Évaluer hypermutation somatique dans les cellules B Ramos, après surexpression ou Knockdown de gènes spécifiques

L'objectif général de l'expérience suivante est de modifier l'expression d'un gène, puis de mesurer son impact sur la mutation somatique hyperfréquente. Ceci est réalisé en transfectant des cellules Bosque 23 afin de produire des particules virales contenant soit un vecteur d'overexpression, soit un vecteur contenant un ARNh. Dans une deuxième étape, des cellules ramo sont infectées avec les virus, entraînant soit une inhibition, soit une surexpression du gène d'intérêt.

Ensuite, les clones unicellulaires sont cultivés pendant plusieurs semaines afin de permettre aux cellules d'accumuler des mutations. Enfin, l'effet de l'expression génique modifiée peut être déterminé par l'analyse de la perte d'IgM et par le séquençage des gènes IG. Cette méthode pourrait aider à identifier de nouveaux facteurs impliqués dans la diversification des anticorps.

Commencez par verser 600 microlitres de DMEM chaudement incubé dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Ensuite, faites attention à pipeter directement dans le milieu 30 microlitres de FU gene six dans le tube, vortexez la solution pendant moins d'une seconde, puis incubez le tube à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, pour une infection lentivirale comme celle-ci, ajoutez six microgrammes de construct S-H-R-N-A et 1,5 microgramme chacun de P-V-S-V-G-P-M-D-L-G-P-R-R-E et PRSV rev au mélange de DMEM et de FU gene six.

Vortexez brièvement la solution, puis incubez les deux brins à température ambiante pendant 25 minutes. Enfin, transfectez une culture cellulaire Bosque 23 à une confluence de 50 à 60 % avec le gène D-N-A-D-M-E-M FU six. Mélangez et incubez les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures.

Le lendemain, ajoutez cinq millilitres de DMEM aux cellules et remettez-les à l’incubateur pendant encore 24 heures. Le troisième jour suivant la transfection, utilisez une seringue de 10 millilitres pour récupérer 10 millilitres de milieu à partir des cellules transfectées box 23, puis fixez un filtre de 0,45 micromètre à l’extrémité de la seringue. Recueillez le milieu filtré dans un tube en polypropylène propre de 15 millilitres. 24 heures avant l’infection, semez deux millilitres de deux fois 10 à la puissance cinq cellules par millilitre de cellules ramo dans du RPMI complet dans une plaque à six puits. Le jour suivant, ajoutez trois microlitres d’une solution de polybrène à 10 microgrammes par millilitre et un millilitre de virus aux cellules ramo, puis mélangez soigneusement la suspension cellulaire à l’aide d’une pipette.

Pour le témoin non infecté, ajoutez un millilitre de RPMI complet et trois microlitres de polybrain dans un des puits au lieu du virus. Infectez également un puit avec un témoin négatif apparié et un autre avec un vecteur contenant GFP afin de déterminer l'efficacité d'infection par fax. Centrifugez ensuite la plaque à six puits à 3000 ×g pendant 90 minutes à température ambiante, puis remettez la plaque dans l'incubateur pendant 48 heures.

Enfin, centrifuger les cellules infectées dans un tube en polypropylène de 15 millilitres à 400 ×g pendant quatre minutes. À température ambiante, aspirer ensuite le milieu en veillant à ne pas perturber le culot cellulaire et resuspendre les cellules dans du RPMI frais. Après avoir dénombré les cellules, ajuster une suspension des cellules infectées à 10 cellules par millilitre.

Dans une solution de milieu conditionné RPMI et de SFB, compléter jusqu'à un volume final de 10 millilitres pour chaque plaque ensemencée. Ensuite, utiliser une pipette multipuits pour ensemencer des plaques de 96 puits avec 100 microlitres par puit de cellules diluées.

Après avoir incubé les plaques pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, utilisez un microscope pour examiner chaque puits individuellement. Pour confirmer la présence de cellules, car la profondeur adéquate afin d'identifier des cellules individuelles peut être difficile à déterminer. Commencez par focaliser sur les numéros de puits imprimés au fond de la plaque de 96 puits.

Ensuite, essayez de rechercher une cellule après deux semaines. Vérifiez la présence de colonies cellulaires le long des bords des puits à l'aide d'encre permanente. Marquez les puits présentant une croissance cellulaire robuste, puis transférez les colonies dans des plaques de 24 puits contenant un millilitre de RPMI pour une incubation supplémentaire.

Après plusieurs jours de croissance, transférez les cellules dans une plaque à six puits et poursuivez l'incubation des cultures. Trois semaines après le semis des colonies cellulaires dans la plaque à six puits Eloqua, récoltez cinq fois 10 à la puissance 5 cellules provenant de chaque puits dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. À ce stade, récoltez également les cellules de chacun des puits contrôle et avec inhibition d'ARNh, ainsi qu'un échantillon pour un contrôle non coloré.

Maintenant, centrifuger toutes les cellules à 400 G pendant quatre minutes à température ambiante, en lavant deux fois les cellules avec un millilitre de PBS pour la deuxième centrifugation. Après le deuxième lavage, nous suspendons le culot témoin non marqué dans 50 microlitres de PBS et les autres culots dans du PBS plus une dilution au 1/20 d'anticorps anti-IgM humaine marqué avec du PE. Incuber ensuite tous les échantillons cellulaires sur de la glace pendant une heure après avoir lavé les cellules deux fois supplémentaires avec du PBS comme précédemment, jeter le surnageant et resuspendre tous les culots dans 100 microlitres de PBS.

Ensuite, transférez les cellules colorées et les cellules témoins non colorées remises en suspension dans des tubes FACS, puis analysez les cellules par cytométrie en flux. Comparez le pourcentage de cellules négatives pour l'IgM provenant des témoins à celui des cellules avec inhibition de S-H-R-N-A. Un vecteur d'overexpression rétroviral pour un ID a été transfecté dans des cellules Bosque 23.

Les virus ont ensuite été récoltés et utilisés pour infecter des cellules Ramos, tant de type sauvage (wt) que surexprimant l’a ID. Les cellules a ID.High ont été mises en culture à partir d’une cellule unique et cultivées pendant trois semaines, puis analysées pour l’expression génique par RT-qPCR. Comme prévu, les résultats de la RT-qPCR montrent une augmentation marquée de l’expression de l’a ID après infection des cellules avec un vecteur de surexpression de l’a ID. La perte d’IgM à la surface des cellules infectées a également été évaluée par cytométrie en flux. L’IgM de surface a été mesurée par cytométrie en flux à partir de la figure précédente au point temporel de trois semaines, et le pourcentage de perte d’IgM a été calculé pour les cellules de type sauvage et les cellules a ID élevées, puis représenté graphiquement. Comme prévu, les cellules surexprimant l’a ID ont présenté une perte plus importante d’IgM de surface.

Dans une expérience distincte, des lentivirus contenant soit un ARNsh non pertinent comme témoin, soit un ARNsh ciblant un facteur de réparation de l'ADN à haute fidélité, censé protéger contre la MHG, ont été produits dans des cellules bosque 23. Les lentivirus ont ensuite été utilisés pour infecter un clone ID haut de cellules Ramos. L'expression génique a été analysée à nouveau et, comme prévu, des niveaux réduits du facteur de réparation de l'ADN ont été observés en présence d'un ARNsh ciblant ce facteur. La perte d'IGM dans les clones monocellulaires a également été analysée après trois semaines, puisque ce facteur de réparation est supposé offrir une protection contre les mutations durant la MHG. Une augmentation de la perte d'IGM et de la MHG en l'absence de ce facteur se produit, comme on peut l'observer sur cette figure.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser des infections virales de constructions contenant une SUR-EXPRESSION ou des S-H-R-N-A dans la lignée cellulaire B RAW, puis comment mesurer l'hypermutation somatique dans ces cellules.