L'isolement des cellules de souris poumon dendritiques

L'objectif général de cette procédure est d'obtenir une préparation hautement purifiée de cellules dendritiques pulmonaires de souris. Cela est réalisé en premier lieu en prélevant le tissu pulmonaire sans inclure les ganglions lymphatiques drainants. Ensuite, une suspension monocellulaire est obtenue par digestion à la collagénase.

L'étape suivante consiste à enrichir les cellules positives pour CD11c à l'aide d'un système d'isolement magnétique des cellules. Ensuite, le sous-ensemble de cellules dendritiques conventionnelles est isolé par tri cellulaire en cytométrie en flux. Enfin, les cellules dendritiques conventionnelles isolées à partir du tissu pulmonaire de souris peuvent être analysées par cytométrie en flux et microscopie optique.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'immunologie, comme quel est le rôle du sous-ensemble de cellules dendritiques conventionnelles dans l'immunité innée et les maladies infectieuses au niveau du tractus respiratoire ? La procédure sera démontrée par Issa Lancelin, chercheur associé de mon laboratoire, ainsi que par moi-même. Après l'euthanasie de la souris, commencez par inciser puis retirer délicatement la peau externe du péritoine afin d'exposer la cavité thoracique.

Procédez à l'ouverture du diaphragme en coupant la cage thoracique afin d'exposer le cœur et les poumons. Une fois le cœur et les poumons exposés, la procédure de perfusion peut commencer. Remplissez une seringue de cinq millilitres avec E-D-T-A-H-B-S-S et fixez une aiguille de calibre 25 à la seringue.

Insérez ensuite l'aiguille dans le ventricule droit afin d'éviter toute fuite pendant l'injection. Utilisez une pince pour maintenir le tissu myocardique autour de l'aiguille. Ensuite, injectez doucement la solution tout en maintenant une pression constante.

Une perfusion précise entraînera un gonflement pulmonaire et un changement de couleur vers le rose ou le blanc. Pour éviter toute contamination potentielle, retirez et jetez les ganglions lymphatiques drainants. Ensuite, prélèvez le tissu pulmonaire et transférez l'organe excisé dans une boîte de Pétri placée sur de la glace. Remplissez un tube Gentle Max C avec cinq millilitres de solution de digestion au collagénase pour poumon, puis hachez le poumon en petits morceaux.

À l’aide d’une lame de rasoir, transférer le tissu dans le tube en utilisant une dissociation maximale douce. Pour obtenir une suspension de cellules uniques, sélectionner le programme M lung zero one. Incuber ensuite l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, en agitant le tube toutes les cinq minutes pour resuspendre les fragments de tissu F, puis poursuivre avec le programme M lung zero two.

Transférez maintenant l'échantillon dans un tube conique de 15 millilitres et centrifugez les cellules pendant 10 minutes à 335 ×g et à 4 °C. Éliminez le surnageant et ajoutez 2 millilitres d'un tampon d'lyse CK au culot pendant une minute à température ambiante pour lyser les globules rouges résiduels. Lavez ensuite les cellules avec 13 millilitres de PBS froid supplémenté de 0,5 % de BSA.

Après avoir éliminé le surnageant, resuspendez de nouveau ce culot dans cinq millilitres de PBS froid contenant de l'albumine sérique de bœuf (BSA), puis faites passer la solution cellulaire à travers un tamis en nylon de 100 micromètres. Enfin, déterminez le nombre total de cellules par exclusion au bleu de trypan. Au lieu d'utiliser une dissociation douce avec un Gentle Max, remplissez un tube conique de 15 millilitres avec cinq millilitres de solution de collagénase par poumon.

Ajouter le tissu pulmonaire haché dans le tube, puis incuber le tissu pulmonaire pendant une heure à 37 degrés Celsius. Vortexer les cellules toutes les 15 minutes afin de re-centrifuger les fragments de tissu. Ensuite, disloquer le tissu digéré en faisant passer l'échantillon de six à huit fois à travers une seringue de trois millilitres munie d'une aiguille de calibre 20.

Évitez de former des bulles pendant le processus. Commencez par laver la suspension de cellules uniques pendant 10 minutes à 200 × g à quatre degrés Celsius, puis jetez le surnageant. Resuspendez ensuite les cellules dans 400 microlitres de tampon de séparation.

Prétendez au huitième bloc de cellules totales pour bloquer la liaison non spécifique d'anticorps médiée par FC en utilisant 0,5 microgramme d'anticorps anti-CD16/32, puis incubez les six cellules pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir lavé les cellules avec 10 millilitres de tampon de séparation froid, resuspendez les cellules dans 400 microlitres supplémentaires de tampon de séparation. Ajoutez ensuite 100 microlitres de microbilles CD11c, prétendez au huitième des cellules totales, mélangez soigneusement et incubez la solution de cellules et de billes pendant 15 minutes au réfrigérateur.

Après avoir éliminé les billes non liées à l’aide de 10 millilitres de tampon de séparation froid, jetez le surnageant et resuspendez le culot cellulaire dans un millilitre de tampon de séparation froid. Enfin, chargez les échantillons dans le séparateur AutoMax pro et exécutez le programme P-O-S-S-E-L-D afin de recueillir la fraction cellulaire exprimant CD 11 C.

Incuber la suspension cellulaire enrichie en cellules positives pour CD11c avec l'anticorps anti-CD11c PEI sept et des anticorps dirigés contre les molécules de classe II du CMH présents sur ces cellules pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir lavé les cellules avec du PBS froid contenant du BSA, resuspendre les cellules dans 0,5 millilitre de PBS avec BSA, puis les faire passer à travers un filtre en nylon de 40 micromètres. Enfin, ajouter les cellules positives pour CD11c purifiées dans un tube FACS pour une quantification ultérieure dans des tubes vides séparés.

Ajouter 100 microlitres de PBS contenant du BSA à des tubes de collecte de cinq millilitres afin d'éviter tout dommage aux cellules purifiées, puis trier la suspension cellulaire filtrée par cytométrie en flux, en maintenant les cellules collectées à une température réfrigérée tout au long du processus de tri cellulaire. Sur ces diagrammes de densité, on observe dans la rate plus de trois fois plus de cellules dendritiques conventionnelles qu'au niveau du poumon. De plus, au niveau pulmonaire, les cellules positives pour CD11c incluent une population cellulaire qui ne correspond pas à des cellules dendritiques conventionnelles, représentée par le groupe d'événements MHC classe II faible en dehors du cadre des cellules dendritiques conventionnelles.

Du côté gauche de la figure, visible sur ce tracé de densité, la séparation magnétique des cellules pulmonaires totales augmente le nombre de cellules dendritiques conventionnelles de 1,5 % environ des cellules totales à environ 16,5 %. Toutefois, les macrophages CD11c positifs et exprimant faiblement la molécule du CMH de classe II représentent encore plus de 70 % de l'ensemble de la population cellulaire, contaminant ainsi significativement la pureté de la sous-population de cellules dendritiques conventionnelles enrichies à ce stade du processus d'isolement. Le tri par FACS améliore toutefois la pureté des cellules dendritiques conventionnelles à plus de 96 %, comme observé sur la microphotographie en haut à droite. Les cellules dendritiques conventionnelles CD11c élevées et fortement exprimant le CMH de classe II sont des cellules arrondies portant les dendrites typiques, tandis que les cellules CD11c élevées et faiblement exprimant le CMH de classe II, visibles sur la microphotographie en bas à droite, présentent des prolongements cellulaires plus caractéristiques de la morphologie des macrophages.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de manipuler le tissu pulmonaire et la préparation de cellules uniques aux températures indiquées. Cela est essentiel pour préserver la viabilité cellulaire et le rendement en cellules dendritiques conventionnelles. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler les sous-populations de cellules dendritiques à partir du poumon de souris.

L'isolement des sous-ensembles de cellules dendritiques pulmonaires constitue un outil très utile pour comprendre les fonctions de ces cellules lors de leur réponse aux agents pathogènes respiratoires et aux facteurs environnementaux capables de déclencher la réponse immunitaire de l'hôte dans le poumon.