Name: Isolement et étude biophysique des cuticules de fruits (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 53 s
Description: Découvrez l'isolement enzymatique des cuticules de tomate et l'analyse biophysique par RMN à l'état solide et microscopie à force atomique. Ces méthodes permettent d'évaluer la réticulation des biopolyesters cuticulaires et le retrait sélectif des cires.

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Ce travail a été soutenu par des subventions des États-Unis la National Science Foundation # MCB-0741914 et 0843627 MCB-; un soutien supplémentaire des infrastructures a été fourni au City College de New York par les Instituts nationaux de la santé 2 G12 RR03060-26 à partir du Centre National de Ressources de recherche. Nous tenons à remercier le JKC Rose groupe dans le département de l&#39;Université Cornell Biologie végétale pour fournir M82 (type sauvage) et CM15 (mutant) cuticules de tomate. Nous remercions le Dr Spyros Monastiriotis du groupe d&#39;ingénierie chimique CCNY du professeur Alexander Couzis pour son aide généreuse avec les expériences AFM. Nous remercions Mme Lauren Gohara pour aide à la conception graphique.

1. Isolement enzymatique de la tomate cuticules 5 <ol><li> Placez plusieurs tomates commerciales ou cultivées dans un bol. Retirer la peau des fruits en grandes sections; jeter le péricarpe interne. Laver les peaux de tomates avec de l'eau déminéralisée et de les conserver sous l'eau dans un bécher. </li><li> Préparer un pH 4,0 à 50 mM de tampon acétate de sodium (à 31 ° C) en mettant 1,22 g de trihydrate d'acétate de sodium (M r. 136,08 g / mole) et 2,34 ml d'acide acétique glacial (17,485 M) dans un bécher, ajoutant 200 ml d' de l'eau désionisée, puis ajustement du pH à 4,0 à 31 ° C. Préparer un mélange contenant 4 ml de pectinase (EC 3.2.1.15; 10 U ml -1, TCI America), 0,2 g de cellulase (CE 232.734.4; 1,3 unités / mg de solide, Sigma-Aldrich), et 13 mg NaN 3, puis ajouter 196 ml de tampon acétate de sodium du mélange d'enzymes pour obtenir 200 ml de cocktail enzymatique finale. 5 immerger complètement la peau des tomates pelées dans le cocktail enzymatique et incuberà 31 ° C pendant 24 heures avec une agitation constante (G24 environnement Incubateur agité; New Brunswick Scientific Co.). </li><li> Recueillir les peaux de tomates à l'aide d'une passoire de cuisine ou entonnoir Büchner et les laver avec de l'eau déminéralisée. Par la suite, placez-les dans un four sous vide à température ambiante pendant une heure. Préserver les peaux de tomates séchées dans une bouteille étiquetée et plafonné pour les procédures ultérieures de déparaffinage. </li></ol> 2. Déparaffinage exhaustive par extraction Soxhlet 6 <ol><li> L'équipement utilisé pour le déparaffinage exhaustive se compose d'une source de chaleur (chauffage manteau et Variac contrôleur), ballon à fond rond pour un réservoir de solvant, extraction Soxhlet, en verre fritté dé à coudre ou cartouche d'extraction jetables, anti-puces de supplantation et un condenseur (voir Fig. 1). Notez que le bras de siphon étroit (parties 6 et 7 dans la Fig. 1) est très délicate et sujette à la rupture, nécessitant une manipulation minutieuse. </li><li> Mettez 0,5-1 g de peau de la tomate (obtenue enl'étape 1.) dans un mortier, et broyer l'échantillon pour obtenir une poudre grossière avec un pilon à moins que les échantillons doivent être utilisés pour les mesures AFM (section 5). Remplir une cartouche en verre fritté ou en papier à mi-chemin avec l'échantillon et à utiliser des pinces pour le placer soigneusement à la base de la colonne d'extraction. </li><li> Fixer le condenseur et l'envelopper de papier d'aluminium. Chauffer le méthanol (qualité ACS) solvant, en présence de quelques anti-puces de supplantation jusqu'à ébullition doucement et reflux sur les parois du ballon. Couvrir le réservoir de solvant avec de la laine de verre à la fois et une feuille d'aluminium. Vérifier le processus pendant une heure, réglage de la tension Variac sorte que le réservoir accumule environ une goutte par seconde et le siphonnage se produit au sein de l'appareil de Soxhlet lorsque la cartouche est pleine. </li><li> Continuer le processus d'extraction pendant 12 h, puis baisser le manteau de chauffage et de permettre à l'appareil de se refroidir. Retirez l'extracteur et le réservoir comme une seule unité à disposer du solvant. Utilisez tweezers pour élever la cartouche à juste en dessous du col de la colonne d'extraction, le solvant en excès s'écouler de lui, et placer la cartouche sur une surface propre. Inclinez la colonne d'extraction afin de permettre la solution dans le flacon ci-dessous. Débranchez le flacon et verser les déchets dans un récipient à déchets dûment étiqueté solvant. </li><li> Répétez les étapes 2.3 et 2.4 pour les solvants successifs de polarité diminuant progressivement, par exemple, le chloroforme et l'hexane pendant 12 h dans chaque cas. </li><li> Laisser l'échantillon cutine tomates pour sécher l'intérieur de la cosse, soit par soufflage d'un courant d'azote gazeux au-dessus ou en le plaçant dans un four sous vide à température ambiante. Enfin, mesurer la masse de l'échantillon sec et de le stocker à température ambiante dans un bocal vis-dessus scellée avec du parafilm. </li></ol> 3. Isolement sélectif des cires épicuticulaires et Intracuticular 3,4 <ol><li> D'abord, lavez les tomates entières (un lot distinct de tomates de celles décrites en 1.) Avec de l'eau distillée. Séchez-les avec papserviettes er et Kimwipes et placez-les souches à la baisse sur un morceau de papier d'aluminium. </li><li> Peignez les tomates entières avec 120% (ratio de la masse w / w,) la gomme arabique solution aqueuse dans un top-down de mode et de permettre à environ une heure pour la gomme arabique à sécher sur la peau du fruit, laissant une fine pellicule. Retirez ce film en utilisant des pinces, en prenant soin de ne pas percer la peau de la tomate. Répétez la procédure une fois de plus. </li><li> Ajouter des films dans des flacons contenant 1:1 (v / v) de chloroforme-eau et mélanger pendant trois minutes. Après une agitation vigoureuse et une séparation de phase, pipeter les fractions de chloroforme et les flacons séparés s'évaporer dans découverts, laissant la cire épicuticulaire. Les tomates restera physiquement intact. Trempez-les dans du chloroforme pour les deux minutes à température ambiante et de recueillir la cire intracuticular après évaporation du solvant. Maintenant, peler les tomates et les traiter par voie enzymatique (avec de la cellulase et la pectinase dans du tampon acétate de sodium) pour enlever la cellulose et pectine, respectivement (comme décrit dans <li> Si vous le souhaitez, effectuer un déparaffinage exhaustive sur ces cuticules isolées enzymatiquement par extraction Soxhlet (voir étape 2), en utilisant trois solvants de polarité variable (méthanol, le chloroforme et l'hexane, respectivement). </li></li></ol> 4. Caractérisation moléculaire de cutine fruit de la tomate par la Croix-polarisation Magic-angle spinning à l'état solide résonance magnétique nucléaire (CPMAS ssNMR) 6 <ol><li> Lieu 4-6 mg de cuticules de tomate pleinement déparaffinées (enclenchements) dans un rotor de 1,6 mm fastMAS zircone en utilisant le fournisseur fourni outil d'emballage. (Soit les cuticules au sol de tomate déparaffinées ou très petits morceaux de cuticules partiellement déparaffinées sont adaptés.) Veiller à ce que l'échantillon est emballé de manière uniforme, mais pas trop serré, dans le rotor. Après avoir mis sur le capuchon supérieur, peindre la moitié du capital avec un marqueur à encre noire pour faciliter les mesures de la vitesse de rotation. </li><li> Régler le calage du spectromètre RMN pour la largeur de ligne minimale spectrale à mi-hauteur d'une calibrer le proton (H 1) et de carbone (13 C) 90 ° largeurs d'impulsion en utilisant un composé standard tel que l'adamantane. </li><li> Utilisation de la glycine ou la glutamine comme composés modèles, d'obtenir l'intensité maximale du signal en optimisant tous les paramètres (Hartmann-Hahn niveaux de puissance correspondant, 1 h - 13 temps de contact C, hétéronucléaire 1 H découplage de résistance) de la polarisation croisée à l'angle magique de filature (CPMAS) expérience. Pour spectres obtenus à une fréquence 1 H à 600 MHz, les conditions recommandées comprennent de 10 kHz ou 15 kHz filature, un délai de 3-sec entre les acquisitions, et RACHIDIENNE protons hétéronucléaire découplage 7 à une intensité de champ magnétique correspond à une fréquence de 185 kHz. </li><li> Insérez le rotor cutine-emballé dans la sonde. Ensuite, placer la sonde dans l'aimant. Augmenter la vitesse de filage jusqu'à 10 kHz progressivement pour vérifier emballage bon échantillon et la stabilité du rotor. Vérifier la stabilité de filage finale du rotor à l'intérieur± 20 Hz. </li><li> Ajustez la mise au point et l'appariement des condensateurs de la sonde de manière itérative pour obtenir une réflexion minimum de puissance à la fois 1 H et 13 C RMN fréquences. Réglez la température expérimentale à 25 ° C (ou température ambiante). </li><li> Commencer l'expérience pré-optimisée CPMAS correspondant à la condition de Hartmann-Hahn correspondant à la fréquence déterminée de 10 kHz filature. </li><li> Acquérir 4096 transitoires, l'état du spectre avec exponentielle (lorentzienne) l'élargissement des raies de 50-100 Hz, et de faire une transformée de Fourier pour générer un spectre RMN de l'intensité du signal par rapport à blindage chimique (ppm). </li><li> Référence du produit chimique C 13 quarts de travail à l'extérieur en utilisant ensemble l'adamantane à 38,4 ppm (-CH 2 - groupe) 8 en tant que norme. </li><li> Augmenter la fréquence du rotor de filature à 15 kHz et répéter la mesure CPMAS (étapes 4.6-4.8) correspondant à la condition de Hartmann-Hahn correspondant à cette fréquence déterminée ci de tourner. </li><li> Repeles expériences CPMAS (étapes 4.1-4.9) avec naturelles (cire) et partiellement déparaffiné échantillons de fruits cuticules. </li></ol> 5. Sondage de la surface de la cuticule de tomates avec la microscopie à force atomique (Digital Instruments Nanoscope IIIa; procédures varient légèrement entre les microscopes) 6 <ol><li> Allumez le microscope à sonde locale (SPM) (Fig. 2) et assurez-vous que le commutateur de mode microscope toggle est définie sur la microscopie à force de contact atomique (AFM) mode. </li><li> Manuellement relever la tête en tournant ses SPM deux boutons avant réglables par l'utilisateur. Détachez le tipholder AFM de la tête SPM en tournant la vis de serrage à l'arrière de la tête. </li><li> Utilisez des pinces pour enlever le cantilever AFM existant de la tipholder, puis soigneusement prendre un nouveau levier silicium nitrure (AFM sonde) de son emballage et installez-le à la place de l'ancienne porte à faux. Utilisation d'un microscope optique pour vérifier que le cantilever nouvellement installé AFM ne se décompose pas. </li><li> Fixez el'échantillon e cuticule de la tomate (une section de la cuticule de tomate partiellement déparaffinée ~ 10 mm x 10 mm) à un disque en acier inoxydable (échantillon rondelle) avec un adhésif double face. Utiliser un microscope optique pour vérifier que le surface de la cuticule reste plane et lisse après le placement de l'échantillon sur la rondelle. </li><li> Placer la rondelle avec l'échantillon cuticule de tomate sur la région magnétique au sommet du scanner SPM. </li><li> Définissez les deux vis de réglage manuel avant de le scanner haute en tournant les boutons; régler la vis de réglage arrière motorisé à environ le même niveau que les deux autres vis à l'avant. Assurez-vous que tous les trois vis sont suffisamment élevés pour éviter de casser la pointe de l'AFM lors de la passation de la tipholder dans la tête de SPM. </li><li> Réinsérez le tipholder dans la tête de SPM et le fixer en serrant la vis de serrage à l'arrière de la tête. </li><li> Après avoir allumé le laser, aligner le spot laser sur le cantilever AFM en utilisant la centrale (y) et de droite (x) boutons de réglage laser sur le dessus de la tête.Surveiller le faisceau laser réfléchi sur un morceau de papier pour positionner le spot laser exactement à la fin du cantilever AFM. </li><li> Ajuster la position du miroir mobile itérative en utilisant les boutons de réglage de photodétecteur pour obtenir un signal maximal (signal SUM), assurant ainsi que le faisceau laser réfléchi est reçu par uniformément les quatre quadrants de la photodétecteur. </li><li> Abaissez la pointe de l'AFM en rétractant les vis manuelles avant d'ajustement et de la vis de réglage arrière motorisé du scanner SPM, contrôler visuellement l'approche de la pointe de l'AFM vers la surface de l'échantillon avec un microscope inversé. Assurez-vous que tous les trois vis sont au même niveau pour éviter les artefacts de l'imagerie d'un échantillon incliné. Apportez la pointe vers l'échantillon, mais pas si proche que les touches de pointe ou des ruptures à travers la surface de l'échantillon. </li><li> À ce stade, la lumière laser réfléchie par le cantilever AFM rebondir sur le miroir mobile vers le photodétecteur. Pour le mode de contact AFM avec un siliconecon nitrure AFM pointe, régler le signal de sortie (Déviation verticale) de tension à -2 V pour une valeur de consigne 0 V et le signal DIFF (vertical / horizontal de différence) à 0 V en ajustant la position du miroir. </li><li> Utilisation du logiciel Nanoscope, cliquez sur l'icône loupe et sélectionnez le profil approprié (Contact Mode AFM). </li><li> Utilisation de la "commandes de numérisation Paramètres" du panneau, réglez la vitesse de balayage et par exemple la taille de numérisation, de 10 microns format de numérisation et 2 vitesse de balayage Hz. </li><li> Laisser la pointe d'AFM pour engager la surface de l'échantillon en cliquant sur l'icône engager pointe. En contrôlant la vis arrière motorisé de la base de SPM, le programme va maintenant diminuer la pointe jusqu'à ce qu'elle s'engage dans la surface de l'échantillon. Le processus de numérisation démarre automatiquement une fois la pointe a engagé avec succès. </li><li> Surveiller le processus de numérisation à l'aide des deux modes d'image et de la portée du logiciel, le réglage des paramètres tels que la consigne, gain intégral, gain proportionnel, la taille de numérisation, vitesse de balayage, des lignes et des échantillons / ligne de manière itérative pour réaliser la plus forteimages à haute résolution. Démarrer le balayage avec une grande plage de l'axe z (échelle de données); ensuite soigneusement réduire la valeur de l'échelle des données d'observer le meilleur contraste de caractéristiques de surface sur l'image. Minimiser l'apparition de zones blanches de l'image numérisée, qui indiquent que la hauteur des éléments de surface est supérieure à la disposition de l'axe z plage. </li><li> Capturer l'image pour enregistrer le fichier de données, puis traiter les données en utilisant des fonctions d'aplatissement pour supprimer les artefacts d'image dus à la dérive de balayage vertical (Z), des arcs d'image, et décalage vertical entre les lignes de balayage, 9 enfin calculer la rugosité moyenne. Après avoir enregistré les données, rétracter la pointe de l'AFM en inversant l'action du moteur vis commandé par ordinateur qui a été utilisé pour l'engager. Traitement de l'image peut être effectuée en mode déconnecté d'analyse d'images et / ou en utilisant un autre ordinateur. </li><li> Utilisez les boutons avant de fond en métal gris de la porte-embout à changer les positions x et y de la zone de numérisation, puis répéter la mesure à cinq loca échantillontions pour vérifier la reproductibilité, le remplacement de la console AFM si la qualité d'image se détériore. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Analyse du déplacement chimique de la CPMAS 13 spectres RMN C (Fig. 3) a identifié les principaux groupes fonctionnels présents dans la cuticule de tomate exhaustive déparaffinées (cutine). Les fragments de carbone clés dans le biopolyester cutine ont été jugés à longue chaîne aliphatiques (0-45 ppm), aliphatiques oxygénés (45-110 ppm), se multiplient-collés et aromates (110-160 ppm), et carbonyles (160-220 ppm). Les groupements oxygénés alkyle (CHO + CH 2 O) jouent un rôle crucial dans l'établissement de connexions covalentes entre les unités monomères de cutine le biopolymère, formant ainsi l'architecture moléculaire de la matrice cutine. Les différences dans les surfaces relatives des pics observés dans la région spectrale entre 45 et 100 ppm suggèrent que la cutine mutant a une proportion relativement importante de cross-link structura formation CHO fractions l par rapport à la de type sauvage cutine; minutieuses des mesures quantitatives en utilisant la polarisation directe (DPMAS) RMN 5 méthodes appuyer cette conclusion (données non présentées). CPMAS 13 C RMN également de la cire présente un pic progressivement dégressif à 31 ppm (fig. 4), indiquant l'élimination séquentielle d'épi-et cires intracuticular à partir du composite cutine-cire, tout en conservant l'architecture chimique principal du biopolymère cutine. Parallèlement l'analyse d'image AFM (Fig. 5) a révélé des irrégularités de surface dues à l'extraction progressive des épi-et cires intracuticular de la cuticule des fruits, ce qui signifie des modifications dans l'organisation de l'assemblée cuticulaire. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig1.jpg"> . Figure 1 extracteur Soxhlet (source image: Wikipedia). "/&gt; Figure 2. Un microscope) sonde à balayage. B) la tête SPM (adapté du manuel de formation fournis par l'AFM Digital Instruments). <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig3.jpg"> Figure 3. 150 MHz CPMAS 13 C RMN de manière exhaustive déparaffinées rouges mûrs cuticules fruits de tomate (enclenchements) de type sauvage (M82) et mutant (CM15) montrent des résonances avec les déplacements chimiques correspondant à des groupes fonctionnels d'un acide gras hydroxy réticulé à base de polyester et aussi quelques fragments se multiplient en servitude. Tous les spectres ont été acquis avec une fréquence de 10 kHz de filage. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig4.jpg"> Figure 4. 150 MHz 13 CCPMAS spectres RMN commerciaux rouges mûrs cuticules fruits de tomate présentent des changements de composition lors de l'enlèvement séquentiel des cires épicuticulaires et intracuticular par la gomme extraction mécanique arabe et un two minutes dip chloroforme, respectivement. Tous les spectres ont été acquis avec une fréquence de 15 kHz de filage. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig5.jpg"> Figure 5. Images AFM et les estimations de rugosité pour la tomate partiellement déparaffinée commerciale cuticules décrit dans la figure 4, après le retrait par étapes des épicuticulaires (à gauche) et intracuticular (à droite) les cires.

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<li>Koch, K., Neinhuis, C., Ensikat, H. J., Barthlott, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self+assembly+of+epicuticular+waxes+on+living+plant+surfaces+imaged+by+atomic+force+microscopy+%28AFM%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exper.+Bot%22%5BJournal%5D)">Self assembly of epicuticular waxes on living plant surfaces imaged by atomic force microscopy (AFM).</a> J. Exper. Bot. 55, 711-718 (2004).</li>
<li>Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM%3A+A+Nanotool+in+Membrane+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">AFM: A Nanotool in Membrane Biology.</a> Biochemistry. 47, 7986-7998 (2008).</li>
<li>Last, J. A., Russell, P., Nealey, P. F., Murphy, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Applications+of+Atomic+Force+Microscopy+to+Vision+Science%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The Applications of Atomic Force Microscopy to Vision Science.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 6083-6094 (2010).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Les protocoles décrits ici permettent pour la caractérisation moléculaire et micro-détaillée d&#39;un matériel végétal insoluble complexe sans la nécessité d&#39;une décomposition chimique destructrice. Pour enquêter sur le mélange de l&#39;biopolyester cutine avec différents lipides (cires) qui contrôlent l&#39;organisation structurelle de l&#39;ensemble cuticulaire, 10 nous avons effectué et contrôlé les procédures pour l&#39;élimination sélective des cires épicuticulaires et intracuticular à partir du mélange hétérogène cuticulaire. Solid-state 13 C RMN a été utilisée pour évaluer l&#39;extraction de composants de cire moléculaires, et microscopie à force atomique a permis d&#39;examiner des changements concomitants dans la rugosité de surface. 6,11 Afin de comparer les capacités de réticulation de deux enclenchements de cultivé de type sauvage et un seul gène des fruits de tomate mutantes, à l&#39;état solide 13 C RMN a aussi été utilisée pour estimer les nombres relatifs de CHO et CH 2 O des groupements chimiques. Un certain nombre de caractéristique de conceptions de ce protocole sont remarquables. Comme les matériaux de cire englobent un large éventail de lipides, le traitement de la cuticule des fruits avec une série de solvants de polarités divergentes est essentielle pour atteindre déparaffinage exhaustive. En outre, le temps de déparaffinage peut varier de 8 heures à 24 heures, selon la nature des échantillons cuticules. Pour extraire les cires épicuticulaires toujours de la cuticule des fruits intacts, il est impératif d&#39;appliquer le revêtement adhésif uniformément à la surface. À l&#39;état solide CPMAS 13 C RMN 12 est une méthode qualitative rapide pour identifier les différents composants structuraux de biopolymères d&#39;origine végétale très hétérogènes et insolubles, tout en préservant leurs caractéristiques physiques autochtones, 13 solution traditionnelle RMN à l&#39;état peut également être utilisée pour caractériser les mélanges de cires extraites. Si l&#39;estimation quantitative des groupes fonctionnels est souhaitée pour les polymères végétaux intacts, 5 de haute fidélité directe de polarisation à l&#39;angle magique de filage (DPMAS) RMN 13 C 5,14 doit être utilisé comme un procédé complémentaire. Une quantification précise des groupes fonctionnels exige une optimisation minutieuse des temps de recyclage, les longueurs d&#39;impulsion d&#39;excitation, et la force de découplage hétéronucléaire 15. Le découplage hétéronucléaire peut être réglé pour une résistance à la 1 champ H allant de 50 kHz à 185 kHz en utilisant le TPPM 16 ou SPINAUX 7 méthodologies. En plus de ces paramètres, la sensibilité des mesures CPMAS dépend de la durée de rotation de verrouillage et de Hartmann-Hahn condition de correspondance 15. Au lieu de CPMAS traditionnels, une rampe d&#39;amplitude CP (RAMP-CP) technique peut être mis en œuvre pour maximiser la croix l&#39;efficacité de polarisation en faisant varier l&#39;amplitude du 1 H linéairement (~ 20-50%) ou tangentiellement tout en conservant l&#39;amplitude de l&#39;intensité de champ en C 13 constante pendant la période de rotation de verrouillage (ou vice versa). 17,18 Mise en oeuvre des mesures CPMAS à un minimum de deux ro différenteteur de filage fréquences est impératif de distinguer des bandes latérales de filage à partir des pics principaux spectrales. Simultanées mesures AFM effectuées en mode contact permettre l&#39;imagerie directe de l&#39;état surface de la cuticule avec des vitesses de numérisation et haute résolution, 19 par exemple lors du retrait séquentiel de constituants cireux. D&#39;exploitation en tapant l&#39;AFM (sans contact) mode peut être utilisé comme une alternative pour la caractérisation des surfaces délicates de &quot;soft&quot; de matières végétales, en évitant de possibles dommages à cause de latéraux (cisaillement) et les forces de raclage de la surface de l&#39;échantillon. 5,20 Dans les deux cas , l&#39;acquisition séquentielle de plusieurs images de la même tache sur la surface sert à identifier tout dommage de surface en raison de &quot;sonde-surface interactions&quot; dans les mesures AFM. 6,21 Pour une reproductibilité optimale, sondes AFM avec des constantes de ressort approprié pour souples surfaces cuticulaires devrait être utilisé, et la constance de la température et l&#39;humidité doivent être maintenues. 6,15,20 </sjusqu&#39;à&gt; considérant que l&#39;état solide RMN offre un profil moléculaire d&#39;ensemble moyenne (en vrac) des biens immobiliers à cuticules de fruits de tomate, de l&#39;imagerie à force atomique fournit une sonde complémentaire non invasive 22,23 pour le suivi de la topographie de la surface de ces assemblages macromoléculaires complexes exquise. 1,2

<table><tbody><tr><td>Acétate de sodium trihydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8625-500G</td><td></td></tr><tr><td>Pectinase</td><td>TCI America</td><td>P0026</td><td>EC 3.2.1.15 ; 10 U ml&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;, conserver au réfrigérateur</td></tr><tr><td>Cellulase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1184-100KU</td><td>EC232.734.4 ; 1,3 unité/mg, conserver au réfrigérateur</td></tr><tr><td>Acide acétique glacial</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9967</td><td></td></tr><tr><td>Azoture de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-100G</td><td>Extrêmement dangereux</td></tr><tr><td>Incubateur-agitateur</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>N° de modèle G24</td><td>N° de fabrication M1036-000G</td></tr><tr><td>Étuve sous vide</td><td>Precision Scientific</td><td>31566</td><td></td></tr><tr><td>Contrôleur Variac</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtre en verre fritté (85 mm/25 mm)</td><td>VWR international</td><td>89056</td><td></td></tr><tr><td>Filtre d'extraction jetable (80 mm/25 mm)</td><td>VWR international</td><td>28320</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>VWR international</td><td>EMD-MX0485-7</td><td></td></tr><tr><td>Laine de verre</td><td>VWR international</td><td>RK20789</td><td></td></tr><tr><td>Feuille d'aluminium</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-100</td><td></td></tr><tr><td>Pincettes</td><td>VWR international</td><td>82027-452</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>VWR international</td><td>EM-CX1050-1</td><td></td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Fisher Scientific</td><td>H302-4</td><td></td></tr><tr><td>Gaz d'azote</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR international</td><td>52858</td><td></td></tr><tr><td>Serviettes en papier</td><td>VWR international</td><td>89002-984</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>VWR international</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>Gomme arabique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9752</td><td></td></tr><tr><td>Rotateur en zircone 1,6 mm fastMAS</td><td>Varian Inc., Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectromètre RMN</td><td>Varian Inc., Agilent</td><td>aimant à alésage standard</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50046</td><td>Composé modèle pour CPMAS</td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49419</td><td>Composé modèle pour CPMAS</td></tr><tr><td>Adamantane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>100277</td><td>Pour étalonner l'impulsion 90&amp;#x00B0; en RMN</td></tr><tr><td>Microscope à sonde combinée multimode (Nanoscope IIIA)</td><td>Digital Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel Nanoscope</td><td>Digital Instruments</td><td></td><td>Version 5.30r3sr3 (2005)</td></tr><tr><td>Pointe de microscopie à force atomique (pointe en nitrure de silicium non conductrice)</td><td>Veeco Instruments, Inc.</td><td>Modèle NP-20</td><td></td></tr><tr><td>Microscope optique</td><td>Digital Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispositif magnétique (puck)</td><td>Digital Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adhésif double face</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Éplucheur de fruits</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Funnel de B&amp;#252;chner</td><td>VWR international</td><td>89038</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement et étude biophysique des cuticules de fruits

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

La cuticule, une couche hydrophobe de protection sur les parties aériennes de plantes terrestres, les fonctions comme une barrière défensive polyvalent à divers stress biotiques et abiotiques et elle réglemente également le débit d&#39;eau de l&#39;environnement extérieur. 1 A biopolyester (cutine) et à longue chaîne d&#39;acides gras ( cires) forment le cadre principal de la structure de la cuticule; l&#39;intégrité fonctionnelle de la couche cuticulaire dépend le monde extérieur »épicuticulaire« couche ainsi que le mélange constitué du biopolymère cutine et des cires intracuticular des 2 des présentes, nous décrivons un protocole complet. pour extraire les cires exhaustive de tomate du commerce (Solanum lycopersicum) de fruits ou de cuticules pour éliminer les cires et épicuticulaires intracuticular séquentiellement et de manière sélective à partir du composite cuticule. La méthode de Jetter et Schäffer (2001) a été adapté pour l&#39;extraction progressive des cires épicuticulaires et intracuticular de la cuticule des fruits. 3,4 Pour surveiller l&#39;processus d&#39;élimination de la cire séquentielle, à l&#39;état solide polarisation croisée à l&#39;angle magique de filage (CPMAS) 13 C RMN a été utilisée en parallèle avec la microscopie à force atomique (AFM), en fournissant à l&#39;échelle moléculaire profils structurels des matériaux en vrac, complétées par des informations sur la topographie et de micro-rugosité des surfaces cuticulaires. Pour évaluer les capacités de réticulation de cuticules de déparaffinées cultivées de type sauvage et un seul gène tomates mutantes, MAS RMN du 13 C a été utilisé pour comparer les proportions relatives d&#39;hydrocarbures aliphatiques oxygéné (CHO et CH 2 O) des groupements chimiques. Déparaffinage exhaustive par extraction Soxhlet par étapes avec un panel de solvants de polarité variable fournit un moyen efficace pour isoler des fragments de cire sur la base des caractéristiques hydrophobes de leur aliphatiques et constituants aromatiques, tout en préservant la structure chimique de la cutine biopolyester. L&#39;extraction mécanique de cires épicuticulaires and Selel&#39;élimination des cires ctive intracuticular, lors des contrôles par des méthodes physiques complémentaires, constitue un moyen sans précédent pour enquêter sur l&#39;ensemble de la cuticule: cette approche révèle l&#39;organisation supramoléculaire et l&#39;intégration structurelle des différents types de cires, de l&#39;architecture de la matrice cutine la cire, et le produit chimique Composition de chaque constituant. En outre, à l&#39;état solide 13 C RMN révèle des différences dans les nombres relatifs de CHO et CH 2 O des groupements chimiques de type sauvage et mutant fruits rouges tomate bien mûre. Les techniques de RMN à offrir des outils exceptionnels empreinte la structure moléculaire de matériaux qui sont insolubles cuticulaires, amorphe, et chimiquement hétérogène. Comme une technique d&#39;imagerie non invasive surface sélective, l&#39;AFM fournit un moyen direct et efficace pour sonder l&#39;organisation structurelle de l&#39;ensemble cuticulaire sur l&#39;échelle de longueur nm-um.

Organes de la plante aériennes sont protégés par la cuticule, un supramoléculaire biopolyester la cire de montage. Nous présentons les protocoles à suivre l&#39;élimination sélective des épi-et cires intracuticular de cuticules de fruits de tomate sur des échelles moléculaires et micro par RMN du solide et la microscopie à force atomique, respectivement, et d&#39;évaluer la capacité de réticulation de génie biopolyesters cuticulaires.

Isolement et étude biophysique des cuticules de fruits

La cuticule, une couche protectrice hydrophobe située sur les parties aériennes des plantes terrestres, agit comme une barrière défensive polyvalente contre divers agents biotiques et...

Cette expérience utilise des techniques biophysiques pour évaluer la capacité de réticulation du polymère cuticulaire du tomate, ainsi que pour surveiller l'élimination sélective des cires épi- et intracuticulaires des cuticules de fruits. L'isolement de la cuticule à partir du fruit entier est réalisé par un traitement enzymatique des peaux de tomate et des parois cellulaires associées. Dans une deuxième étape, une extraction au tétrachlorure de carbone est utilisée pour déparaffiner complètement la cuticule du fruit, afin d'obtenir la caractérisation moléculaire du cutine isolé.Le biopolyester est analysé par résonance magnétique nucléaire à l'état solide. L'analyse spectrale par RMN à l'état solide révèle que, dans la cutine provenant des cuticules de fruits de tomate de type sauvage et génétiquement modifiés, il existe des différences dans les proportions relatives des motifs aliphatiques oxygénés capables de former des liaisons croisées. Alternativement, le fruit entier est enduit et pelé à l'aide de gomme arabique afin d'éliminer les cires épicuticulaires, puis plongé dans du chloroforme pour extraire les cires intracuticulaires de la cuticule du fruit.Ensuite, les cuticules partiellement déparaffinées, isolées par le même traitement enzymatique que les peaux de tomate, sont examinées par résonance magnétique nucléaire à l'état solide et par microscopie à force atomique. En fin de compte, la suppression séquentielle des cires épicuticulaires et intracuticulaires apparaît par l'observation d'un pic de cire progressivement atténué dans les spectres RMN et par des modifications du profil de surface de la cuticule du fruit observées grâce à l'imagerie simultanée par MFA. Les organes aériens des plantes sont protégés par un assemblage de cire en polyester biologique appelé cuticule. Nous présenterons des protocoles permettant d'évaluer la suppression sélective des cires internes et externes des cuticules de fruit de tomate à l'aide de la résonance magnétique nucléaire à l'état solide et de la microscopie à force atomique.Ces méthodes peuvent également être utilisées pour évaluer la capacité de réticulation de matériaux cuticulaires conçus. La démonstration des procédures sera assurée par trois membres du groupe Stark : le Dr Ishish Chatterjee, la candidate au doctorat Shantani Sarkar et l'ancienne élève de lycée Julia Tik. Un autre démonstrateur est le Dr Olivia Nisau, chercheuse postdoctorale dans le laboratoire de notre collègue en génie chimique, le Dr Alexander S. Pour commencer l'isolement enzymatique de la peau de tomate, placez trois fruits commerciaux ou cultivés dans un bol, retirez la peau en larges morceaux et jetez les tissus internes du péricarpe.Ensuite, lavez les peaux de tomate avec de l'eau déionisée et conservez-les sous l'eau dans un bécher, en immergeant complètement la peau de tomate pelée dans un cocktail enzymatique préparé comme décrit dans le protocole écrit. Incubez à 31 degrés Celsius pendant 24 heures avec agitation continue. Récupérez les peaux de tomate à l'aide d'un entonnoir Büchner ou d'une passoire de cuisine et rincez-les avec de l'eau déionisée.Après avoir placé les peaux dans une étuve sous vide à température ambiante pendant une heure, les peaux séchées peuvent être conservées dans un flacon étiqueté et bouché. Pour les procédures ultérieures de déparaffinage, remplir un thimble en verre centré ou jetable environ à moitié avec l'échantillon de cuticule de tomate, puis utiliser une pince pour le placer soigneusement à la base de la colonne d'extraction destinée à l'extraction solide. Continuer à mettre en place l'appareil d'extraction en utilisant du méthanol comme solvant, tel que décrit dans le protocole écrit.Surveillez le processus pendant une heure, en ajustant la tension du variac de manière à ce que le réservoir accumule environ une goutte par seconde et que le siphonnage se produise à l'intérieur des chaussettes de l'appareil. Lorsque le creuset est plein, après une extraction de 12 heures, laissez l'appareil refroidir, puis abaissez le chauffe-ballon et retirez l'extracteur et le réservoir comme une seule unité afin d'éliminer le solvant après l'extraction. Inclinez la colonne pour permettre le siphonnage dans le flacon situé en dessous.Utilisez une pince pour soulever le creuset juste en dessous du col de la colonne d'extraction. Éliminez le solvant excédentaire et placez le creuset sur une surface propre. Débranchez le ballon et versez les déchets dans un récipient pour solvant étiqueté.Répétez la procédure d'extraction avec des solvants successifs de polarité progressivement décroissante, tels que le chloroforme et le taxane, pendant 12 heures chacun. Une fois l'échantillon de cuticule de tomate sec, mesurez-en la masse et conservez-le à température ambiante dans un flacon à vis fermé avec du parafilm. Pour préparer l'échantillon pour la RMN, placez quatre à six milligrammes de cuticules de tomate entièrement déparaffinées, appelées cutine, dans un rotor en zircone de 1,6 millimètre pour MAS rapide, en utilisant l'outil de chargement fourni par le fabricant.Après avoir installé le bouchon supérieur, peignez la moitié du bouchon avec un feutre à encre noire afin de permettre la mesure de la vitesse de rotation. La configuration initiale de l'expérience de RMN à l'état solide est un processus techniquement exigeant qui s'effectue sous la supervision du personnel expérimenté. Commencez par régler l'homogénéité du champ magnétique et optimiser les paramètres expérimentaux à l'aide d'un composé modèle, comme décrit dans le protocole écrit. Insérez le rotor contenant l'échantillon et bien tassé dans la sonde, puis placez la sonde dans l'aimant.Augmentez progressivement la vitesse de rotation jusqu'à 10 kilohertz afin de vérifier un bon tassement de l'échantillon et la capacité du rotor à tourner de manière stable avec une variation inférieure à 20 hertz. Ajustez itérativement les condensateurs de réglage et d'adaptation d'impédance de la sonde pour obtenir une réflexion de puissance minimale aux fréquences RMN du proton et du carbone 13. Réglez la température expérimentale à 25 degrés Celsius.Lancez l'expérience CPMA préalablement optimisée correspondant à la condition d'ajustement proton-carbone de Hartman-Hahn déterminée à une fréquence de rotation de 10 kilohertz. Après avoir acquis 4 096 transitoires, conditionnez le spectre avec un élargissement exponentiel de la ligne de 50 à 100 hertz et effectuez une transformation de Fourier afin de générer un spectre RMN de l'intensité du signal en fonction du déplacement chimique, exprimé en parties par million. Référencez les déplacements chimiques du carbone 13 comme décrit dans le texte.Augmentez la fréquence de rotation du rotor à 15 kilohertz et répétez la mesure C-P-M-A-S correspondant à la condition d'ajustement Hartman Han déterminée lors de l'analyse de déplacement chimique en fonction de la fréquence de rotation pour le carbone C-P-M-A-S. Les spectres de RMN du carbone 13 ont identifié les principaux groupes fonctionnels présents dans la cuticule de tomate exhaustivement cireuse à l'eau distillée : les PHA à longue chaîne, les PHA oxygénés, les liaisons multiples et les composés aromatiques, ainsi que les rendements en carbone. Les almo oxygénés jouent un rôle crucial dans l'établissement de liaisons covalentes entre les unités monomériques du biopolymère cutine, formant ainsi l'architecture moléculaire de la matrice de cutine.Des différences dans les aires relatives des pics observées dans la région spectrale comprise entre 45 et 100 parties par million suggèrent que la cutine mutante possède une proportion relativement élevée de motifs structuraux CHO formant des réticulations par rapport à la cutine sauvage. Pour commencer l'isolement sélectif des cires épicuticulaires et intracuticulaires.Lavez une deuxième série de tomates entières à l’eau distillée. Séchez-les avec des serviettes en papier et des lingettes Kim, puis placez-les, le pédoncule vers le bas, sur un morceau de papier d’aluminium. Appliquez sur les tomates entières, du haut vers le bas, une solution aqueuse de gomme arabique à 120 %.Laisser sécher la gomme arabique sur la peau du fruit pendant une heure, de manière à former un film mince. Retirer ce film à l’aide de pinces, mais éviter de percer la peau de la tomate. Un traitement supplémentaire du film, tel que décrit dans le texte, permet d’obtenir la cire cuticulaire épique.Les tomates resteront physiquement intactes. Plongez-les dans du chloroforme pendant deux minutes. À température ambiante, la cire intracuticulaire peut être récupérée après évaporation du solvant ; épluchez les tomates puis traitez-les enzymatiquement avec de la cellulase et de la pectinase en tampon acétate de sodium pour éliminer respectivement la cellulose et la pectine.Une extraction par sel peut ensuite être effectuée comme décrit précédemment afin de déparaffiner complètement les tomates. Les expériences C-P-M-A-S peuvent être répétées avec des échantillons de cuticule de fruits naturels et partiellement déparaffinés comme décrit dans le texte. La mise en place du microscope à force atomique est un processus complexe et est mieux réalisée sous la supervision initiale d'un personnel technique expérimenté. Une MF commence par allumer le microscope à sonde balayante, abrégé en SPM, et s'assure que le commutateur de mode du microscope est réglé sur le mode de microscopie à force atomique en contact.Ensuite, soulevez manuellement la tête du microscope à effet tunnel (SPM) en tournant ses deux boutons frontaux réglables par l'utilisateur. Détachez un porte-sonde à modulation de fréquence (FM) de la tête du SPM en desserrant la vis de serrage située à l'arrière de la tête. Utilisez une pince pour retirer le levier à modulation de fréquence existant de son support.Ensuite, saisissez délicatement un nouveau levier en porte-à-faux avec une pointe en nitrure de silicium dans son emballage et installez-le en remplacement de l'ancien levier en porte-à-faux. Utilisez un microscope optique pour vérifier que le nouveau levier en porte-à-faux en mode FM n'est pas cassé. Fixez l'échantillon de cuticule de tomate sur un porte-échantillon à l'aide d'un ruban adhésif double face.Utilisez un microscope optique pour vérifier que l'échantillon de cuticule reste plat et lisse. Après avoir placé l'échantillon sur le plateau, positionnez l'échantillon de cuticule de tomate fixé au plateau sur la zone magnétique située en haut du scanner SPM. En tournant les molettes, réglez les deux vis manuelles avant du scanner suffisamment haut pour éviter de briser la pointe AFM.Lorsque le porte-pointe est placé dans la tête du microscope à effet tunnel (SPM), réglez la vis arrière motorisée à peu près au même niveau que les deux autres vis frontales. Réinsérez le porte-pointe dans la tête du SPM et fixez-le en serrant la vis de serrage arrière de la tête. Après avoir allumé le laser, alignez le spot laser sur le levier en mode de résonance (FM) à l’aide des boutons de réglage central et droit situés en haut de la tête.Surveillez le faisceau laser réfléchi sur un morceau de papier afin de positionner précisément le point laser à l'extrémité d'un levier en mode FM. Ajustez la position du point laser pour obtenir un signal somme maximal. Régulez la position du point laser réfléchi sur le photodétecteur en ajustant horizontalement et verticalement la position du miroir mobile, de manière à ce que la lumière incidente soit reçue de façon uniforme par les quatre quadrants.Le détecteur abaisse une pointe FM en rétractant les vis frontales réglées par l'utilisateur et la vis arrière motorisée du balayeur SPM. Surveiller visuellement l'approche de la pointe FM vers la surface de l'échantillon à l'aide d'un microscope inversé. S'assurer que les trois vis se trouvent au même niveau.Pour éviter les artefacts liés à l'imagerie d'un échantillon incliné, approchez la pointe de l'échantillon sans toutefois l'approcher suffisamment pour qu'elle touche ou perce la surface de l'échantillon. La lumière laser réfléchie par le levier de la microscopie à force atomique (AFM) sera renvoyée par un miroir mobile vers un détecteur photosensible en mode contact AFM, en utilisant une sonde AFM en nitrure de silicium. Réglez la tension du signal de sortie à moins deux volts pour un point de consigne de zéro volt, et le signal différentiel à zéro volt, en ajustant la position du miroir.À l'aide du logiciel nano scope, cliquez sur l'icône du microscope et sélectionnez le profil approprié. Dans le panneau des paramètres de contrôle du balayage, réglez la vitesse de balayage et la taille du balayage.Laissez la pointe AFM entrer en contact avec la surface de l'échantillon en cliquant sur l'icône d'engagement de la pointe. En contrôlant la vis arrière motorisée de la base du SPM, le programme abaissera désormais la pointe jusqu'à ce qu'elle entre en contact avec la surface de l'échantillon. Le processus de balayage démarrera automatiquement une fois l'engagement de la pointe réussi.Surveillez le processus de balayage à l’aide des modes image et scope du logiciel, et ajustez itérativement les paramètres pour obtenir des images de la résolution la plus élevée possible, comme décrit dans le protocole écrit. Par exemple, commencez le balayage avec une valeur élevée de l’échelle de données sur l’axe Z. Réduisez ensuite soigneusement la valeur de l’échelle de données Z afin d’obtenir le meilleur contraste des caractéristiques de surface sur l’image.Capturez l'image pour enregistrer le fichier de données. Traitez les données à l'aide de fonctions d'aplanissement afin d'éliminer les artefacts d'image dus à la dérive verticale du scanner, aux courbures d'image et au décalage vertical entre les lignes de balayage. Enfin, calculez la rugosité moyenne du carbone.Les spectres de RMN du 13 C-P-M-A-S-N-M-R ont montré une diminution progressive du pic de la cire à 31 parties par million, indiquant l'élimination séquentielle des cires épicuticulaires et intracuticulaires du composite cuté et cire, tout en préservant parallèlement l'architecture chimique principale du biopolymère cutine. Une analyse d'image en microscopie à force atomique (FM) a révélé des irrégularités de surface dues à l'extraction progressive des cires épicuticulaires et intracuticulaires à partir de la cuticule du fruit, signifiant des altérations dans l'organisation de l'assemblage cuticulaire. Une fois maîtrisée, cette technique permet d'effectuer en deux heures l'élimination séquentielle des cires épicuticulaires et intracuticulaires des cuticules de fruit de tomate.Lorsqu'on effectue une extraction par solvant pour un dégraissage exhaustif des cuticules de fruits, il est important d'utiliser un panel de solvants de polarité variable après avoir utilisé le nœud de contact. Un protocole FM est illustré ici. D'autres expériences FM peuvent être utilisées pour mesurer l'élasticité de surface de la cuticule.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler de manière systématique les composants du composite cireux de cutine et réaliser une caractérisation moléculaire et un examen rapide de la surface des matériaux de cuticule à l’aide respectivement de la RM à l’état solide et de la MF. Les techniques illustrées dans cette vidéo permettent aux chercheurs en biologie végétale de déterminer la composition moléculaire et l’architecture supramoléculaire des tissus végétaux naturels et conçus.

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Isoler follicule pileux cellules souches et kératinocytes épidermiques de la peau Dorsale Souris

L'objectif de ce protocole est d'isoler les kératinocytes épidermiques de la peau dorsale de souris adultes pour une variété d'applications en aval telles que la biologie moléculaire, la biochimie, le tri cellulaire activé par fluorescence et les utilisations in vitro primaires (p. ex., clonogènes kératinocytes).

Isolement des kératinocytes épidermiques de souris et de leur culture clonogène in vitro

L’étude de la cicatrisation des plaies associée aux lésions musculo-squelettiques nécessite souvent l’évaluation des interactions in vitro entre les cellules de Schwann (SC), les kératinocytes et les fibroblastes. Ce protocole décrit l’isolement, la culture et la caractérisation de ces cellules primaires à partir du prépuce humain.

Isolement, culture et caractérisation des cellules de Schwann primaires, des kératinocytes et des fibroblastes du prépuce humain

Un protocole rapide et efficace est présenté pour l’isolement des gouttelettes lipidiques plastoglobules associées à divers organismes photosynthétiques. La préparation réussie de plastoglobules isolés est une première étape cruciale qui précède les investigations moléculaires détaillées telles que les analyses protéomiques et lipidomiques.

Isolement de gouttelettes lipidiques de plastoglobule à partir de tissus foliaires végétaux et de cyanobactéries

Un protocole est présenté pour l’isolement et l’enrichissement pratiques et à haut débit des trichomes glandulaires et sessiles de Cannabis sativa. Le protocole est basé sur une extraction sèche et non tampon des trichomes en utilisant uniquement de l’azote liquide, de la glace sèche et des tamis en nylon et convient à l’extraction d’ARN et à l’analyse transcriptomique.

Isolement non aqueux et enrichissement des trichomes glandulaires et sessiles de Cannabis sativa

Le présent article vise à fournir des protocoles détaillés et adéquats pour l’isolement des champignons endophytes associés aux plantes, la conservation à long terme des isolats, la caractérisation morphologique et l’extraction totale de l’ADN pour l’identification moléculaire ultérieure et les analyses métagénomiques.

Isolement, caractérisation et extraction totale de l’ADN pour identifier les champignons endophytes chez les plantes mycohétérotrophes

Découvrez l'isolement enzymatique des cuticules de tomate et l'analyse biophysique par RMN à l'état solide et microscopie à force atomique. Ces méthodes permettent d'évaluer la réticulation des biopolyesters cuticulaires et le retrait sélectif des cires.

Isolement et étude biophysique des cuticules de fruits

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