Name: Lisolement des cellules de souris poumon dendritiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Découvrez l'isolement des cellules dendritiques pulmonaires de souris par digestion au collagénase, enrichissement magnétique et tri cytométrique. Cette méthode permet d'obtenir une préparation hautement purifiée pour les études immunologiques.

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Les auteurs tiennent à remercier Dietrich à Marilyn à l&#39;installation de débit de base UGB Cytométrie pour son aide avec le tri cellulaire et Peter Mottram pour son aide avec les microphotographies. Ce travail a été financé par le Flight Attendant Institut de recherche médicale, le Prix du LSU-concurrentiel du Programme de recherche et les subventions du NIH / NIAID P20 RR020159 et R03AI081171.

1. Perfusion pulmonaire et la suspension seule cellule <ol><li> Euthanasier la souris avec une injection intrapéritonéale de kétamine / xylazine mélange anesthésique (en mg / souris kétamine 1.8, xylazine 0,19) et une exsanguination par la veine fémorale </li><li> Exposer la cavité thoracique en coupant et en tirant doucement en arrière la peau externe du péritoine. Procéder à l&#39;ouverture du diaphragme par la coupe de la cage thoracique afin d&#39;exposer à la fois le cœur et les poumons. </li><li> Perfuser délicatement les poumons en utilisant une seringue de 5 ml remplie avec de l&#39;EDTA-HBSS (1mM EDTA en calcium / magnésium sans HBSS). Connecter une aiguille de 25 G et insérer l&#39;aiguille dans le ventricule droit. Pour éviter les fuites lors de l&#39;injection, sécuriser le tissu myocardique autour de l&#39;aiguille en utilisant une pince. Doucement injecter la solution, tout en maintenant une pression constante. Perfusion précis se traduira par l&#39;inflation du poumon et un changement de couleur rose / blanc. </li><li> Retirer les ganglions lymphatiques drainant à écarter toute contamination éventuelle de ce tissu. </li><li> Recueillirtissu pulmonaire, transfert à une boîte de Pétri sur la glace, et le hacher en petits morceaux à l&#39;aide d&#39;une lame de rasoir. </li><li> Transfert des tissus à la terre dans un tube gentleMACS C contenant 5 ml / poumon de la solution de digestion par la collagénase (collagénase de type 1A 0,5 mg / ml, plus de type IV pancréatique bovine DNase 20 ug / ml dans du HBSS contenant 5% de FBS, 100 U / ml de pénicilline et 100 ug ml de streptomycine /). </li><li> Utilisez le dissociateur gentleMACS pour obtenir une suspension cellulaire unique. Choisissez le programme: m_lung_01. Incuber l&#39;échantillon à 37 ° C pendant 30 minutes. Agiter le tube toutes les 5 minutes pour remettre les fragments de tissus. Procéder à m_lung_02 programme. </li><li> Transférer l&#39;échantillon dans un tube de 15 ml conique et centrifuger pendant 10 minutes à 335 x g à 4 ° C. Après cette étape, gardez tous les réactifs et centrifugations à 4 ° C pour empêcher la réduction de la viabilité cellulaire. </li><li> Rejeter le surnageant et lyser les globules rouges restants en ajoutant 2 ml de tampon de lyse ACK pendant 1 minute à température ambiante. Laver les cellules avec 13ml de BSA PBS/0.5% froid et centrifuger pendant 10 minutes à 335 x g à 4 ° C. </li><li> Rejeter le surnageant, resuspendre nombre total de cellules dans 5 ml de BSA PBS/0.5% froid et passer un maillage complet 100 um en nylon. </li><li> Déterminer le nombre total de cellules en utilisant colorant exclusion du bleu trypan. </li></ol> 2. Isolation magnétique et CD11c + cellules d&#39;enrichissement <ol><li> Centrifuger la suspension seule cellule pendant 10 minutes à 200 x g à 4 ° C et éliminer le surnageant. </li><li> Resuspendre le culot cellulaire dans 400 pl de tampon de séparation (PBS, BSA 0,5%, et 2 mM d&#39;EDTA) par 10 8 cellules totales. Bloc-Fc des anticorps médiée imprécise de liaison en utilisant des anticorps anti-CD16/CD32 (0.5μg / 10 6 cellules) pendant 30 minutes à 4 ° C. </li><li> Laver les cellules avec 10 ml de tampon de séparation à froid et centrifuger pendant 10 minutes à 200 x g à 4 ° C. Resuspendre les cellules dans 400 ul de tampon de séparation. </li><li> Ajouter 100 ul de microbilles CD11c par 10 8 </soutien cellules&gt; total. Bien mélanger et incuber pendant 15 minutes au réfrigérateur (2-8 ° C). </li><li> Laver les cellules avec 10 ml de tampon de séparation à froid et centrifuger pendant 10 minutes à 200 x g à 4 ° C et éliminer le surnageant. </li><li> Reprendre le culot cellulaire dans 3 ml de tampon de séparation à froid. </li><li> Effectuer la séparation magnétique à l&#39;aide de la autoMACS Pro TM Séparateur en sélectionnant le posseld programme. Recueillir la fraction positive (0,5 ml). </li></ol> 3. Cellules dendritiques classiques (CDC) d&#39;isolation <ol><li> Incuber enrichi CD11c suspension cellulaire positifs avec des anti-CD11c PE-Cy7 et anti-IA/IE (CMH-II)-FITC anticorps pendant 30 minutes à 4 ° C. La concentration d&#39;anticorps est optimisée 0,5 pg / 10 6 de cellules. </li><li> Laver les cellules avec de la BSA PBS/0.5% froid et centrifuger pendant 10 minutes à 335 x g à 4 ° C. Resuspendre les cellules dans 0,5 ml de BSA PBS/0.5% et les faire passer à travers une maille de 40 um de nylon. </li><li> Passez àtrier les cellules en utilisant le trieur FACS Aria cellulaire dans le mode de pureté. Ajouter 100 ul de BSA PBS/0.5% sur les tubes de collecte afin de prévenir tout dommage des cellules purifiées. Gardez vos cellules à une température réfrigérée au long du processus de tri cellulaire. </li></ol> 4. Protocole alternatif pour l&#39;obtention d&#39;une suspension cellulaire unique et CD11c + cellules d&#39;enrichissement <ol><li> En remplacement de la dissociateur gentleMACS, le tissu pulmonaire à la terre de l&#39;étape 1.5 peut être transféré à un tube de 15 ml conique contenant 5 ml de solution de collagénase par poumon et incuber pendant 1 heure à 37 ° C. Vortex cellules toutes les 15 minutes afin de remettre en suspension des fragments de tissus. Perturber le tissu en passant l&#39;échantillon 6-8 fois dans et à travers une seringue de 3 ml connecté à une aiguille 20 G. Évitez de faire des bulles pendant le processus, sinon la viabilité des cellules sera compromise. Une fois la suspension cellulaire unique est obtenue, passez à l&#39;étape 1.8. </li><li> En remplacement de la séparation AutoMACSPro MCTor, isolation magnétique pour l&#39;enrichissement des cellules CD11c, peut également être effectuée par le passage de la suspension cellulaire manuelle à travers des colonnes MACS deux. La sélection des colonnes appropriées varieront en fonction de la taille de l&#39;échantillon. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Lung CDC sont identifiés comme CD11c Salut / CMH-II population de cellules Salut. Comme indiqué dans la Fig. 1, CDC représentent un pourcentage inférieur de 1,4% par rapport à certains autres tissus tels que la rate (4,8%). Cependant, contrairement à la rate, les poumons des cellules CD11c positifs d&#39;exprimer des quantités différentes de CMH-II, y compris une population cellulaire différent de celui des CDC. Après la préparation à cellule unique, le rendement cellulaire des cellules pulmonaire totale était d&#39;environ 3,0 à 3,8 x 10 7 cellules / poumon avec une viabilité de 60-70% à partir de laquelle un peu plus de 1% a représenté sous la CDC. Ce pourcentage a augmenté après l&#39;isolement CD11c magnétique où le poumon totale CDC a été incrémenté environ 10 tIMES (&gt; 16%) de la préparation originale (figure 2A). Cependant, les cellules CD11c exprimer de faibles quantités de CMH-II (CD11c Salut / CMH-II lo, les macrophages) représentent une population de cellules contaminantes haute (&gt; 70%) qui a été mélangé avec le sous-ensemble des poumons CDC. Comme indiqué dans la Fig. 2B, ces cellules ont été éliminées après l&#39;étape de tri cellulaire lorsque la pureté CDC atteint&gt; 96%. Le rendement habituel de la CDC, après toute la procédure était de 5 x 10 4 cellules / poumon. Microphotographies montrent des caractéristiques morphologiques de la CDC comme des cellules arrondies avec les dendrites typiques (panneau supérieur). D&#39;autre part, CD11c Salut / CMH-II lo représenté un sous-ensemble morphologiquement différentes qui montre protubérances cellulaires qui sont typiques des macrophages (MΦ, panneau inférieur) 12. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3563/3563fig1.jpg" /> Figure 1. Différentiel DC fréquence des poumons de souris et la rate. Lung unetissu splénique ND de souris C57BL / 6 ont été collectées et traitées avec de la collagénase. Après digestion à la collagénase, les cellules ont été colorées avec anti-souris CD11c-PE-Cy7 et anti-souris IA / IE-FITC. Parcelles représentant de cytométrie en flux montrent des pourcentages de la CDC (CD11c Salut / CMH-II Salut) dans les poumons et la rate. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3563/3563fig2.jpg" /> Figure 2. Isolement de la CDC à partir des poumons de souris. Poumons de souris des cellules de suspension unique a été étiqueté avec des anti-CD11c microbilles et passé à travers un séparateur de cellules automatique. A) Un graphique représentatif montre les pourcentages de la CDC (CD11c Salut / CMH-II Salut) et Les macrophages (MΦ, CD11c Salut / CMH-II LO) des populations après enrichissement CD11c. Coloration plus de la fraction enrichie en utilisant suivi anti-souris CD11c-PE-Cy7 et anti-souris IA / IE-FITC. Double cellules positives ont été triées et analysées par cytométrie en flux. Pourd&#39;identifier leur morphologie, les cellules ont été cytospun et colorées avec une modification Wright-Giemsa coloration. B) parcelles représentant montrent des pourcentages de la CDC et MΦ après tri cellulaire. Microphotographies montrent une image représentative du poumon et de la CDC MΦ poumon. Barre d&#39;échelle = 20 um.

<ol><li>Pulendran, B., Palucka, K., Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+pathogens+and+tuning+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sensing pathogens and tuning immune responses.</a> Science. 293, 253-256 (2001).</li>
<li>Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunobiology+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).</li>
<li>Manicassamy, S., Pulendran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+control+of+tolerogenic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell control of tolerogenic responses.</a> Immunol. Rev. 241, 206-227 (2011).</li>
<li>Steinman, R. M., Cohn, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+cell+type+in+peripheral+lymphoid+organs+of+mice.+I.+Morphology%2C+quantitation%2C+tissue+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution.</a> J. Exp. Med. 137, 1142-1162 (1973).</li>
<li>Asselin-Paturel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+type+I+IFN-producing+cells+are+immature+APCs+with+plasmacytoid+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology.</a> Nat. Immunol. 2, 1144-1150 (2001).</li>
<li>Chan, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-producing+killer+dendritic+cells+provide+a+link+between+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Interferon-producing killer dendritic cells provide a link between innate and adaptive immunity.</a> Nat. Med. 12, 207-213 (2006).</li>
<li>Taieb, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+dendritic+cell+subset+involved+in+tumor+immunosurveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A novel dendritic cell subset involved in tumor immunosurveillance.</a> Nat. Med. 12, 214-219 (2006).</li>
<li>Guerrero-Plata, A., Kolli, D., Hong, C., Casola, A., Garofalo, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subversion+of+pulmonary+dendritic+cell+function+by+paramyxovirus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Subversion of pulmonary dendritic cell function by paramyxovirus infections.</a> Journal of Immunology. 182, 3072-3083 (2009).</li>
<li>Larson, R. S., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+leukocyte+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Structure and function of leukocyte integrins.</a> Immunol. Rev. 114, 181-217 (1990).</li>
<li>Sung, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+lung+CD103+%28alphaE%29-beta7+integrin-positive+epithelial+dendritic+cell+population+expressing+Langerin+and+tight+junction+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins.</a> J. Immunol. 176, 2161-2172 (2006).</li>
<li>Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+CD11c%2B+MHC+class+II-+precursors+generate+lung+dendritic+cells+during+respiratory+viral+infection%2C+but+are+depleted+in+the+process%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Local CD11c+ MHC class II- precursors generate lung dendritic cells during respiratory viral infection, but are depleted in the process.</a> J. Immunol. 177, 2536-2542 (2006).</li>
<li>Bhatia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+host+defense+against+Aspergillus+fumigatus+involves+alveolar+macrophages+with+a+predominance+of+alternatively+activated+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance of alternatively activated phenotype.</a> PLoS One. 6, e15943-e15943 (2011).</li>
<li>Shao, Z., Makinde, T. O., McGee, H. S., Wang, X., Agrawal, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fms-like+tyrosine+kinase+3+ligand+regulates+migratory+pattern+and+antigen+uptake+of+lung+dendritic+cell+subsets+in+a+murine+model+of+allergic+airway+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fms-like tyrosine kinase 3 ligand regulates migratory pattern and antigen uptake of lung dendritic cell subsets in a murine model of allergic airway inflammation.</a> J. Immunol. 183, 7531-75381 (2009).</li>
<li>Hao, X., Kim, T. S., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+response+of+respiratory+dendritic+cell+subsets+to+influenza+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Differential response of respiratory dendritic cell subsets to influenza virus infection.</a> J. Virol. 82, 4908-4919 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

L&#39;isolement de la souris pulmonaires DC est une technique importante pour l&#39;étude d&#39;un large éventail de stimuli respiratoires. Le processus d&#39;obtention de ces cellules comprend des étapes critiques qui empêchent la perte de cellules ainsi que la viabilité des cellules et la pureté. Perfusant le poumon avant la collecte aidera à éliminer toutes les cellules périphériques ainsi que de réduire les érythrocytes contaminant. L&#39;utilisation de la dissociation peut être automatisé advanteogus quand un grand...

<table width="200" border="1"><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Tampon de lyse ACK </td><td> Invitrogen </td><td> D6-0005DG </td><td></td></tr><tr><td> Anti-souris CD11c (HL3) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 5580979 </td><td> PE-Cy7 conjugués </td></tr><tr><td> Anti-souris IA / IE (269) </td><td> BD-Pharmingen </td><td> 553623 </td><td> Conjugué au FITC </td></tr><tr><td> Collangenase type 1A </td><td> Sigma </td><td> 9891-500MG </td><td></td></tr><tr><td> Crépines cellulaire </td><td> BD Falcon </td><td> 352340, 352360 </td><td></td></tr><tr><td> CD11c (N418) Microbilles </td><td> Miltenyi </td><td> 130-052-001 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Sigma </td><td> D5025-150KU </td><td></td></tr><tr><td> Hank solution saline équilibrée </td><td> Invitrogen </td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td> Solution tampon HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> Boîtes de Pétri de 60 mm </td><td> BD Falcon </td><td> 351016 </td><td></td></tr><tr><td> GentleMACS ™ C tubes </td><td> Miltenyi </td><td> 130-093-237 </td><td></td></tr><tr><td> Douceur dissociateur MACS </td><td> Miltentyi </td><td> 130-093-235 </td><td></td></tr><tr><td> Automacs-Pro ™ </td><td> Miltenyi </td><td> 130-092-545 </td><td></td></tr><tr><td> FASCS Aria </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr></table>

l&#39;isolement des cellules de souris poumon dendritiques

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Cellules dendritiques pulmonaires (DC) jouent un rôle fondamental dans la détection des pathogènes envahisseurs 1,2 ainsi que dans le contrôle des réponses tolérogènes 3 dans les voies respiratoires. Au moins trois sous-ensembles principaux de cellules dendritiques pulmonaires ont été décrites chez la souris: DC conventionnelles (CDC) 4, DC plasmacytoïdes (pDC) 5 et le tueur de l&#39;IFN-production DC (IKDC) 6,7. Le sous-ensemble CDC est le sous-ensemble DC les plus éminents dans les poumons 8. Le marqueur commun connus pour identifier des sous-DC est CD11c, un type que je transmembranaire intégrines (β2) qui est également exprimé sur les monocytes, les macrophages, les neutrophiles et des cellules B 9. Dans certains tissus, en utilisant comme marqueur CD11c pour identifier la souris DC est valable, comme dans la rate, où la plupart des cellules CD11c + représentent le sous-ensemble des CDC, qui exprime des niveaux élevés de l&#39;complexe majeur d&#39;histocompatibilité de classe II (CMH-II). Toutefois, le poumon est un tissu plus hétérogène, où secôté des sous-ensembles DC, il ya un pourcentage élevé d&#39;une population de cellules distinctes qui exprime des niveaux élevés de CD11c bout de faibles niveaux de CMH-II. Basé sur sa caractérisation et surtout sur ​​l&#39;expression de ses F4/80, un marqueur des macrophages spléniques, le CD11c Salut CMH-II de la population lo cellules du poumon a été identifié comme les macrophages pulmonaires 10 et plus récemment, comme un précurseur potentiel DC 11. Contrairement à la souris PDC, l&#39;étude du rôle spécifique de la CDC dans la réponse immunitaire pulmonaire a été limitée en raison de l&#39;absence d&#39;un marqueur spécifique qui pourrait aider dans l&#39;isolement de ces cellules. Par conséquent, dans ce travail, nous décrivons une procédure pour isoler hautement purifiée de souris pulmonaires CDC. L&#39;isolement des sous-ensembles DC pulmonaires représente un outil très utile afin de mieux connaître la fonction de ces cellules en réponse à des agents pathogènes des voies respiratoires ainsi que les facteurs environnementaux qui peuvent déclencher la réponse immunitaire de l&#39;hôte dans les poumons.

Une préparation hautement purifiée de cellules de souris pulmonaires dendritiques est décrite. Un accent particulier est donné à l&#39;isolement de sous-ensemble de cellules dendritiques conventionnelles.

L&#39;isolement des cellules de souris poumon dendritiques

Les cellules dendritiques (DC) pulmonaires jouent un rôle fondamental dans la détection des agents pathogènes envahissants 1,2 ainsi que dans le contrôle des réponses tolérogènes 3 dans le ...

L'objectif général de cette procédure est d'obtenir une préparation hautement purifiée de cellules dendritiques pulmonaires de souris. Cela est réalisé en premier lieu en prélevant le tissu pulmonaire sans inclure les ganglions lymphatiques drainants. Ensuite, une suspension monocellulaire est obtenue par digestion à la collagénase.L'étape suivante consiste à enrichir les cellules positives pour CD11c à l'aide d'un système d'isolement magnétique des cellules. Ensuite, le sous-ensemble de cellules dendritiques conventionnelles est isolé par tri cellulaire en cytométrie en flux. Enfin, les cellules dendritiques conventionnelles isolées à partir du tissu pulmonaire de souris peuvent être analysées par cytométrie en flux et microscopie optique.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'immunologie, comme quel est le rôle du sous-ensemble de cellules dendritiques conventionnelles dans l'immunité innée et les maladies infectieuses au niveau du tractus respiratoire ? La procédure sera démontrée par Issa Lancelin, chercheur associé de mon laboratoire, ainsi que par moi-même. Après l'euthanasie de la souris, commencez par inciser puis retirer délicatement la peau externe du péritoine afin d'exposer la cavité thoracique.Procédez à l'ouverture du diaphragme en coupant la cage thoracique afin d'exposer le cœur et les poumons. Une fois le cœur et les poumons exposés, la procédure de perfusion peut commencer. Remplissez une seringue de cinq millilitres avec E-D-T-A-H-B-S-S et fixez une aiguille de calibre 25 à la seringue.Insérez ensuite l'aiguille dans le ventricule droit afin d'éviter toute fuite pendant l'injection. Utilisez une pince pour maintenir le tissu myocardique autour de l'aiguille. Ensuite, injectez doucement la solution tout en maintenant une pression constante.Une perfusion précise entraînera un gonflement pulmonaire et un changement de couleur vers le rose ou le blanc. Pour éviter toute contamination potentielle, retirez et jetez les ganglions lymphatiques drainants. Ensuite, prélèvez le tissu pulmonaire et transférez l'organe excisé dans une boîte de Pétri placée sur de la glace. Remplissez un tube Gentle Max C avec cinq millilitres de solution de digestion au collagénase pour poumon, puis hachez le poumon en petits morceaux.À l’aide d’une lame de rasoir, transférer le tissu dans le tube en utilisant une dissociation maximale douce. Pour obtenir une suspension de cellules uniques, sélectionner le programme M lung zero one. Incuber ensuite l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, en agitant le tube toutes les cinq minutes pour resuspendre les fragments de tissu F, puis poursuivre avec le programme M lung zero two.Transférez maintenant l'échantillon dans un tube conique de 15 millilitres et centrifugez les cellules pendant 10 minutes à 335 ×g et à 4 °C. Éliminez le surnageant et ajoutez 2 millilitres d'un tampon d'lyse CK au culot pendant une minute à température ambiante pour lyser les globules rouges résiduels. Lavez ensuite les cellules avec 13 millilitres de PBS froid supplémenté de 0,5 % de BSA.Après avoir éliminé le surnageant, resuspendez de nouveau ce culot dans cinq millilitres de PBS froid contenant de l'albumine sérique de bœuf (BSA), puis faites passer la solution cellulaire à travers un tamis en nylon de 100 micromètres. Enfin, déterminez le nombre total de cellules par exclusion au bleu de trypan. Au lieu d'utiliser une dissociation douce avec un Gentle Max, remplissez un tube conique de 15 millilitres avec cinq millilitres de solution de collagénase par poumon.Ajouter le tissu pulmonaire haché dans le tube, puis incuber le tissu pulmonaire pendant une heure à 37 degrés Celsius. Vortexer les cellules toutes les 15 minutes afin de re-centrifuger les fragments de tissu. Ensuite, disloquer le tissu digéré en faisant passer l'échantillon de six à huit fois à travers une seringue de trois millilitres munie d'une aiguille de calibre 20.Évitez de former des bulles pendant le processus. Commencez par laver la suspension de cellules uniques pendant 10 minutes à 200 × g à quatre degrés Celsius, puis jetez le surnageant. Resuspendez ensuite les cellules dans 400 microlitres de tampon de séparation.Prétendez au huitième bloc de cellules totales pour bloquer la liaison non spécifique d'anticorps médiée par FC en utilisant 0,5 microgramme d'anticorps anti-CD16/32, puis incubez les six cellules pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir lavé les cellules avec 10 millilitres de tampon de séparation froid, resuspendez les cellules dans 400 microlitres supplémentaires de tampon de séparation. Ajoutez ensuite 100 microlitres de microbilles CD11c, prétendez au huitième des cellules totales, mélangez soigneusement et incubez la solution de cellules et de billes pendant 15 minutes au réfrigérateur.Après avoir éliminé les billes non liées à l’aide de 10 millilitres de tampon de séparation froid, jetez le surnageant et resuspendez le culot cellulaire dans un millilitre de tampon de séparation froid. Enfin, chargez les échantillons dans le séparateur AutoMax pro et exécutez le programme P-O-S-S-E-L-D afin de recueillir la fraction cellulaire exprimant CD 11 C.Incuber la suspension cellulaire enrichie en cellules positives pour CD11c avec l'anticorps anti-CD11c PEI sept et des anticorps dirigés contre les molécules de classe II du CMH présents sur ces cellules pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir lavé les cellules avec du PBS froid contenant du BSA, resuspendre les cellules dans 0,5 millilitre de PBS avec BSA, puis les faire passer à travers un filtre en nylon de 40 micromètres. Enfin, ajouter les cellules positives pour CD11c purifiées dans un tube FACS pour une quantification ultérieure dans des tubes vides séparés.Ajouter 100 microlitres de PBS contenant du BSA à des tubes de collecte de cinq millilitres afin d'éviter tout dommage aux cellules purifiées, puis trier la suspension cellulaire filtrée par cytométrie en flux, en maintenant les cellules collectées à une température réfrigérée tout au long du processus de tri cellulaire. Sur ces diagrammes de densité, on observe dans la rate plus de trois fois plus de cellules dendritiques conventionnelles qu'au niveau du poumon. De plus, au niveau pulmonaire, les cellules positives pour CD11c incluent une population cellulaire qui ne correspond pas à des cellules dendritiques conventionnelles, représentée par le groupe d'événements MHC classe II faible en dehors du cadre des cellules dendritiques conventionnelles.Du côté gauche de la figure, visible sur ce tracé de densité, la séparation magnétique des cellules pulmonaires totales augmente le nombre de cellules dendritiques conventionnelles de 1,5 % environ des cellules totales à environ 16,5 %. Toutefois, les macrophages CD11c positifs et exprimant faiblement la molécule du CMH de classe II représentent encore plus de 70 % de l'ensemble de la population cellulaire, contaminant ainsi significativement la pureté de la sous-population de cellules dendritiques conventionnelles enrichies à ce stade du processus d'isolement. Le tri par FACS améliore toutefois la pureté des cellules dendritiques conventionnelles à plus de 96 %, comme observé sur la microphotographie en haut à droite. Les cellules dendritiques conventionnelles CD11c élevées et fortement exprimant le CMH de classe II sont des cellules arrondies portant les dendrites typiques, tandis que les cellules CD11c élevées et faiblement exprimant le CMH de classe II, visibles sur la microphotographie en bas à droite, présentent des prolongements cellulaires plus caractéristiques de la morphologie des macrophages.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de manipuler le tissu pulmonaire et la préparation de cellules uniques aux températures indiquées. Cela est essentiel pour préserver la viabilité cellulaire et le rendement en cellules dendritiques conventionnelles. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler les sous-populations de cellules dendritiques à partir du poumon de souris.L'isolement des sous-ensembles de cellules dendritiques pulmonaires constitue un outil très utile pour comprendre les fonctions de ces cellules lors de leur réponse aux agents pathogènes respiratoires et aux facteurs environnementaux capables de déclencher la réponse immunitaire de l'hôte dans le poumon.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

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