Name: Évaluer hypermutation somatique dans les cellules B Ramos, après surexpression ou Knockdown de gènes spécifiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Découvrez comment modifier l'expression génique dans les cellules B Ramos par infection virale pour étudier l'hypermutation somatique. Cette méthode permet d'analyser la perte d'IgM et de séquencer les gènes IG.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Le pMSCV-AID-I-Thy1.1 et pKat2 vecteurs ont été un cadeau aimable de la DG Schatz et l&#39;pVSV-G, pRSV-Rev, et pMDLg / pRRE vecteurs ont été un cadeau du genre BR Cullen.

<ol><li>Di Noia, J. M., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+antibody+somatic+hypermutation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of antibody somatic hypermutation.</a> Annu. Rev. Biochem. 76, 1-22 (2007).</li>
<li>Peled, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biochemistry+of+somatic+hypermutation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The biochemistry of somatic hypermutation.</a> Annu. Rev. Immunol. 26, 481-511 (2008).</li>
<li>Longerich, S., Basu, U., Alt, F., Storb, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AID+in+somatic+hypermutation+and+class+switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">AID in somatic hypermutation and class switch recombination.</a> Curr. Opin. Immunol. 18, 164-174 (2006).</li>
<li>Bardwell, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+somatic+hypermutation+and+reduced+class-switch+recombination+in+exonuclease+1-mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Altered somatic hypermutation and reduced class-switch recombination in exonuclease 1-mutant mice.</a> Nat. Immunol. 5, 224-229 (2004).</li>
<li>Martomo, S. A., Yang, W. W., Gearhart, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Msh6+but+not+Msh3+in+somatic+hypermutation+and+class+switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">A role for Msh6 but not Msh3 in somatic hypermutation and class switch recombination.</a> J. Exp. Med. 200, 61-68 (2004).</li>
<li>Phung, Q. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+hypermutation+at+G+and+C+nucleotides+in+immunoglobulin+variable+genes+from+mice+deficient+in+the+MSH2+mismatch+repair+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Increased hypermutation at G and C nucleotides in immunoglobulin variable genes from mice deficient in the MSH2 mismatch repair protein.</a> J. Exp. Med. 187, 1745-1751 (1998).</li>
<li>Rada, C., Ehrenstein, M. R., Neuberger, M. S., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hot+spot+focusing+of+somatic+hypermutation+in+MSH2-deficient+mice+suggests+two+stages+of+mutational+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Hot spot focusing of somatic hypermutation in MSH2-deficient mice suggests two stages of mutational targeting.</a> Immunity. 9, 135-141 (1998).</li>
<li>Rada, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulin+isotype+switching+is+inhibited+and+somatic+hypermutation+perturbed+in+UNG-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulin isotype switching is inhibited and somatic hypermutation perturbed in UNG-deficient mice.</a> Curr. Biol. 12, 1748-1755 (2002).</li>
<li>Delbos, F., Aoufouchi, S., Faili, A., Weill, J. C., Reynaud, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+eta+is+the+sole+contributor+of+A%2FT+modifications+during+immunoglobulin+gene+hypermutation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase eta is the sole contributor of A/T modifications during immunoglobulin gene hypermutation in the mouse.</a> J. Exp. Med. 204, 17-23 (2007).</li>
<li>Masuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+eta+is+a+limiting+factor+for+A%3AT+mutations+in+Ig+genes+and+contributes+to+antibody+affinity+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase eta is a limiting factor for A:T mutations in Ig genes and contributes to antibody affinity maturation.</a> Eur. J. Immunol. 38, 2796-2805 (2008).</li>
<li>Lim, D. S., Hasty, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutation+in+mouse+rad51+results+in+an+early+embryonic+lethal+that+is+suppressed+by+a+mutation+in+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">A mutation in mouse rad51 results in an early embryonic lethal that is suppressed by a mutation in p53.</a> Mol. Cell. Biol. 16, 7133-7143 (1996).</li>
<li>Xiao, Y., Weaver, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+gene+targeted+deletion+by+Cre+recombinase+demonstrates+the+requirement+for+the+double-strand+break+repair+Mre11+protein+in+murine+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">Conditional gene targeted deletion by Cre recombinase demonstrates the requirement for the double-strand break repair Mre11 protein in murine embryonic stem cells.</a> Nucleic. Acids. Res. 25, 2985-2991 (1997).</li>
<li>Zhu, J., Petersen, S., Tessarollo, L., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+Nijmegen+breakage+syndrome+gene+NBS1+leads+to+early+embryonic+lethality+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the Nijmegen breakage syndrome gene NBS1 leads to early embryonic lethality in mice.</a> Curr. Biol. 11, 105-109 (2001).</li>
<li>Luo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+mRad50+causes+embryonic+stem+cell+lethality%2C+abnormal+embryonic+development%2C+and+sensitivity+to+ionizing+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Disruption of mRad50 causes embryonic stem cell lethality, abnormal embryonic development, and sensitivity to ionizing radiation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7376-7381 (1999).</li>
<li>Pavri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation-induced+cytidine+deaminase+targets+DNA+at+sites+of+RNA+polymerase+II+stalling+by+interaction+with+Spt5%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Activation-induced cytidine deaminase targets DNA at sites of RNA polymerase II stalling by interaction with Spt5.</a> Cell. 143, 122-133 (2010).</li>
<li>Lee-Theilen, M., Matthews, A. J., Kelly, D., Zheng, S., Chaudhuri, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CtIP+promotes+microhomology-mediated+alternative+end+joining+during+class-switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">CtIP promotes microhomology-mediated alternative end joining during class-switch recombination.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 75-79 (2011).</li>
<li>Basu, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+exosome+targets+the+AID+cytidine+deaminase+to+both+strands+of+transcribed+duplex+DNA+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The RNA exosome targets the AID cytidine deaminase to both strands of transcribed duplex DNA substrates.</a> Cell. 144, 353-363 (2011).</li>
<li>Yabuki, M., Fujii, M. M., Maizels, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MRE11-RAD50-NBS1+complex+accelerates+somatic+hypermutation+and+gene+conversion+of+immunoglobulin+variable+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The MRE11-RAD50-NBS1 complex accelerates somatic hypermutation and gene conversion of immunoglobulin variable regions.</a> Nat. Immunol. 6, 730-736 (2005).</li>
<li>Sale, J. E., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TdT-accessible+breaks+are+scattered+over+the+immunoglobulin+V+domain+in+a+constitutively+hypermutating+B+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">TdT-accessible breaks are scattered over the immunoglobulin V domain in a constitutively hypermutating B cell line.</a> Immunity. 9, 859-869 (1998).</li>
<li>Cumbers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+iterative+affinity+maturation+of+antibodies+in+vitro+using+hypermutating+B-cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Generation and iterative affinity maturation of antibodies in vitro using hypermutating B-cell lines.</a> Nat. Biotechnol. 20, 1129-1134 (2002).</li>
<li>Papavasiliou, F. N., Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cycle-regulated+DNA+double-stranded+breaks+in+somatic+hypermutation+of+immunoglobulin+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-cycle-regulated DNA double-stranded breaks in somatic hypermutation of immunoglobulin genes.</a> Nature. 408, 216-221 (2000).</li>
<li>Parsa, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AID+mutates+a+non-immunoglobulin+transgene+independent+of+chromosomal+position%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">AID mutates a non-immunoglobulin transgene independent of chromosomal position.</a> Mol. Immunol. 44, 567-575 (2007).</li>
<li>Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+instability+of+V+region+hypermutation+in+the+Ramos+Burkitt%27s+lymphoma+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Clonal instability of V region hypermutation in the Ramos Burkitt's lymphoma cell line.</a> Int. Immunol. 13, 1175-1184 (2001).</li>
<li>Ukai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+a%3AT+mutations+is+dependent+on+cellular+environment+but+independent+of+mutation+frequency+and+target+gene+location%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of a:T mutations is dependent on cellular environment but independent of mutation frequency and target gene location.</a> J. Immunol. 181, 7835-7842 (2008).</li>
<li>Dull, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).</li>
<li>Nakamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequency+class+switching+of+an+IgM%2B+B+lymphoma+clone+CH12F3+to+IgA%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunol%22%5BJournal%5D)">High frequency class switching of an IgM+ B lymphoma clone CH12F3 to IgA+ cells.</a> Int. Immunol. 8, 193-201 (1996).</li>
<li>Muramatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+expression+of+activation-induced+cytidine+deaminase+%28AID%29%2C+a+novel+member+of+the+RNA-editing+deaminase+family+in+germinal+center+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Specific expression of activation-induced cytidine deaminase (AID), a novel member of the RNA-editing deaminase family in germinal center B cells.</a> J. Biol. Chem. 274, 18470-18476 (1999).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Comme indiqué précédemment, les modèles de la lignée cellulaire pour la diversification des anticorps sont devenus un point de départ pour identifier de nouvelles protéines qui influencent les différentes étapes au cours de diversification des anticorps. Nous présentons ici une méthode pour utiliser une infection virale à des protéines soit le knock-down ou une surexpression dans les cellules B Ramos ligne et ensuite d&#39;examiner l&#39;impact sur la SHM. Pour ces études, nous utilisons deu...

Réactifs suggérée - la plupart d&#39;entre eux peuvent être remplacés par des produits similaires d&#39;autres fournisseurs. <table border="1" ><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th > Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td > 6-même évident TC-traitée plaques </td><td > Corning </td><td> 3516 </td><td ></td></tr><tr><td > 10 ml BD Luer-Loksyringes </td><td > BD Medical </td><td > 309604 </td><td ></td></tr><tr><td> 24 puits claires TC-traitée plaques </td><td > Corning </td><td > 3526 </td><td></td></tr><tr><td > 96 puits à fond plat en polystyrène transparent TC-traitée microplaques </td><td > Corning </td><td > 3596 </td><td ></td></tr><tr><td > 100 mm boîtes de culture TC-traitée </td><td > Corning </td><td > 430167 </td><td ></td></tr><tr><td > Filtres pour seringue Acrodisc, 0,45 um </td><td > Pall Life Sciences </td><td > 4604 </td><td ></td></tr><tr><td > Agar </td><td > Teknova </td><td > A7777 </td&gt; <td ></td></tr><tr><td > Agarose </td><td > GeneMate </td><td> E-3120-500 </td><td ></td></tr><tr><td > Ampicilline </td><td> Sigma </td><td > A0166 </td><td> 100 mg / mL dans l&#39;eau </td></tr><tr><td > BD FACSCanto cytomètre en flux II </td><td> BD Biosciences </td><td ></td><td > ou similaire </td></tr><tr><td> BD Falcon tubes ronds en polystyrène en bas </td><td> BD Biosciences </td><td > 352054 </td><td > pour la FACS </td></tr><tr><td > BOSC 23 cellules </td><td > ATCC </td><td > CRL-11270 </td><td ></td></tr><tr><td > CO 2 capable d&#39;incubateur 37 ° C </td><td ></td><td ></td><td ></td></tr><tr><td > DMEM (milieu de Dulbecco modifié Eagle) </td><td > Sigma </td><td> D6429 </td><td ></td></tr><tr><td > FBS (sérum de veau fœtal) </td><td > Gemini Bio-Produits </td><td > 100-106 </td><td ></td></tr><tr><td > FITC α-rat CD90/mouse CD90.1 d&#39;anticorps </td><td > BioLegend </td><td > 202503 </td><td > FITCα-Thy1.1 </td></tr><tr><td > Réactif de transfection FuGENE 6 </td><td > Roche </td><td > 11814443001 </td><td></td></tr><tr><td > Solution tampon HEPES </td><td > Invitrogen </td><td > 15630-080 </td><td ></td></tr><tr><td > Polymérase ADN KAPA HiFi </td><td > KAPA Biosystems </td><td > KK2101 </td><td ></td></tr><tr><td > LB Broth (bouillon de lysogénie - Luria) Poudre </td><td > Difco </td><td > 240230 </td><td ></td></tr><tr><td > MISSION TRC shRNA stocks de glycérol bactérienne </td><td > Sigma </td><td ></td><td> vecteurs shRNA </td></tr><tr><td > NCS (sérum de veau nouveau-né) </td><td > Gemini Bio-Produits </td><td > 100-504 </td><td ></td></tr><tr><td> PBS (solution tampon phosphate) </td><td > Invitrogen </td><td> 70011 </td><td > diluée dans de l&#39;eau à 1x </td></tr><tr><td > PE α-humain IgM </td><td > BioLegend </td><td > 314508 </td><td ></td></tr><tr><td > PGS (pénicilline-streptomycine-glutamine solution) </td><td > Gemini Bio-Produits </td><td > 400-110 </td><td ></td></tr><tr><td> Polybrène (hexadiméthrine bromure) </td><td > Sigma </td><td > 107689 </td><td > 10 mg / mL dans l&#39;eau </td></tr><tr><td > PureYield système plasmidique Midiprep </td><td > Promega </td><td > A2495 </td><td></td></tr><tr><td> Puromycine </td><td> Sigma </td><td > P8833 </td><td > 250 pg / mL dans l&#39;eau </td></tr><tr><td > QIAquick gel extraction kit </td><td > QIAGEN </td><td > 28706 </td><td ></td></tr><tr><td> Ramos (PR 1) des cellules </td><td > ATCC </td><td > LCR-1596 </td><td ></td></tr><tr><td > RPMI-1640 </td><td > Sigma </td><td > R8758 </td><td ></td></tr><tr><td > SuperScript II </td><td > Invitrogen </td><td > 18064-022 </td><td></td></tr><tr><td > SYBR FAST qPCR kit </td><td > KAPA Biosystems </td><td > KK4601 </td><td ></td></tr><tr><td > Taq ADN polymérase </td><td > Invitrogen </td><td > 18038-042 </td><td ></td></tr><tr><td > TOPO TA Cloning kit </td><td > InvitroGen </td><td > K4520-01 </td><td ></td></tr><tr><td > TRIzol </td><td > Invitrogen </td><td > 15596-026 </td><td ></td></tr><tr><td > Assistant Genomic DNA SV système de purification </td><td > Promega </td><td > A2361 </td><td ></td></tr><tr><td > X-Gal [5-bromo-4-chloro-3-β-indoyl-D-galatopyranoside] </td><td > Growcells </td><td > C-5687 </td><td > 40 mg / ml dans le DMSO </td></tr></tbody></table>

Évaluer hypermutation somatique dans les cellules b ramos, après surexpression ou knockdown de gènes spécifiques

Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

Les cellules B commencent leur vie avec des anticorps de faible affinité générés par V (D) J. Toutefois, après la détection d&#39;un pathogène, la variable (V) la région d&#39;une immunoglobuline (Ig) gène est muté environ 100.000 fois plus que le reste du génome grâce à hypermutation somatique (SHM), résultant de l&#39;affinité des anticorps 1,2 de haut. De plus, la commutation isotypique (CSR) produit des anticorps avec les différentes fonctions effectrices selon le type de réponse immunitaire qui est nécessaire pour un agent pathogène particulier. Tant en matière de RSE et la SHM sont initiées par la cytidine désaminase induite par activation (AID), qui désamine résidus cytosine dans l&#39;ADN pour produire uraciles. Ces uraciles sont traitées par des formes d&#39;erreurs des voies de réparation, pour aboutir finalement à des mutations et recombinaisons 1-3. Notre compréhension actuelle des détails moléculaires de SHM et la RSE proviennent d&#39;une combinaison d&#39;études chez la souris, des cellules primaires, lignées cellulaires et des cellules-fexpériences ree. Des modèles murins reste l&#39;étalon-or avec des KO génétique montrant des rôles essentiels pour de nombreux facteurs de réparation (par exemple Ung, MSH2, MSH6, Exo1, et la polymérase η) 4-10. Cependant, tous les gènes sont susceptibles d&#39;études à élimination directe. Par exemple, KO de plusieurs double-brin de protéines de réparation des cassures sont embryonnaire létal ou altérer développement des cellules B 11-14. D&#39;ailleurs, parfois la fonction spécifique d&#39;une protéine dans SHM ou RSE peuvent être masqués par plusieurs défauts mondial causé par les huitièmes de finale. En outre, depuis les expériences chez la souris peut être long, en modifiant l&#39;expression des gènes individuels dans des lignées cellulaires est devenu une étape plus populaire d&#39;abord identifier et caractériser les gènes candidats 15-18. Ramos - une ligne de lymphome de Burkitt qui subit constitutivement SHM - a été un populaire lignée cellulaire modèle pour étudier SHM 18-24. Un avantage de cellules Ramos, c&#39;est qu&#39;ils ont un semi intégré pratique-Quantitative mesure de SHM. Cellules de type sauvage d&#39;exprimer des IgM et, comme ils prennent des mutations, certaines mutations assommer l&#39;expression d&#39;IgM. Par conséquent, le dosage de la perte d&#39;IgM par la numérisation des cellules activées par fluorescence (FACS) fournit un moyen rapide de lecture pour le niveau de SHM. Une mesure plus quantitative de la SHM peut être obtenu par séquençage direct des gènes d&#39;anticorps. Comme les cellules Ramos sont difficiles à transfecter, nous produisons des dérivés stables qui ont augmenté ou abaissé expression d&#39;un gène particulier en infectant les cellules avec des constructions rétrovirales ou lentiviraux qui contiennent soit une cassette surexpression ou une épingle à cheveux courts ARN (shRNA), respectivement. Ici, nous décrivons comment nous infecter les cellules Ramos et ensuite utiliser ces cellules pour étudier le rôle des gènes spécifiques sur SHM (figure 1).

Nous décrivons comment effectuer des infections rétrovirales ou lentiviraux de la surexpression ou de shRNA contenant des constructions dans les cellules B humaines Ramos en ligne et comment mesurer hypermutation somatique dans ces cellules.

Évaluer hypermutation somatique dans les cellules B Ramos, après surexpression ou Knockdown de gènes spécifiques

Les lymphocytes B commencent leur vie avec des anticorps à faible affinité générés par la recombinaison V(D)J. Cependant, lors de la détection d'un agent pathogène, la région variable (V) d'un...

L'objectif général de l'expérience suivante est de modifier l'expression d'un gène, puis de mesurer son impact sur la mutation somatique hyperfréquente. Ceci est réalisé en transfectant des cellules Bosque 23 afin de produire des particules virales contenant soit un vecteur d'overexpression, soit un vecteur contenant un ARNh. Dans une deuxième étape, des cellules ramo sont infectées avec les virus, entraînant soit une inhibition, soit une surexpression du gène d'intérêt.Ensuite, les clones unicellulaires sont cultivés pendant plusieurs semaines afin de permettre aux cellules d'accumuler des mutations. Enfin, l'effet de l'expression génique modifiée peut être déterminé par l'analyse de la perte d'IgM et par le séquençage des gènes IG. Cette méthode pourrait aider à identifier de nouveaux facteurs impliqués dans la diversification des anticorps.Commencez par verser 600 microlitres de DMEM chaudement incubé dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Ensuite, faites attention à pipeter directement dans le milieu 30 microlitres de FU gene six dans le tube, vortexez la solution pendant moins d'une seconde, puis incubez le tube à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, po

assessing-somatic-hypermutation-ramos-b-cells-after-overexpression-or

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Nous fournissons une méthode pour tester des variantes du gène BRCA1 dans un essai de culture de tissus basées pour la réparation recombinaison homologue des dommages à l'ADN en appauvrissant protéine BRCA1 endogène à partir d'une cellule à l'aide d'ARNi et le remplacer par un mutant BRCA1 points qui contient un changement de codage.

Identifier les effets des mutations du gène BRCA1 sur la recombinaison homologue en utilisant les cellules qui expriment endogène de type sauvage du gène BRCA1

Nous décrivons ici un test in vivo de mutagenèse dans des petits nombres de cellules hématopoïétiques purifiées en utilisant le modèle de souris transgénique LacI. Le gène Lacl peut être isolé afin de déterminer la fréquence, le lieu et le type de mutants d'ADN spontanément surgi ou après l'exposition à génotoxines.

Identifier ADN mutations dans purifié hématopoïétiques cellules souches / progénitrices

Des facteurs épigénétiques peuvent interagir avec les programmes génétiques de moduler l’expression des gènes et de réguler la fonction des cellules B. En combinant la stimulation in vitro de cellules B, qRT-PCR et haut débit micro-ARN-séquence et ordre d’ADN messagère approches, nous pouvons analyser la modulation épigénétique de miRNA et l’expression génique dans les cellules de B.

Modulation de génome induite par l’analyse des HDAC inhibiteur des microARN et ARNm dans B cellules amenées à soumises classe-commutateur de recombinaison de l’ADN et la différenciation des cellules de Plasma

Détection de l’acide ribonucléique (cRNA) du sang en circulation est un besoin non comblé dans le diagnostic clinique. Nous décrivons ici des méthodes qui caractérisent les cRNA de patients de cancer pulmonaire non à petites cellules en utilisant la réaction en chaîne de polymérase numérique sensible et spécifique. Les tests de satisfaire aux exigences de conception pour détecter les variantes de fusion dans les 72 heures.

Un sang à base d’essai pour la détection des ROS1 et RET transcrits de Fusion de circuler l’acide ribonucléique Using Digital Polymerase Chain Reaction

Nous décrivons ici une analyse de l’hybridation in situ qui permet la détection sensible et spécifique des séquences aussi courtes que 50 nucléotides avec résolution de simple-nucléotide au niveau unicellulaire. L’analyse, qui peut être réalisé manuellement ou automatiquement, pouvez activer la visualisation des variants d’épissage, courtes séquences et des mutations dans le cadre de tissu.

Visualisation des Variants génétiques, quelques cibles et des Mutations ponctuelles dans le cadre de tissu morphologique avec un ARN essai In Situ hybridation avec

Nous présentons ici un protocole détaillé pour identifier les événements de recombinaison homologue qui s’est produite dans les cellules souches embryonnaires de souris à l’aide de Southern et/ou PCR. Cette méthode est illustrée par la génération de modèles murins non musculaires myosine II remplacement génétique à l’aide traditionnelle embryonnaire sur les cellules souches homologue induite par la recombinaison technologie de ciblage.

Identification des événements de recombinaison homologue dans les cellules souches embryonnaires de souris à l’aide de transfert de Southern et la réaction en chaîne par polymérase

Ce manuscrit décrit une méthode de base CRISPR-Cas9 de groupés régulièrement entrecoupées court palindromique répète (CRISPR) pour une enquête rapide et simple du rôle de plusieurs gènes candidats à la prolifération des cellules de la leucémie myéloïde aiguë (AML) Parallèlement. Cette technique est évolutive et peut être appliquée dans les autres lignées cellulaires cancéreuses ainsi.

Enquête de dépendances génétiques utilisant la concurrence fondée sur les Cas9-CRISPR

Présenté ici est un essai pour quantifier l’hypermutation somatique dans le locus de gène de chaîne lourde d’immunoglobuline utilisant les cellules b germinales de centre des corrections de Peyer de souris.

Analyse de l’hypermutation somatique dans l’intron JH4 des cellules B du Centre Germinal à partir des patchs de Mouse Peyer

Cet article présente l’application d’une méthode de détection à basse fréquence basée sur le séquençage de Sanger dans le lymphome angio-immunoblastique. Fournir une base pour l’application de cette méthode à d’autres maladies.

PCR bloquante de type sauvage combinée au séquençage de Sanger pour la détection de mutations somatiques à basse fréquence

Ce protocole décrit une approche de dépistage intraductale évolutive de CRISPR permettant des études parallèles d’élimination et d’activation du gène in vivo dans la glande mammaire de la souris.

Dépistage in vivo parallèle de l’élimination et de l’activation du gène dans la glande mammaire de la souris

Découvrez comment modifier l'expression génique dans les cellules B Ramos par infection virale pour étudier l'hypermutation somatique. Cette méthode permet d'analyser la perte d'IgM et de séquencer les gènes IG.

Évaluer hypermutation somatique dans les cellules B Ramos, après surexpression ou Knockdown de gènes spécifiques

Explorer plus de vidéos