Mise à jour de levure-système à deux hybrides pour identifier les protéines qui interagissent avec le facteur de croissance progranuline
17 janvier 2012
Nous avons modifié la levure classique double-hybride en dépistage, un outil efficace dans l'identification génétique d'interactions protéiques. Cette modification raccourcit nettement le processus, réduit la charge de travail, et surtout, réduit le nombre de faux positifs. En outre, cette approche est reproductible et fiable.
Ce système MY deux H améliore le protocole classique de double hybride chez la levure en réduisant nettement le nombre de faux positifs. Préparez tout d'abord une transformation à petite échelle du plasmide appât dans la levure. Après avoir validé la construction appât à l’aide d’un écran avec un inhibiteur compétitif, tamisez la banque d’ADNc sur des plaques moins quatre.
Procédez à la vérification des clones positifs à l'aide de tests XGL et de dosages d'interaction. Ensuite, identifiez les protéines interagissant de façon potentielle par séquençage de l'ADN et analyse bioinformatique. En définitive, ce système modifié de double hybride chez la levure augmente considérablement l'efficacité et le taux de réussite du processus de criblage.
Le système classique de double hybride chez la levure est notoire pour générer des faux positifs. Ce message présente la procédure de criblage modifiée, considérablement améliorée en faveur des queues à deux points. Commençons donc.
Inoculer 50 millilitres de YPD avec une culture de 5 millilitres de MAV 2 0 3 incubée toute la nuit. Faire croître pendant deux à quatre heures à 30 degrés Celsius. Ensuite, récolter les levures par centrifugation, après un lavage, resuspendre les culots dans 2 millilitres de solution un et incuber à température ambiante pendant 10 minutes.
Préparez le mélange d'ADN pour la transformation. Ajoutez 100 microlitres de cellules de levure et mélangez soigneusement. Ensuite, ajoutez 700 microlitres de la solution deux et mélangez soigneusement.
Incuber d'abord à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis appliquer un choc thermique. Récolter maintenant les cellules par centrifugation et resuspendre le culot dans 200 microlitres d'eau distillée stérilisée à l'autoclave. Déposer des dilutions sérielles de la suspension sur des boîtes de milieu SD LU et incuber à 30 degrés Celsius pendant deux à trois jours. Cette étape confirme que le plasmide appât active la transcription et que cette activation spontanée peut être neutralisée par des inhibiteurs tels que le trois, un inhibiteur compétitif du produit du gène hiss trois.
Commencez par transformer le plasmide appât dans la levure MAV 2 0 3. Étalez la réaction sur des boîtes de Petri SD LU et incubez à 30 degrés Celsius. Afin de sélectionner les colonies pour une auto-activation induite par le trois at, utilisez des bâtonnets stériles pour transférer les colonies de chaque transformation sur des boîtes de Petri SD LU hiss contenant des concentrations croissantes de trois at, puis incubez les boîtes à 30 degrés Celsius.
Éliminer les souches d'appât qui poussent sur les boîtes contenant 100 millimolaire de trois at comme étant inappropriées pour une utilisation dans le criblage double hybride pour re. Pour les appâts restants, sélectionner la concentration la plus faible de trois at qui inhibe la croissance cellulaire afin de l'utiliser dans le criblage de la banque ADNc, suspendre plusieurs colonies isolées de levure contenant le plasmide d'appât dans 100 microlitres d'eau distillée stérilisée à l'autoclave. Les répartir sur deux boîtes SD LU de 10 centimètres.
Incuber les deux plaques à 30 degrés Celsius. Racler et suspendre complètement les cellules dans 10 millilitres. Autoclaver de l'eau distillée et ensemencer 500 millilitres de milieu YPD liquide.
Vérifiez la densité cellulaire par spectre, photométrie et culture à 30 degrés Celsius. Passez à la récolte des cellules par centrifugation. Lavez une fois dans 100 millilitres d'eau distillée stérilisée à l'autoclave et une fois dans 50 millilitres de solution un.
Ensuite, resuspendre le culot dans 2,5 millilitres de solution un. Ajouter maintenant de l'ADN de sperme de saumon dénaturé et fragmenté, ainsi que la bibliothèque d'ADNc en mélangeant doucement à l'aide d'une pipette. Puis ajouter 15 millilitres de solution deux contenant 40 % de polyéthylène glycol.
Mélanger délicatement et répartir des aliquotes de 700 microlitres dans 25 tubes stérilisés au autoclave de 1,5 millilitre. Incuber 30 minutes dans un bain-marie à 30 degrés Celsius, suivi d'un choc thermique de 15 minutes dans un bain-marie à 42 degrés Celsius.
Récupérez les cellules par centrifugation, puis resuspendez délicatement chaque culot dans 400 microlitres d'eau distillée stérilisée. Étalez chaque mélange de transformation sur deux plaques de sélection et incubez de cinq à dix jours à 30 degrés Celsius comme témoin pour estimer l'efficacité de transformation de la réaction. Dilutions sérielles d'une réaction.
Après une incubation de trois jours à 30 degrés Celsius, déterminez le nombre total de colonies. Transférez les colonies sur une boîte de milieu YPD et incubez toute la nuit à 30 degrés Celsius. Ensuite, placez une membrane en nitrocellulose arrondie directement sur la boîte de milieu YPD, en veillant à ne pas laisser de bulles d'air.
Après une minute, vérifiez que toutes les colonies ont été transférées sur les membranes. Placez la membrane, côté colonies vers le haut, dans un récipient en aluminium et posez-le à la surface de l'azote liquide pendant 20 secondes. Ensuite, immergez-la dans l'azote liquide pendant quelques minutes.
Retirez maintenant la membrane pour la décongeler. Pendant ce temps, préparez une boîte de Pétri avec une couche fraîche de solution XCA sur papier Aman. Plongez ensuite délicatement la membrane décongelée et incubez à 37 degrés Celsius.
Jusqu'à l'apparition de colonies bleues. La réaction des proies, des clones et du vecteur d'appât dans la levure peut éliminer davantage les faux positifs. Tout d'abord, isolez l'ADN plasmidique des souches de levure potentiellement porteuses de protéines interagissant entre elles.
Transformer l'ADN dans des cellules compétentes de E. coli DH5α et sélectionner par croissance sur des géloses LB contenant de l'ampicilline. Analyser les transformants par analyse aux enzymes de restriction. Co-transformer maintenant les plasmides « prey » et « bait » dans la levure MAV203, étaler sur des géloses SC-LU-trip, puis incuber de deux à trois jours à 30 degrés Celsius.
Prélevez trois colonies différentes pour effectuer la séquence de test xal, l'ADN plasmidique des clones positifs et identifiez les gènes à l'aide de la bioinformatique. Dans cette expérience, le facteur de croissance Rine progranuline a été utilisé comme appât pour cribler une bibliothèque d'ADNc cérébral, permettant d'obtenir 54 clones positifs.
Des candidats ont été isolés parmi 2,5 millions. Des transformants ont été criblés avec l'appât pro-granuline. Des analyses supplémentaires par le test ex crâne ont révélé 23 candidats positifs pour l'appât pro-granuline.
Curieusement, des analyses bioinformatiques des données de séquençage ont identifié TNF R deux. En effet. De plus, des expériences fonctionnelles ont confirmé la progranuline comme un nouveau ligand des récepteurs TT NF. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer cet écran hybride modifié avec votre base d'intérêt.
N'oubliez pas de travailler avec des gants car certaines régions utilisées sont dangereuses. Bonne chance dans vos expériences.
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Aperçu
Cette étude présente un système de double hybride modifié chez la levure qui améliore le protocole classique d'identification des interactions protéiques. La nouvelle approche réduit significativement les faux positifs et améliore la fiabilité des résultats.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Interactions protéiques
- Écran génétique
- Système de double hybride chez la levure
Contexte
- Le système de double hybride chez la levure est une méthode largement utilisée pour étudier les interactions entre protéines.
- Les méthodes conventionnelles produisent souvent un grand nombre de faux positifs.
- Améliorer la précision de ces criblages est essentiel pour obtenir des données biologiques fiables.
- Cette étude vise à résoudre ces problèmes par des modifications méthodologiques.
Objectif de l'étude
- Modifier le protocole du système deux-hybrides chez la levure afin d'améliorer la précision.
- Réduire la charge de travail et le temps nécessaires aux criblages.
- Fournir une méthode reproductible et fiable pour identifier les interactions entre protéines.
Méthodes utilisées
- Préparation d'une transformation à petite échelle du plasmide appât dans la levure.
- Validation de la construction appât à l'aide d'un criblage avec un inhibiteur compétitif.
- Criblage de la banque d'ADNc sur des plaques moins quatre.
- Vérification des clones positifs par des tests XGL et des dosages enzymatiques.
Résultats principaux
- Le système modifié réduit considérablement le nombre de faux positifs.
- Une efficacité accrue et un taux de réussite plus élevé dans le processus de criblage ont été observés.
- Des protéines interagissant potentiellement ont été identifiées par séquençage de l'ADN.
- L'analyse par bioinformatique a confirmé les résultats.
Conclusions
- Le système modifié du double hybride chez la levure est un outil fiable pour l'étude des interactions protéiques.
- Cette approche améliore l'efficacité globale des criblages génétiques.
- Les applications futures pourraient bénéficier de taux de faux positifs réduits.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La cartographie des interactions protéiques au stade de la découverte est essentielle pour la validation des cibles et la réduction des risques mécanistiques en recherche et développement biopharmaceutique&D. Le système modifié de double hybride chez la levure (MY2H) permet une identification plus fiable des partenaires protéiques, réduisant les faux positifs et accélérant l'obtention de résultats exploitables. Cette approche renforce la confiance prédictive aux points critiques que sont la sélection de la cible et l'identification précoce des candidats prometteurs.
Applications stratégiques en R&D biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet l'interrogation systématique des interactions entre protéines pour la validation fonctionnelle des cibles.
- Réduit l'ambiguïté mécanistique en minimisant les faux positifs lors des criblages d'interactions.
- Permet un triage sûr des cibles fondé sur des partenaires de liaison validés.
Développement de tests et de criblages
- Prépare des constructions d'appât validées pour des protocoles de criblage en aval.
- Améliore la reproductibilité et la fiabilité des tests grâce à des contrôles par inhibiteurs compétitifs.
- Facilite le criblage à grande échelle de bibliothèques d'ADN complémentaire pour la découverte d'interactions.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les résultats d'interactions protéiques avec des voies pertinentes pour la maladie lorsque la sélection de l'appât est associée à une maladie.
- Permet une continuité entre la découverte et la validation préclinique en identifiant des partenaires protéiques actionnables.
- Appuie les décisions d'avancement ajustées au risque sur la base de données solides concernant les interactions.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Le système MY2H s'inscrit à l'interface entre la découverte précoce et l'identification de composés candidats, offrant une plateforme reproductible pour cartographier les interactions protéiques avant les études fonctionnelles en aval.
- Découverte en biologie : Facilite la vérification d'hypothèses et la clarification des voies biologiques en identifiant les intermédiaires directs des facteurs de croissance ou des protéines pertinentes dans les maladies.
- Criblage : Fournit des résultats validés avec un faible taux de faux positifs, adaptés à des analyses biochimiques ou cellulaires ultérieures.
- Analyse : Propose des décomptes quantitatifs de colonies et des hits confirmés par séquençage pour des analyses comparatives.
- Recherche translationnelle : Relie les données d'interaction à des modèles de maladies lorsque les protéines cibles sont impliquées dans des pathologies.
- Réutilisation en entreprise : Offre un flux de travail standardisé et reproductible, adaptable à diverses cibles protéiques au sein de portefeuilles variés.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'incertitude mécanistique dans la validation des cibles.
- Valeur opérationnelle : Améliore la standardisation, la reproductibilité et le débit des criblages d'interactions protéiques.
- Valeur stratégique : Permet de prendre des décisions plus éclairées quant au passage ou non à l'étape suivante et une gestion efficiente du portefeuille en capital.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation et l'avancement, ajustés au risque, des cibles validées.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en génétique des levures, en clonage moléculaire et en analyse de bioinformatique.
- Suppose l'accès à un équipement de transformation, à des milieux sélectifs et à une infrastructure de séquençage.
- Exige une standardisation interéquipes pour la validation de l'appât et les contrôles d'inhibiteurs.
- Adaptable à diverses protéines appâts, mais peut nécessiter une optimisation selon les constructions spécifiques.
- La réduction des faux positifs dépend d'étapes rigoureuses de contrôle et de validation.
