Microcapsules d'alginate comme une plate-forme 3D pour la Propagation et différenciation des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) à différentes lignées

Ce protocole est optimisé pour encapsuler des cellules souches embryonnaires humaines pluripotentes et les différencier en neurones dopaminergiques dans un système 3D. Tout d’abord, traitez les colonies avec un inhibiteur de roche ou IR et associez-les en cellules uniques avec de l’acuate mélangé à de l’alginate de sodium et passé à travers le dispositif d’encapsulation. Poursuivez le traitement par IR pendant trois jours, transférez les cellules encapsulées sur les cellules PA six et différenciez-les pendant 28 jours.

En fin de compte, l’analyse de l’expression des gènes et des protéines montre une plus grande efficacité de génération de neurones dopaminergiques. Le principal avantage de cette technique particulière par rapport au protocole de différenciation 2D existant est que nous essayons de propager et de différencier ces cellules dans un environnement 3D et que cet environnement 3D vous offre la possibilité de multiplier les cellules de manière à haute densité. Et puis cela donne également l’occasion d’avoir une meilleure interaction de cellule à cellule pour la différenciation.

Et troisièmement, vous donner également une meilleure efficacité de différenciation sur la piste. Et aussi, si je peux me permettre d’ajouter que cette technique particulière peut également être adaptée à d’autres types de cellules, que nous pouvons propager dans un environnement 3D. Maintenant, rappelez-vous aussi, par exemple, que cette technique particulière a été optimisée sur la base de l’utilisation d’un inhibiteur de roche particulier qui empêche l’apoptose cellulaire et empêche également le détachement de la cellule des boîtes de culture.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal au début, car cette technique n’est généralement pas pratiquée en culture tissulaire. La technique d’encapsulation suivante a été optimisée sur la base des études sommaires du Dr Dean sur l’application de l’inhibiteur de R de l’alginate, la concentration d’alginate et les paramètres du dispositif d’encapsulation. Jamie et Kim, une étudiante au doctorat de notre laboratoire, vont maintenant faire la démonstration de ce protocole.

Ajoutez 25 millilitres de solution de gélatine stérile à 0,1 % à 275 milligrammes d’alginate de sodium purifié dans un vortex de tube stérile de 50 millilitres pour dissoudre partiellement la poudre d’alginate. Placez ensuite le tube sur un mélangeur orbital à 10 fois G pendant la nuit. Ensuite, ajoutez du chlorure de sodium stérile à 9 % à la solution d’alginate.

Vortex pendant 30 secondes, puis centrifuger à 95 fois G pendant cinq minutes. Conservez la solution d’alginate à quatre degrés Celsius. Tout d’abord, dans un environnement sombre, prétraitez les cellules souches embryonnaires humaines avec un milieu de culture complété par 10 micromolaires d’inhibiteur de roche.

Incuber pendant deux heures à 37 degrés Celsius. Maintenant, lavez les cellules deux fois avec du DPBS pour déloger les cellules par voie enzymatique. Ajouter l’accutane et incuber pendant 10 minutes.

À 37 degrés Celsius, récoltez doucement les cellules à l’aide d’un grattoir cellulaire et transférez-les dans un tube de 15 millilitres. Neutralisez l’Accutane avec un volume égal de milieu SL. Ensuite, passez les cellules neutralisées à travers un filtre de 40 microns dans un tube à centrifuger frais de 50 millilitres.

Utilisez maintenant un hémocytomètre pour énumérer les cellules. Granulez les cellules par centrifugation, jetez soigneusement le supinate. Ensuite, lavez les cellules une fois avec du préchauffage.

0,9 % de chlorure de sodium. Centrifugez votre gain et jetez le supinate. Pour encapsuler les cellules souches embryonnaires humaines, commencez par suspendre les cellules avec une solution d’alginate préchauffée.

Pour ce faire, fixez une seringue de 20 millilitres à un tube en plastique souple et aspirez l’alginate dans la seringue. Mélangez ensuite délicatement la suspension cellulaire à l’aide de la seringue sans créer de bulles. Aspirez maintenant les cellules dans la seringue.

Jetez le tube en plastique, puis fixez la seringue à la machine d’encapsulation. Procéder à la configuration des instruments du générateur de billes, de la pompe à seringue, du débitmètre d’air et du bain de précipitation de chlorure de calcium. Vérifiez qu’il y a un espace de 10 centimètres entre l’extrémité de la machine d’encapsulation et le point de collecte de la boîte de Pétri.

Ensuite, réglez le pousse-seringue à 10 millilitres par heure. Débit d’air à huit litres par minute et une pression de 100 kilo pascals. Recueillez les cellules encapsulées dans un bain de précipitation préchaud pendant sept minutes.

Ensuite, transférez-les par aspiration douce dans un tube à centrifuger de 50 millilitres contenant 20 millilitres de chlorure de sodium à 0,9 %, laissez les capsules se déposer au fond du tube, jetez délicatement le supinate, puis lavez une fois avec du chlorure de sodium à 0,9 %. Procéder à la remise en suspension des cellules encapsulées dans un milieu de culture préchauffé, complété par un inhibiteur de roche. Transvaser dans une fiole de culture et incuber pendant trois jours.

Ensemencez les six cellules de la lignée stromale PA de souris dans une fiole T 75 enrobée de gélatine à 0,1 % et un milieu de différenciation neurale dopaminergique revitalisant pendant 24 heures. Transférez les capsules dans un tube à centrifuger de 50 millilitres et laissez-les se déposer au fond du tube. Jetez le supinate et remettez les capsules en suspension dans la différenciation neurale dopaminergique à six cellules.

Culture moyenne. Les cellules souches embryonnaires humaines encapsulées avec la monocouche de six cellules PA pendant 21 jours. Lors du réapprovisionnement du changement de support.

Seule la moitié des milieux continuent à chaque fois à cultiver les cellules PA six dans la différenciation neurale dopaminergique. Moyen complété par des facteurs inducteurs pendant une semaine. Aspirez d’abord les capsules et transférez-les dans un tube à centrifuger de 15 millilitres.

Lorsque les capsules se sont déposées au fond, jetez le supinate. Lavez deux fois avec du DPBS, en jetant le supinate. Ajoutez ensuite cinq millilitres de solution de décapation et mélangez soigneusement la suspension.

Incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Après la centrifugation des granulés, les cellules de débouchage et les lavages deux fois avec du DPBS procèdent à l’utilisation de cellules de décapage, soit sous forme de culture monocouche, soit pour une analyse en aval immédiat. Dans une préparation typique, le diamètre des microcapuchons d’alginate est compris entre 400 et 500 microns.

Ici, dosage C-F-D-A-P-I. Les résultats déterminent les cellules encapsulées viables vertes à 80 %Les analyses de la viabilité, de la prolifération et de l’apoptose des cellules souches embryonnaires humaines encapsulées à différents moments servent à optimiser les conditions de culture. Il est intéressant de noter que les effets inhibiteurs de roche empêchent l’apoptose induite par la dissociation et maintiennent la viabilité cellulaire avec une indication de croissance supérieure de cellules souches embryonnaires humaines encapsulées cultivées en H-F-F-C-M plus ri.

Cet exemple applique l’encapsulation cellulaire comme plateforme 3D pour différencier les cellules souches embryonnaires humaines encapsulées en neurones dopaminergiques. Comme prévu, la taille des corps embryonnaires augmente avec le temps lors de la capsulation, les cellules présentent une morphologie neuronale progressive après deux à trois jours de culture, avec une viabilité supérieure à 90 %. L’analyse de l’expression génique indique une régulation négative du marqueur pluripotent OCT quatre.

Il est important de noter que le marqueur neuroprogéniteur PAC six et le marqueur neuronal dopaminergique th restent régulés à la hausse après sept jours de différenciation. D’autres cellules souches embryonnaires humaines différenciées indiquent plus de 90 % de neurones positifs après 21 jours. L’analyse des pertes de Western confirme les profils d’expression favorables de TH et PAC six dans des systèmes de culture cellulaire 3D par rapport à des systèmes de culture cellulaire 2D.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée efficacement en deux heures. N’oubliez pas de traiter les cellules avec un inhibiteur de roche avant et après l’encapsulation. Les inducteurs ou inhibiteurs de variants peuvent adapter le protocole de différenciation 3D pour de futures expériences.

Cette technique particulière consiste à encapsuler les EEG humaines et à les différencier dans un environnement 3D ou pour le potentiel de thérapie cellulaire pour un certain nombre de maladies, en particulier la maladie de Parkinson.