Enregistrement simultané des signaux calciques de neurones identifiés et le comportement alimentaire des Drosophila melanogaster

L'objectif général de cette procédure est de surveiller l'activité neuronale par imagerie calcique tout en observant simultanément le comportement alimentaire. Cela est réalisé en insérant d'abord une drosophile dans l'appareil pour drosophiles. Ensuite, la tête de la drosophile est disséquée afin d'exposer le cerveau.

L'appareil contenant la mouche disséquée est ensuite placé sur la platine du microscope. La dernière étape de la procédure consiste à stimuler le pro Bois à l'aide d'un cordon imprégné de sucre. En fin de compte, on peut obtenir des résultats montrant l'activation d'un neurone identifié par imagerie calcique, corrélée à l'extension du Probus grâce à l'enregistrement vidéo du comportement.

J'ai eu pour la première fois l'idée de cette méthode en pensant aux yeux des bières battantes qui nagent à la surface de l'eau. Nous, les bières, avons les yeux fendus et pouvons voir à la fois au-dessus et en dessous de la surface de l'eau. Un point délicat de mon expérience est que le cerveau et les UCSC sont proches l'un de l'autre, mais s'ils sont bien séparés, comme les yeux chez nous les bières, nous pouvons maintenir les UCSC au sec tandis que le cerveau est exposé dans le satellite.

J'ai réalisé une cloison très simple juste au-dessus des UCÉ afin de séparer la face sèche de l'espace de largeur. Façonnez une plateforme à partir du couvercle d'une boîte Falcon de 35 millimètres en faisant fondre la paroi latérale et en la sculptant pour obtenir un angle et une épaisseur appropriés. Percez un trou dans la plateforme afin d'y insérer la tête de la drosophile, de sorte que les pièces buccales restent librement exposées à l'extérieur de la chambre. Coupez l'extrémité d'une pipette Pasteur juste assez large pour accueillir le corps de la drosophile, puis collez cette extrémité sur la plateforme.

Après avoir privé un adulte de nourriture pendant 24 heures à 25 degrés Celsius, anesthésiez la mouche en la plaçant dans un tube en plastique de 15 millilitres, posé sur de la glace, à l’aide de pinces. Insérez une mouche dans la chambre des mouches et poussez-la doucement jusqu’à ce qu’elle ne puisse plus bouger.

Sceller les parties environnantes du proboscis ou rostre proximal au bord intérieur du trou en appliquant une petite quantité de colle durcissable à la lumière sur les côtés et au-dessus du rostre, à l’aide d’un cil ou d’un outil similaire pour étaler soigneusement la colle. Appliquer également la colle de l’intérieur des mouches sur l’espace situé entre la partie dorsale de la tête et le bord intérieur du trou. Enfin, durcir la colle avec l’éclairage bleu le plus faible suffisant pour le durcissement afin d’éviter d’endommager la mouche.

Pour stabiliser la tête de la drosophile et exposer la partie ventrale du SOG, fixez un fil afin de maintenir le rostre partiellement relevé. Une fois la drosophile en place, recouvrez la surface de la plateforme avec une solution saline sans saccharose. Ouvrez la capsule céphalique pour exposer le SOG à l’aide d’une lame de tungstène et de pinces à pointes aiguisées que nous appelons pinces aiguisées.

Scis zips. Il s'agit d'une démonstration de scis zips, consistant à couper une fibre provenant d'un essuie-tout Kim pour effectuer une comparaison. Cette opération est d'abord réalisée avec des ciseaux à iris dans le champ visuel, puis devant une règle graduée d'un millimètre.

Commencez par effectuer une incision le long du bord postérieur à l’aide de la lame de tungstène. Ensuite, coupez les bords latéral et antérieur à l’aide des pinces effilées. Soulevez le morceau de cuticule découpé à l’aide des pinces et retirez-le.

Couper les antennes et les nerfs antennaires à l’aide de la pince. Ensuite, retirer sélectivement les poches d’air situées entre le SOG et la cuticule afin de stabiliser le cerveau et d’éviter les artefacts de mouvement. Puis, couper l’œsophage à son extrémité dirigée vers le pharynx ainsi qu’à l’endroit où il pénètre dans le SOG, afin de supprimer la connexion entre le pharynx et le cerveau.

Ensuite, après avoir identifié et isolé le muscle 16, détachez toute trachée reliant le cerveau et la cuticule. Placez les mouches sur la platine d'un microscope confocal à disque tournant et passez à l'objectif à immersion dans l'eau pour l'acquisition d'images. Prenez alors une section optique unique à quatre hertz, avec un temps d'exposition de 122 millisecondes, en utilisant un laser d'excitation de 491 nanomètres focalisé sur la région d'intérêt.

Utilisez une aiguille de seringue avec une petite mèche en papier japonais dépassant de l'extrémité pour offrir du saccharose à la mouche. Déposez une petite goutte de solution de saccharose sur la mèche, puis aspirez-la à l’aide d’un injecteur relié à l’aiguille par un tube flexible, en tenant l’aiguille à l’aide d’un manipulateur à joystick.

Appliquez le mèche en papier buvard imbibé sur l'extrémité des proboscides, mais uniquement pendant un instant, afin d'éviter la satiété. Surveillez la réponse d'extension du PROBUS ou le comportement PER à l'aide d'une caméra CCD fixée à un microscope stéréoscopique, simultanément avec l'imagerie calcique, et veillez à recueillir les données dans l'heure suivant la dissection.

On observe ici une réponse typique de l'extension de la proboscide à une stimulation avec un WIC contenant du saccharose à 100 millimolaire. Solution aqueuse imagée à l'aide d'un laser de 491 nanomètres pour la fluorescence de G CAMP. L'imagerie calcique simultanée pendant le comportement de réponse d'extension de la proboscide, illustrée ici d'abord avant puis après la stimulation, permet de visualiser les réponses au GAMP 3,0 induites par le saccharose dans le neurone moteur du muscle protracteur du rostre.

Dans l'étoile de l'état de quantification de la réponse GAMP 3.0 induite par le saccharose, on observe que les motoneurones répondent à un stimulus de saccharose par une augmentation nette de la fluorescence, suivie d'une phase de restauration de plusieurs secondes jusqu'au niveau de base. La plateforme permet d'utiliser d'autres méthodes telles que l'électrophysiologie, l'optogénétique ou la psychogénétique, ou l'activation chimique des neurones, ou encore l'imagerie en accéléré de structures marquées par la GFP afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la corrélation entre la plasticité synaptique et la mémoire.