Méthodes pour l'étude de la morphogenèse neuronale: Ex vivo Électroporation ARNi dans embryonnaire cortex cérébral murin

L’objectif général de l’expérience suivante est d’effectuer une évaluation rapide de la fonction des gènes dans le développement du cortex cérébral à l’aide de coupes organotypiques. Ceci est réalisé en introduisant des plasmides, du coex, de l’ARN exprimant et inhibiteur et un marqueur GFP A dans le cortex cérébral. De courtes rafales électriques sont appliquées au cerveau, permettant à l’ADN plasmidique de transfecter les cellules progénitrices neuronales.

Ensuite, les cerveaux sont disséqués, intégrés et sectionnés pour produire des coupes organotypiques qui peuvent subir une morphogenèse neuronale ex vivo. Les coupes organotypiques peuvent être recherchées à la recherche de sous-populations de neurones corticaux présentant des défauts migratoires ou morphologiques en observant directement les cellules marquées à la GFP. Bonjour, bienvenue dans mon laboratoire à l’Université Brown dans le département de biologie moléculaire aujourd’hui, le Dr Liza et deux étudiants, Kat Zer et Mark Seba, feront la démonstration de la technique d’électroporation ex vivo et de la culture en tranches organotypiques, qui est une technique très utile pour les études neurodéveloppementales.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans divers aspects du neurodéveloppement, notamment la neurogenèse, la migration neuronale et la morphogenèse neuronale. Parce que cette analyse est effectuée dans une approximation proche de l’environnement IBU, elle offre une alternative rapide et peu coûteuse à la génération d’animaux transgéniques ou knock-out pour des gènes de fonction inconnue. Enfin, par rapport à la technologie d’électro-opération in vivo, le succès de ces expériences d’électro-opération vivo ne dépend pas d’une chirurgie compétente, du développement des compétences et peut être réalisée avec un temps de formation plus court et une compétence.

Après avoir euthanasié une souris femelle enceinte, disséquez les embryons en HBSS complet et glacé, en les gardant dans leurs sacs placentaires individuels. Ensuite, dans la solution froide de HBSS, libérez un embryon du sac et coupez sa tête après la première vertèbre pour une injection, placez la tête sur un morceau de papier paraforme sur une boîte de Pétri à l’aide d’une seringue Hamilton faite sur mesure. Injectez six à huit microlitres d’ADN vert rapide à travers le troisième ventricule.

À partir de là, le mélange remplira les deux ventricules latéraux des vésicules corticales. Pour l’électroporation, des électrodes en platine de pince à épiler BTX sont utilisées. Placez l’électrode positive vers le côté du cortex qui sera électroporé.

Par exemple, l’électrode doit être sur le dessus de la tête Pour le cortex dorsal. Pour une efficacité de transfection élevée, ajustez toujours la concentration d’ADN à un microgramme par microlitre et utilisez de l’ADN isolé d’une préparation Maxi. Si nécessaire, utilisez un kit sans endotoxines pour purifier l’ADN après l’électroporation.

Incuber la tête sur de la glace pendant au moins cinq minutes avant de la disséquer. Il est très important d’utiliser la bonne quantité d’impulsions électriques et de courant lors de l’électroporation pour éviter d’endommager les cerveaux embryonnaires plus jeunes. Après l’électroporation, le tissu devient très fragile.

Il est important de faire les dissections très soigneusement car la peau et l’école peuvent tirer sur les méninges des vésicules corticales, ce qui pourrait endommager les vésicules corticales lorsqu’elles sont retirées du crâne. Après cinq minutes, disséquez le cerveau à froid. HBSS commence par faire une petite incision sur le côté de la tête et décoller la peau des côtés de la tête.

Ensuite, à l’aide d’une pince fine, retirez doucement la pia du cerveau. Retirez le cerveau intact du crâne. Lorsque vous avez terminé, gardez le cerveau dans un HBSS glacé et préparez-vous à intégrer le tissu.

Commencez à remplir les moules avec un point de fusion bas de 3 %. Agros. Placez les moules sur de la glace pour que les agros se solidifient près du fond du moule. Tout d’abord, s’assurer que le cerveau reste soutenu et centré.

Maintenant, à l’aide d’une pince fine, retirez délicatement un cerveau du HBSS, absorbez l’excès de tampon avec une lingette Kim ou du papier filtre, et placez le cerveau dans le point de fusion bas. Agros. Ensuite, utilisez une pointe de pipette pour faire tourner le cerveau à l’intérieur du moule afin de maximiser le contact entre les agros et les tissus. Avec tous les cerveaux transférés, positionnez chaque cerveau à peu près dans la même orientation et la même profondeur dans son moule.

Les aros se solidifieront en cinq minutes environ. Alors travaillez vite. Laissez les aros se solidifier complètement en incubant cinq minutes supplémentaires sur de la glace.

Coupez l’excédent d’aros avant de monter les blocs. Fixez ensuite les blocs agros les uns aux autres à l’aide d’un adhésif plastique à collage rapide, chaque cerveau d’une pile doit être positionné avec ses bulbes olfactifs vers le haut. Une fois les blocs attachés, coupez les aros pour vous assurer que chaque cerveau sera coupé par le vibrato.

Ensuite, plongez-les immédiatement dans du HBSS glacé. Pour trancher les blocs, réglez la vitesse du vibratos à une vitesse basse, environ la moitié du maximum, et réglez la fréquence de vibration de la lame au réglage le plus élevé. Générez ensuite des tranches coronales de 250 microns d’épaisseur, récupérez les tranches à l’aide d’une spatule fine pliée et transférez-les dans les puits de tissus à l’aide d’une brosse fine ou d’une pince.

Si le tissu tombe de l’agros, le contact avec les tissus n’a pas été suffisamment formé dans une hotte de culture tissulaire, préparez une plaque à six puits avec 1,8 millilitres de milieu de culture en tranches par puits et placez des inserts organotypiques code de laminine polity lysine dans chacun. Eh bien, ajoutez 500 microlitres de milieu de culture en tranches en haut des inserts de tranches organotypiques. Transférez ensuite jusqu’à cinq tranches dans chaque insert.

Ensuite, retirez tout excès de milieu du haut des tranches Pour vous assurer que les tranches conservent autant que possible leur morphologie et ont une mort cellulaire minimale. Il est important de maintenir une interface air-liquide saine et de ne pas flotter les tranches dans le support. Enfin, incubez les tranches à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié.

Remplacez la moitié du volume de support sous la membrane tous les deux jours. Les tranches ne doivent pas flotter sur les neurones médias, exprimant des constructions électroporées peuvent être visualisées dès huit heures après l’électroporation après les jours de culture souhaités. Fixez les tranches dans la membrane pour l’analyse.

Lavez chaque insert typique organique avec du PBS chaud pendant cinq minutes. Effectuez trois lavages PBS au total, puis fixez le tissu avec 4 % d’aldéhyde paraforme pendant une heure à quatre degrés Celsius. Après fixation, les tissus peuvent être analysés avec des marqueurs cellulaires ou simplement colorés avec des crochets de coloration. Après une heure, lavez les tranches avec trois lavages de 10 minutes en un XPBS.

Ensuite, perméez les tranches pendant deux heures à température ambiante dans une solution de sérum de chèvre à 10 % dans un XPBS avec une légère agitation. Ensuite, colorez les mouchoirs avec des crochets pendant une heure à température ambiante en secouant doucement. Enlevez la tache avec trois lavages de 10 minutes en un seul XPBS avec une légère secousse pendant l’attente.

Placez les lames en verre dépoli dans une chambre d’eau suffisamment profonde pour baigner les tissus après les avoir placés sur les lames. Pour monter les tranches. Tout d’abord, coupez la membrane avec un scalpel.

Deuxièmement, à l’aide d’une pince fine, transférez jusqu’à cinq tranches liées à la membrane sur chaque lame immergée dans l’eau. Troisièmement, retirez tout excès d’eau de chaque lame. Quatrièmement, appliquez une goutte de solution de montage au sol sur chaque tranche de cerveau.

Et enfin, placez délicatement une lamelle sur les tranches et retirez toutes les bulles d’air. Les tranches sont ensuite prêtes pour la microscopie en fonction de la quantité d’ADN électroporée et du stade embryonnaire. Lors de l’électroporation, l’efficacité de transfection a varié.

Huit heures après la transfection avec un silencieux P, les cellules vectorielles de la GFP ont commencé à exprimer la GFP. Au cours d’une période de culture plus longue, les cellules subissent une séquence normale d’événements neurogènes, notamment la prolifération, la migration et la différenciation neuronale précoce. Ces tranches ont conservé leur morphologie pendant cinq jours, à condition que l’interface radio du milieu ait été bien maintenue lors de la tentative de cette procédure.

Il est important de mener toute l’expérience à partir du moment où l’animal est euthanasié jusqu’au moment où les tranches sont placées dans les inserts de la membrane sous moins de deux heures afin de minimiser la mort cellulaire après cette procédure. D’autres ajouts similaires de facteurs exogènes à la lyse organotypique peuvent être effectués pour répondre à des questions telles que : quel est le rôle des différents facteurs de croissance ou agents pharmacologiques dans les différents mécanismes neurodéveloppementaux ?