Name: Analyse de lexpression de mammifères Linker-histones sous-types (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Découvrez une méthode complète pour analyser l'expression des sous-types d'histones H1 chez les mammifères par PCR quantitative et chromatographie HPLC. Cette approche permet de quantifier simultanément les niveaux d'ARNm et de protéines.

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<ol><li>Fan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H1+linker+histones+are+essential+for+mouse+development+and+affect+nucleosome+spacing+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">H1 linker histones are essential for mouse development and affect nucleosome spacing in vivo.</a> Mol. Cell Biol. 23, 4559-4572 (2003).</li>
<li>Woodcock, C. L., Skoultchi, A. I., Fan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+linker+histone+in+chromatin+structure+and+function%3A+H1+stoichiometry+and+nucleosome+repeat+length%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Role of linker histone in chromatin structure and function: H1 stoichiometry and nucleosome repeat length.</a> Chromosome Res. 14, 17-25 (2006).</li>
<li>Shen, X., Gorovsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linker+histone+H1+regulates+specific+gene+expression+but+not+global+transcription+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Linker histone H1 regulates specific gene expression but not global transcription in vivo.</a> Cell. 86, 475-483 (1996).</li>
<li>Alami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+linker-histone+subtypes+differentially+affect+gene+expression+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mammalian linker-histone subtypes differentially affect gene expression in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 5920-5925 (2003).</li>
<li>Happel, N., Doenecke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H1+and+its+isoforms%3A+contribution+to+chromatin+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Histone H1 and its isoforms: contribution to chromatin structure and function.</a> Gene. 431, 1-12 (2009).</li>
<li>Clausell, J., Happel, N., Hale, T. K., Doenecke, D., Beato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H1+subtypes+differentially+modulate+chromatin+condensation+without+preventing+ATP-dependent+remodeling+by+SWI%2FSNF+or+NURF%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Histone H1 subtypes differentially modulate chromatin condensation without preventing ATP-dependent remodeling by SWI/SNF or NURF.</a> PLoS One. 4, 0007243-0007243 (2009).</li>
<li>Khadake, J. R., Rao, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-+chromatin-condensing+properties+of+rat+testes+H1a+and+H1t+compared+to+those+of+rat+liver+H1bdec%3B+H1t+is+a+poor+condenser+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA- chromatin-condensing properties of rat testes H1a and H1t compared to those of rat liver H1bdec; H1t is a poor condenser of chromatin.</a> Biochemistry. 34, 15792-15801 (1995).</li>
<li>Orrego, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+affinity+of+mammalian+histone+H1+somatic+subtypes+for+DNA+and+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential affinity of mammalian histone H1 somatic subtypes for DNA and chromatin.</a> BMC Biol. 5, 22-22 (2007).</li>
<li>Th'ng, J. P., Sung, R., Ye, M., Hendzel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H1+family+histones+in+the+nucleus.+Control+of+binding+and+localization+by+the+C-terminal+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">H1 family histones in the nucleus. Control of binding and localization by the C-terminal domain.</a> J. Biol. Chem. 280, 27809-27814 (2005).</li>
<li>Wang, Z. F., Sirotkin, A. M., Buchold, G. M., Skoultchi, A. I., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+histone+H1+genes%3A+gene+organization+and+differential+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The mouse histone H1 genes: gene organization and differential regulation.</a> J. Mol. Biol. 271, 124-138 (1997).</li>
<li>Brown, D. T., Sittman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+through+overexpression+and+tagging+of+the+variant+type+of+the+mouse+H1e+and+H1c+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification through overexpression and tagging of the variant type of the mouse H1e and H1c genes.</a> J. Biol. Chem. 268, 713-718 (1993).</li>
<li>Fan, Y., Sirotkin, A., Russell, R. G., Ayala, J., Skoultchi, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+somatic+H1+subtypes+are+dispensable+for+mouse+development+even+in+mice+lacking+the+H1%280%29+replacement+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Individual somatic H1 subtypes are dispensable for mouse development even in mice lacking the H1(0) replacement subtype.</a> Mol. Cell. Biol. 21, 7933-7943 (2001).</li>
<li>Fan, Y., Skoultchi, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+H1+linker+histone+subtypes+and+their+functions+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of H1 linker histone subtypes and their functions in mice.</a> Methods Enzymol. 377, 85-107 (2004).</li>
<li>Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Real time quantitative PCR.</a> Genome Res. 6, 986-994 (1996).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

L&#39;ensemble des analyses présentées ici permettent une analyse complète des niveaux d&#39;expression de mammifères linker sous-types d&#39;histones. Bien conçus qRT-PCR fournir des mesures très sensibles et précises de messages d&#39;ARN à partir des gènes de mammifères histone H1. La partie critique de qRT-PCR pour l&#39;éditeur de liens de sous-type gènes des histones est la préparation de l&#39;ADNc en utilisant une amorce aléatoire basé transcription inverse. ARNm des gènes les plus histones, y compris la plupart...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> RNase Zap </td><td> Applied Biosystems </td><td> AM9780 </td></tr><tr><td> Réactif Trizol </td><td> Invitrogen </td><td> 15596-018 </td></tr><tr><td> SuperScriptIII </td><td> Invitrogen </td><td> 18080-051 </td></tr><tr><td> L&#39;éthanol absolu </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2818-4 </td></tr><tr><td> IQ SYBR Green </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-8880 </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> Deoxyribonuclease I </td><td> Sigma </td><td> AMP-D1 </td></tr><tr><td> Microseal plaque de 96 puits PCR </td><td> Bio-Rad </td><td> MSP-9605 </td></tr><tr><td> Joints adhésifs «B» Microseal </td><td> Bio-Rad </td><td> MSB-1001 </td&gt; </tr><tr><td> Saccharose </td><td> Organics Agros </td><td> AC40594 </td></tr><tr><td> Phosphate de sodium dibasique heptahydraté (Na 2 HPO 4 · 7H 2 O) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP332 </td></tr><tr><td> Le chlorure de sodium (NaCl) </td><td> Américaine bioanalytique </td><td> AB01915 </td></tr><tr><td> Heptahydraté phosphate monosodique (NaH 2 PO 4 · 7H2O) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP-330 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP310 </td></tr><tr><td> Complete tablette Mini cocktail inhibiteur de la protéinase </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11836153001 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E-5134 </td></tr><tr><td> Fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSF) </td><td> Américaine bioanalytique </td><td> AB01620 </td></tr><tr><td> Nonidet-40 (NP-40) </td&gt; <td> Américaine bioanalytique </td><td> AB01425 </td></tr><tr><td> Le chlorure de potassium (KCl) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP366 </td></tr><tr><td> Tris [hydroxyméthyl aminométhane] </td><td> Américaine bioanalytique </td><td> AB02000 </td></tr><tr><td> Le chlorure de magnésium (MgCl2) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP214 </td></tr><tr><td> L&#39;acide sulfurique (H2SO4) </td><td> VWR </td><td> VW3648-3 </td></tr><tr><td> L&#39;hydroxyde d&#39;ammonium (NH 4 OH) </td><td> Organics Agros </td><td> AC42330 </td></tr><tr><td> Bradford Protein Assay </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0001 </td></tr><tr><td> Acétonitrile </td><td> EMD </td><td> AX0145-1 </td></tr><tr><td> L&#39;acide trifluoroacétique (TFA) </td><td> JTBaker </td><td> 9470-01 </td></tr></tbody></table>

analyse de l&#39;expression de mammifères linker-histones sous-types

Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes

Linker histone H1 se lie à la particule de noyau nucléosome et l&#39;ADN linker, pour faciliter le pliage de la chromatine dans la structure d&#39;ordre supérieur. H1 est essentielle pour le développement des mammifères 1 et régule l&#39;expression génique spécifique in vivo 2-4. Parmi les protéines hautement conservées des histones, la famille des histones H1 est le groupe le plus hétérogène. Il ya 11 sous-types H1 chez les mammifères qui sont différentiellement régulés au cours du développement et dans différents types cellulaires. Ces sous-types H1 comprennent 5 somatiques H1 (H1a-e), le H1 0 remplacement, 4 germinales sous-types de cellules H1 spécifiques, et H1x 5. La présence de sous-types H1 multiples qui diffèrent de l&#39;affinité de liaison à l&#39;ADN et la capacité compaction de la chromatine 6-9 fournit un niveau supplémentaire de modulation de la fonction chromatine. Ainsi, l&#39;analyse d&#39;expression quantitative des sous-types H1 individuels, à la fois de l&#39;ARNm et de protéines, est nécessaire pour une meilleure compréhension de la régulation de l&#39;enseignement supérieurstructure de la chromatine ordre et la fonction. Nous décrivons ici un ensemble de tests conçus pour analyser les niveaux d&#39;expression des sous-types H1 individuels (Figure 1). expression des ARNm de différents gènes variants H1 est mesurée par un ensemble de très sensibles et quantitative RT-PCR (qRT-PCR), qui sont plus rapides, plus précis et nécessitent des échantillons beaucoup moins par rapport à l&#39;approche alternative de l&#39;analyse par Northern blot. Contrairement à la plupart des autres messages d&#39;ARNm cellulaires, les ARNm des gènes les plus histones, y compris la majorité des gènes H1, ​​n&#39;ont pas une longue queue polyA, mais qui contiennent une structure en tige-boucle à la région 3 &#39;non traduite (UTR) 10. Par conséquent, les ADNc sont préparés à partir d&#39;ARN totaux par transcription inverse en utilisant des amorces aléatoires au lieu d&#39;oligo-dT amorces. En temps réel PCR avec des amorces spécifiques à chaque sous-types H1 (Tableau 1) sont effectuées pour obtenir une mesure hautement quantitative des taux d&#39;ARNm de sous-type H1 individuelles. Expression des gènes de ménage sont analysés comme des contrôles pour la normalisation. L&#39;abondance relative des protéines de chaque sous-type H1 et histones est obtenue par chromatographie en phase liquide inverse à haute performance (CLHP-PI) l&#39;analyse des histones totaux extraits de cellules de mammifères 11-13. La méthode par CLHP et les conditions d&#39;élution décrites ici donnent des séparations optimales de sous-types H1 souris. En quantifiant le profil HPLC, nous calculons la proportion relative des sous-types H1 individuels au sein de la famille H1, ainsi que de déterminer le ratio de H1 à nucléosome dans les cellules.

Nous décrivons un ensemble de tests pour analyser les niveaux d&#39;expression des histones H1. ARNm de gènes H1 individuels sont mesurés quantitativement par transcription inverse amorce aléatoire basé suivie par PCR en temps réel, alors que la quantification des protéines histones H1 de est obtenue par une analyse HPLC.

Analyse de l&#39;expression de mammifères Linker-histones sous-types

L'histone de liaison H1 se lie à la particule centrale du nucléosome et à l'ADN linker, facilitant ainsi le repliement de la chromatine en une structure d'ordre supérieur. H1 est essentielle...

L'objectif général de cette procédure est d'analyser les niveaux d'expression des sous-types d'histone H1, à la fois par l'analyse des niveaux d'ARNm de H1 et par la mesure des niveaux protéiques de H1. Pour réaliser l'analyse de l'ARNm, l'ARN total est d'abord extrait à partir de cellules en culture ou de tissus murins. La deuxième étape de la procédure consiste à effectuer une transcription inverse de l'ARN total à l'aide d'amorces aléatoires, suivie de tests de PCR quantitative en temps réel pour chacun des gènes des sous-types de H1. L'analyse de la protéine histone H1 commence par la préparation d'extraits totaux d'histones à partir de tissus murins ou de cellules en culture.Cela est suivi par la fractionnation et la quantification de chaque sous-type d'histone H1 et de l'histone centrale H2B par analyse HPLC en phase inverse. Finalement, la PCR quantitative en temps réel et l'analyse HPLC en phase inverse montrent les niveaux d'expression des ARNm et des protéines. Pour chaque sous-type d'histone H1.Nous sommes des étudiants diplômés du laboratoire FES du Dr. Yuhan à l'École de biologie du Georgia Institute of Technology. Aujourd'hui, nous allons vous présenter un ensemble d'

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