Mesure translocation peptide dans de grandes vésicules unilamellaires

Pour quantifier la translocation de peptides à travers les membranes de vésicules. Des vésicules lipidiques marquées au fluorochrome sont générées avec une trypsine encapsulée. Un inhibiteur de la trypsine est ajouté pour inhiber l'activité de toute trypsine exogène, laissant ainsi la trypsine active à l'intérieur de la lumière des vésicules.

Seulement lorsque des peptides marqués de façon fluorescente sont ajoutés aux vésicules, leurs marqueurs fluorescents agissent comme donneurs FRET et excitent les molécules fluorescentes présentes sur les vésicules. Toutefois, lorsque les protéines traversent la membrane, elles sont digérées par la trypsine et le signal FRET est perdu. Une analyse spectrométrique révèle l'ampleur de la translocation des peptides, observée comme une diminution du signal FRET entre les vésicules et le peptide au fil du temps.

L'avantage principal de cette technique par rapport à d'autres méthodes, notamment d'autres techniques de vésicules lipidiques et méthodes de mesure de l'entrée de peptides dans les cellules, est qu'elle fournit des informations sur la cinétique de pénétration membranaire, et elle ne nécessite pas l'ajout d'un marqueur fluorescent aux peptides s'ils contiennent un tryptophane. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la conception et l'ingénierie de peptides actifs sur les membranes, telles que les caractéristiques nécessaires à une translocation membranaire efficace. La première étape de cette procédure consiste à préparer de grandes vésicules unilamellaires, ou UUVs, afin de servir de modèles de membrane cellulaire pour le test.

Commencez par mélanger la phosphatidylcholine, la phosphatidylglycérol et le naphtalène diméthylamino cinq. Un phosphatidyléthanolamine sulfonylé dans le chloroforme. Dans un rapport de 50 à 45 à cinq, 0,376 milligramme de lipide total est généralement suffisant pour produire assez de vésicules pour un essai expérimental ou témoin unique.

Préparez un flacon comme échantillon expérimental et un autre comme témoin ; faites évaporer le chloroforme à l’aide d’un courant de gaz azote. Les lipides séchés restants après cette étape sont appelés galettes lipidiques. Sèchez les galettes lipidiques pendant neuf à 14 heures dans un dessiccateur sous vide.

Ensuite, préparez une solution mère de HEI à 10 millimolaire, une solution mère de tripsine porcine à 0.4 millimolaire et une solution mère d'inhibiteur de la trypsine de Bowman-Birk à 4.0 millimolaire ; les détails de préparation sont disponibles dans le document accompagnant. Ajoutez un volume égal de la solution mère de tripsine à 0.4 millimolaire et de la solution tampon HEI à 10 millimolaire aux galettes lipidiques séchées. Puis vortexez le flacon pour reconstituer les vésicules multilamellaires ou MVs. Pour reconstituer les MVs témoins, ajoutez un volume égal de la solution mère de tripsine à 0.4 millimolaire et de l'inhibiteur de la trypsine à 4.0 millimolaire à la galette lipidique séchée, puis vortexez comme précédemment.

Une fois les vésicules multilamellaires reconstituées, transférez les solutions de VML depuis des flacons en verre vers des tubes microcentrifuges de 1,7 millilitre. Ensuite, soumettez les solutions de VML à cinq cycles de congélation-décongélation, en alternant entre de l'azote liquide et un bain d'eau à 30 degrés Celsius. Préparez ensuite un extrudeur à lipides en humidifiant deux supports de filtre avec du tampon de Heiss.

Placez ensuite chacun d’eux sur un embout en téflon humidifié et insérez une membrane de type nucleopore, gravée par irradiation et dotée de pores de 0,1 micron, entre les deux embouts en téflon. Insérez alors les embouts en téflon dans un boîtier métallique d’extrudeur et placez un entretoise en forme d’anneau au-dessus des deux embouts. Serrez le couvercle métallique du boîtier d’extrudeur, puis insérez-le dans le support à l’aide d’une seringue en verre de 250 microlitres.

Remplir l'espace vide de l'extrudeuse avec 500 microlitres de tampon He piece à 10 millimolaire afin d'éviter toute perte de l'échantillon de vésicules. Transférer l'échantillon dans un bécher de 10 millilitres.

Ensuite, charger chaque échantillon de MLV dans l'extrudeuse et faire passer l'échantillon à travers la membrane au moins 21 fois. Pour garantir une taille uniforme des vésicules Ella après extrusion, transférer les vésicules lipidiques ELLA de grande taille ou L UUVs dans un tube microcentrifuge de 1,7 millilitre. Conserver les UUVs à quatre degrés Celsius et les utiliser dans les 48 heures.

Pour évaluer la concentration des VUL, la teneur totale en phosphore dans l'échantillon est déterminée. Les éléments suivants doivent être préparés conformément aux spécifications du protocole écrit joint : H deux s oh quatre à 8,9 N, solution de molybdate d'ammonium à 2,5 % poids/volume, solution d'acide ascorbique à 6 10 % poids/volume et solution tampon phosphate à 0,65 millimolaire.

Préparez six étalons de phosphore comme indiqué ici. Ensuite, préparez un témoin LUV contenant le même volume de trypsine 0,2 millimolaire et de solution d'inhibiteur Bowman BIR 2,0 millimolaire que celui utilisé pour les témoins. Ceci est effectué afin de corriger la présence éventuelle de sels de phosphore séchés dans la poudre d'inhibiteur Bowman B.

Ensuite, pipeter environ 0,1 micromole, généralement environ 25 microlitres de VUV, en triple exemplaire dans des tubes de culture en verre jetables. Ajouter ensuite 450 microlitres de H deux SO quatre à 8,9 normale dans chacun des tubes échantillons, étalons et témoins. Puis placer les échantillons, étalons et témoins dans une étuve à 175 à 210 degrés Celsius pendant 25 minutes.

Une fois 25 minutes écoulées, retirez tous les tubes du four et laissez-les refroidir. Ajoutez 150 microlitres de 30 %H₂O dans chacun des tubes. Ensuite, chauffez les échantillons, les témoins et les blancs pendant encore 30 minutes à une température comprise entre 175 et 210 degrés Celsius.

Au bout de 30 minutes, retirez les témoins, les étalons et les blancs de la chaleur. Si certaines solutions ne sont pas encore incolores, ajoutez 50 microlitres de tube H₂O dans tous les tubes et chauffez pendant 15 minutes supplémentaires à 175-210 degrés Celsius. Une fois les solutions incolores, ajoutez à chaque tube 3,9 millilitres d’eau nano pure, 0,5 millilitre de solution de molybdate d’ammonium et 0,5 millilitre de solution d’acide ascorbique.

Ensuite, chauffer tous les tubes pendant cinq à sept minutes. Dans un bain d'eau bouillante, mesurer l'absorbance de chaque étalon et échantillon à 820 nanomètres à l'aide d'un spectrophotomètre UV-visible Agilent 8 4 5 3. Les concentrations en LUV expérimentales et témoins doivent être mesurées séparément.

Le tube contenant 0,0 millimole de phosphore doit être utilisé comme témoin pour tous les échantillons standards et expérimentaux de LUV. Le tube contenant 0,2 millimolaire de trypsine, 2,0 millimolaires de solution d'inhibiteur d'os et de bir, doit être utilisé comme témoin pour l'échantillon témoin de LUV. La courbe d'étalonnage linéaire d'absorbance en fonction de la teneur en phosphore obtenue doit être utilisée pour calculer la teneur totale en phosphore et la concentration de LUV des échantillons.

Pour préparer les solutions de peptides, dissoudre le peptide dans de l'H2O Oppu. Les peptides utilisés dans ce dosage doivent contenir un résidu de tryptophane. Mesurer l'absorbance de la solution de peptide à 282 nanomètres en triplicata. Calculer la concentration en peptide en utilisant le coefficient d'extinction molaire du tryptophane, qui est de 5 700.

Inverse molaire par centimètre inverse, diluez le peptide dans de l'eau nano-pure jusqu'à une concentration finale de 30 micromolaire, puis stockez à moins 20 degrés Celsius. Pour quantifier la translocation, préparez des échantillons expérimentaux et des échantillons témoins dans des tubes microcentrifugeurs de 1,7 millilitre. Ajoutez suffisamment de UUVs à chaque solution pour obtenir une concentration finale de 250 micromolaire.

Ajouter suffisamment de solution d'inhibiteur Bowman BIR afin que l'inhibiteur atteigne une concentration finale 10 fois supérieure à la concentration de tryine. Ajouter suffisamment de tampon heis 10 millimolaire pour amener le volume final de la solution à 450 microlitres. Placer 50 microlitres de solution de peptide dans une cuve fluorimétrique stana micro chords et l'insérer dans le programme du spectrophotomètre.

Un spectrophotomètre de fluorescence permettant de réaliser une expérience de cinétique fluorescente de 25 minutes, au cours de laquelle une mesure de fluorescence est enregistrée au moins une fois par seconde, avec une longueur d'onde d'excitation de 280 nanomètres et une longueur d'onde d'émission de 525 nanomètres à 25 degrés Celsius. Avec la sensibilité du PMT réglée au maximum, ajouter l'échantillon expérimental ou témoin à la solution de peptide dans le qve. Cela doit porter immédiatement la concentration finale en peptide à trois micromolaire, puis commencer sans délai l'expérience de cinétique fluorescente.

Une fois que les échantillons expérimentaux et de contrôle ont été analysés, calculez les rapports de translocation comme décrit dans le document accompagnant. Le rapport entre le peptide et le marqueur est suffisamment élevé pour garantir que pratiquement tous les peptides intacts se trouvent suffisamment proches d'un groupe dansyl pour produire un signal FRET, même si aucun d'entre eux n'a transloqué dans la vésicule. Ceci est conforme au signal FRET similaire observé dans les conditions de contrôle pour les peptides qui transloquent et ceux qui ne transloquent pas dans les vésicules.

Les essais de translocation ont été réalisés comme décrit dans cette vidéo. Cette figure montre les résultats d'un peptide représentatif qui a montré une translocation robuste. Le signal dans cet expérience, représenté par le tracé noir, montre une nette diminution du signal FRET.

Au fil du temps, des rapports de translocation plus élevés indiquent des peptides qui transloquent efficacement. Le rapport de translocation pour les peptides pénétrants cellulaires illustrés ici est de 1,19 ; les peptides traduits hebdomadairement présentent des rapports de translocation proches de un, afin de contrôler la perte potentielle du signal FRET due à des trips incomplets, à une inhibition ou à d'autres facteurs non liés à la capacité de translocation. Le signal FRET entre le peptide et les UUV contenant à la fois la trypsine et l'inhibiteur de trypsine Bowman-BRK est mesuré.

Cela est indiqué par la trace grise. L'importance de l'expérience témoin utilisant des UUV contenant un inhibiteur de la trypsine est mise en évidence par les données présentées ici. Dans ce cas, le signal du peptide a diminué d'une ampleur similaire à celle observée sur la figure précédente dans l'échantillon expérimental, représenté par la trace noire.

Cependant, l'échantillon témoin montre une diminution plus rapide pour ce peptide, de sorte que son translocation nette est plus faible. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la manière de préparer des vésicules lipidiques et de mesurer la translocation de peptides contenant du tryptophane. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de commencer la collecte des données immédiatement après le mélange du peptide et des vésicules.