La production de puces de tissus, de coloration immunohistochimique et Numérisation Dans l'Atlas des protéines humaines

L'objectif général de cette procédure est d'utiliser une méthode efficace pour obtenir simultanément des informations provenant de plusieurs tissus sur l'expression protéique dans un projet à haut débit tel que l'atlas des protéines humaines. Cela est réalisé en sélectionnant d'abord des zones représentatives de tissus inclus en paraffine formolés et fixés. Ensuite, les zones marquées sont perforées et les cœurs sélectionnés sont assemblés en un seul bloc de paraffine, une matrice de microtissus.

Ensuite, des sections sont découpées à partir de la matrice de microperforations tissulaires (TMA) et une immunohistochimie est réalisée. Enfin, le profil d'expression protéique est analysé et les données sont publiées sur l'atlas des protéines humaines. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, montrant l'expression protéique dans les tissus et les cellules grâce aux matrices de microperforations tissulaires et à l'immunohistochimie.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la réalisation d'une immunohistochimie à partir de blocs de tissu parenchymateux individuels, est qu'elle permet de préserver un matériel biologique précieux et que les expériences sont plus reproductibles. Un autre avantage de cette technique est qu'elle permet de réduire les coûts en matériel, ainsi que le temps de traitement en laboratoire. Cette procédure sera démontrée par Ian Call Bay, technicien de laboratoire dans mon équipe, afin d'obtenir une longueur standardisée des carottes tissulaires.

Marquer le stylet. Il est recommandé de laisser des marges de 2,5 à 3,0 millimètres de chaque côté du bloc de paraffine afin d'éviter que la paraffine ne se fende lors du montage des poinçons appropriés. Desserrer les vis à six pans creux qui maintiennent le poinçon en place et positionner le poinçon de manière à ce que la rainure située sur son moyeu soit fermement appuyée contre la tige métallique du bloc en plastique en forme de V.

Fixez les vis en veillant à ce que le bord du clip métallique soit horizontal. Insérez le poinçon récepteur à gauche et le poinçon donneur à droite. Utilisez les boutons de réglage XY et leurs affichages numériques au micromètre pour déplacer les poinçons le long des axes X et Y.

Pour réinitialiser la machine, appuyez sur le bouton de remise à zéro, puis sur le bouton BS pour basculer entre les pouces et les millimètres. Lorsque vous utilisez un poinçon de un millimètre pour un gabarit de neuf par huit, l'espacement entre les trous doit être de deux millimètres, mesuré entre les centres des trous, afin d'éviter de trop enfoncer le poinçon récepteur et de l'endommager. Réglez la profondeur maximale d'enfoncement du poinçon en plaçant une cassette vide dans le support et en utilisant la vis de butée de profondeur située dans le coin supérieur gauche du guide Z. Réglez la position inférieure du poinçon récepteur à un millimètre au-dessus du fond de la cassette. Après avoir sélectionné et marqué la zone pertinente sur une coupe de tissu et conçu un gabarit pour la production de puces tissulaires, placez le bloc récepteur dans le support et utilisez le tournevis le plus petit pour serrer les vis.

Évitez de trop serrer les vis afin d'empêcher le paraffine de se détacher de la cassette. Enfoncez la mèche réceptrice d'environ cinq millimètres dans le bloc récepteur, puis utilisez la poignée de la mèche pour la faire tourner d'avant en arrière. Ensuite, relâchez lentement la pression vers le bas afin que les ressorts puissent remonter la mèche.

Utilisez le stylet pour vider le poinçon et jeter le noyau de paraffine. Ensuite, déplacez la tourelle pour passer au poinçon donneur. Puis, placez le pont du bloc donneur avec le bloc donneur au-dessus du support du bloc récepteur.

Utilisez une lame colorée à l'hématine et à l'éosine correspondante sur laquelle la région d'intérêt a été marquée afin de localiser le tissu à prélever. Tenez manuellement le bloc donneur en place avec la main gauche et poussez la trépane avec la main droite. N'appuyez pas sur le stylet. Le butée de profondeur n'arrête pas le mouvement de la trépane à la position appropriée pour le bloc donneur ; il est donc important d'arrêter de pousser lorsque la deuxième marque est visible sur le stylet.

Faites tourner lentement une fois la poignée du poinçon. Relâchez la pression vers le bas tout en maintenant le bloc donneur sur le pont du bloc donneur. Retirez le pont et le bloc donneur.

Veillez à ce que le poinçon donneur soit aligné avec le trou réalisé précédemment. Ajustez la position du poinçon à l’aide des vis de réglage. Si le poinçon donneur et le trou dans le bloc receveur ne sont pas alignés, poussez délicatement le poinçon vers le bas jusqu’à ce que sa pointe atteigne le haut du trou dans le bloc receveur.

En maintenant cette position, utilisez le stylet pour vider le cylindre de tissu dans le trou. La surface du cylindre doit être alignée avec la surface du bloc. Revenez au poinçon récepteur en replaçant la tourelle.

Passez à la position suivante à l’aide des molettes de réglage XY et répétez le processus en perforant un échantillon à partir du bloc récepteur jusqu’à ce que la matrice soit complète. Pour retirer le bloc récepteur, desserrez les vis du support. Placez le bloc face contre une lame de verre posée sur un support approprié, puis faites cuire le bloc à 42 degrés Celsius pendant 40 minutes.

Retirer la lame et le bloc du four et aplatir la surface du bloc en passant délicatement la lame de verre. Placer le bloc avec la lame de verre sur une plaque de refroidissement pendant 10 minutes. Retirer la lame de verre du bloc.

Le bloc est désormais terminé et prêt à être sectionné. Après la coloration des sections et la numérisation de la matrice de tissus avec un anticorps dirigé contre une protéine d'intérêt, recherchez la protéine dans l'Atlas des protéines humaines en vous rendant sur le site web www.proteinatlas.org.

Saisissez le nom d'un ensemble d'intérêts protéiques, l'identifiant d'accès UniProt ou le nom HGNC, par exemple, insuline. Cliquez sur la protéine d'intérêt et faites défiler vers le bas jusqu'au résumé des tissus et organes normaux. L'aperçu montre l'expression protéique dans le pancréas.

Cliquez sur l'onglet. Plus de données sur les tissus. La vue des tissus normaux triés par organe apparaîtra.

Cliquez sur le pancréas pour visualiser les résultats d'immunohistochimie pour trois anticorps dirigés contre la même protéine. Cliquez sur une image pour afficher une image à haute résolution du pancréas. Dans cette figure, des exemples de la qualité de microtableaux tissulaires sont présentés ici : un réseau rectiligne et correctement aligné, avec un espace suffisant entre les rangées, les colonnes et le bord du paraffine. Ici, certains des cœurs sont trop proches du bord, ce qui entraînera probablement des problèmes lors de la coupe.

Cette matrice microtissulaire a été incinérée trop longtemps et s'est effondrée faute de bon modèle. Ici, une section correctement coupée, aux colonnes droites et alignées, est colorée à l'hémat, à la toïne et à l'éosine. Une lame défectueuse ou sale pourrait entraîner un éclatement comme montré ici, ou des sections comprimées comme celle-ci.

Les cellules du centre germinatif dans les ganglions lymphatiques présentent une titration optimale d'anticorps, conduisant à une coloration cytoplasmique spécifique sans fond parasite, comme observé ici. Une coloration négative ou faible est observée lorsque la concentration de l'anticorps primaire est trop faible ou si la protéine cible n'est pas présente dans les tissus immunomarqués. Cette coupe de tissu est surexposée en raison d'une concentration trop élevée d'anticorps primaire.

La couleur foncée entraîne des difficultés pour déterminer la localisation subcellulaire en raison du débordement, de la réactivité croisée et des positivités fausses. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment produire un tableau de marqueurs tissulaires et comment l'utiliser lors de l'analyse de l'expression protéique par immunohistochimie. Vous devriez également bien comprendre comment explorer l'Atlas des protéines humaines pour l'expression protéique dans les tissus et cellules humaines.