé en parties par million. Référencez les déplacements chimiques du carbone 13 comme décrit dans le texte.

Augmentez la fréquence de rotation du rotor à 15 kilohertz et répétez la mesure C-P-M-A-S correspondant à la condition d'ajustement Hartman Han déterminée lors de l'analyse de déplacement chimique en fonction de la fréquence de rotation pour le carbone C-P-M-A-S. Les spectres de RMN du carbone 13 ont identifié les principaux groupes fonctionnels présents dans la cuticule de tomate exhaustivement cireuse à l'eau distillée : les PHA à longue chaîne, les PHA oxygénés, les liaisons multiples et les composés aromatiques, ainsi que les rendements en carbone. Les almo oxygénés jouent un rôle crucial dans l'établissement de liaisons covalentes entre les unités monomériques du biopolymère cutine, formant ainsi l'architecture moléculaire de la matrice de cutine.

Des différences dans les aires relatives des pics observées dans la région spectrale comprise entre 45 et 100 parties par million suggèrent que la cutine mutante possède une proportion relativement élevée de motifs structuraux CHO formant des réticulations par rapport à la cutine sauvage. Pour commencer l'isolement sélectif des cires épicuticulaires et intracuticulaires.

Lavez une deuxième série de tomates entières à l’eau distillée. Séchez-les avec des serviettes en papier et des lingettes Kim, puis placez-les, le pédoncule vers le bas, sur un morceau de papier d’aluminium. Appliquez sur les tomates entières, du haut vers le bas, une solution aqueuse de gomme arabique à 120 %.

Laisser sécher la gomme arabique sur la peau du fruit pendant une heure, de manière à former un film mince. Retirer ce film à l’aide de pinces, mais éviter de percer la peau de la tomate. Un traitement supplémentaire du film, tel que décrit dans le texte, permet d’obtenir la cire cuticulaire épique.

Les tomates resteront physiquement intactes. Plongez-les dans du chloroforme pendant deux minutes. À température ambiante, la cire intracuticulaire peut être récupérée après évaporation du solvant ; épluchez les tomates puis traitez-les enzymatiquement avec de la cellulase et de la pectinase en tampon acétate de sodium pour éliminer respectivement la cellulose et la pectine.

Une extraction par sel peut ensuite être effectuée comme décrit précédemment afin de déparaffiner complètement les tomates. Les expériences C-P-M-A-S peuvent être répétées avec des échantillons de cuticule de fruits naturels et partiellement déparaffinés comme décrit dans le texte. La mise en place du microscope à force atomique est un processus complexe et est mieux réalisée sous la supervision initiale d'un personnel technique expérimenté. Une MF commence par allumer le microscope à sonde balayante, abrégé en SPM, et s'assure que le commutateur de mode du microscope est réglé sur le mode de microscopie à force atomique en contact.

Ensuite, soulevez manuellement la tête du microscope à effet tunnel (SPM) en tournant ses deux boutons frontaux réglables par l'utilisateur. Détachez un porte-sonde à modulation de fréquence (FM) de la tête du SPM en desserrant la vis de serrage située à l'arrière de la tête. Utilisez une pince pour retirer le levier à modulation de fréquence existant de son support.

Ensuite, saisissez délicatement un nouveau levier en porte-à-faux avec une pointe en nitrure de silicium dans son emballage et installez-le en remplacement de l'ancien levier en porte-à-faux. Utilisez un microscope optique pour vérifier que le nouveau levier en porte-à-faux en mode FM n'est pas cassé. Fixez l'échantillon de cuticule de tomate sur un porte-échantillon à l'aide d'un ruban adhésif double face.

Utilisez un microscope optique pour vérifier que l'échantillon de cuticule reste plat et lisse. Après avoir placé l'échantillon sur le plateau, positionnez l'échantillon de cuticule de tomate fixé au plateau sur la zone magnétique située en haut du scanner SPM. En tournant les molettes, réglez les deux vis manuelles avant du scanner suffisamment haut pour éviter de briser la pointe AFM.

Lorsque le porte-pointe est placé dans la tête du microscope à effet tunnel (SPM), réglez la vis arrière motorisée à peu près au même niveau que les deux autres vis frontales. Réinsérez le porte-pointe dans la tête du SPM et fixez-le en serrant la vis de serrage arrière de la tête. Après avoir allumé le laser, alignez le spot laser sur le levier en mode de résonance (FM) à l’aide des boutons de réglage central et droit situés en haut de la tête.

Surveillez le faisceau laser réfléchi sur un morceau de papier afin de positionner précisément le point laser à l'extrémité d'un levier en mode FM. Ajustez la position du point laser pour obtenir un signal somme maximal. Régulez la position du point laser réfléchi sur le photodétecteur en ajustant horizontalement et verticalement la position du miroir mobile, de manière à ce que la lumière incidente soit reçue de façon uniforme par les quatre quadrants.

Le détecteur abaisse une pointe FM en rétractant les vis frontales réglées par l'utilisateur et la vis arrière motorisée du balayeur SPM. Surveiller visuellement l'approche de la pointe FM vers la surface de l'échantillon à l'aide d'un microscope inversé. S'assurer que les trois vis se trouvent au même niveau.

Pour éviter les artefacts liés à l'imagerie d'un échantillon incliné, approchez la pointe de l'échantillon sans toutefois l'approcher suffisamment pour qu'elle touche ou perce la surface de l'échantillon. La lumière laser réfléchie par le levier de la microscopie à force atomique (AFM) sera renvoyée par un miroir mobile vers un détecteur photosensible en mode contact AFM, en utilisant une sonde AFM en nitrure de silicium. Réglez la tension du signal de sortie à moins deux volts pour un point de consigne de zéro volt, et le signal différentiel à zéro volt, en ajustant la position du miroir.

À l'aide du logiciel nano scope, cliquez sur l'icône du microscope et sélectionnez le profil approprié. Dans le panneau des paramètres de contrôle du balayage, réglez la vitesse de balayage et la taille du balayage.

Laissez la pointe AFM entrer en contact avec la surface de l'échantillon en cliquant sur l'icône d'engagement de la pointe. En contrôlant la vis arrière motorisée de la base du SPM, le programme abaissera désormais la pointe jusqu'à ce qu'elle entre en contact avec la surface de l'échantillon. Le processus de balayage démarrera automatiquement une fois l'engagement de la pointe réussi.

Surveillez le processus de balayage à l’aide des modes image et scope du logiciel, et ajustez itérativement les paramètres pour obtenir des images de la résolution la plus élevée possible, comme décrit dans le protocole écrit. Par exemple, commencez le balayage avec une valeur élevée de l’échelle de données sur l’axe Z. Réduisez ensuite soigneusement la valeur de l’échelle de données Z afin d’obtenir le meilleur contraste des caractéristiques de surface sur l’image.

Capturez l'image pour enregistrer le fichier de données. Traitez les données à l'aide de fonctions d'aplanissement afin d'éliminer les artefacts d'image dus à la dérive verticale du scanner, aux courbures d'image et au décalage vertical entre les lignes de balayage. Enfin, calculez la rugosité moyenne du carbone.

Les spectres de RMN du 13 C-P-M-A-S-N-M-R ont montré une diminution progressive du pic de la cire à 31 parties par million, indiquant l'élimination séquentielle des cires épicuticulaires et intracuticulaires du composite cuté et cire, tout en préservant parallèlement l'architecture chimique principale du biopolymère cutine. Une analyse d'image en microscopie à force atomique (FM) a révélé des irrégularités de surface dues à l'extraction progressive des cires épicuticulaires et intracuticulaires à partir de la cuticule du fruit, signifiant des altérations dans l'organisation de l'assemblage cuticulaire. Une fois maîtrisée, cette technique permet d'effectuer en deux heures l'élimination séquentielle des cires épicuticulaires et intracuticulaires des cuticules de fruit de tomate.

Lorsqu'on effectue une extraction par solvant pour un dégraissage exhaustif des cuticules de fruits, il est important d'utiliser un panel de solvants de polarité variable après avoir utilisé le nœud de contact. Un protocole FM est illustré ici. D'autres expériences FM peuvent être utilisées pour mesurer l'élasticité de surface de la cuticule.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler de manière systématique les composants du composite cireux de cutine et réaliser une caractérisation moléculaire et un examen rapide de la surface des matériaux de cuticule à l’aide respectivement de la RM à l’état solide et de la MF. Les techniques illustrées dans cette vidéo permettent aux chercheurs en biologie végétale de déterminer la composition moléculaire et l’architecture supramoléculaire des tissus végétaux naturels et conçus.