Assemblage in vitro de la semi-artificielle machine moléculaire et son utilisation pour la détection de lésions de l'ADN

L'objectif général de cette procédure est de démontrer comment assembler et utiliser un capteur d'endommagement de l'ADN à double marquage permettant d'identifier deux types majeurs de cassures de l'ADN dans des sections de tissu. Le capteur est composé d'un oligonucléotide d'ADN tumoral 30, doublement marqué avec ZI et Rumine, et d'une enzyme, la vaccinia topo isomérase 1 ou vac topo, qui s'assemble spontanément. Lorsque la vac topo se lie au tumoral 30, le fonctionnement du dispositif démarre lorsque la topo isomérase clive l'oligonucléotide à l'extrémité trois prime de la séquence de reconnaissance, produisant ainsi une unité activée de vac topo marquée Fitzy et un brin en forme d'épingle à cheveux libre marqué par une amine.

Avec un hydroxyle terminal en trois-prime, les unités ont une durée de vie brève et sont rapidement réassemblées en la structure d'origine, qui est ensuite clivée. En l'absence de cassures supplémentaires dans l'ADN extra-moléculaire, ces deux unités se séparent et se réassemblent continuellement de manière cyclique. Lorsque le capteur moléculaire est appliqué à des coupes de tissu présentant des dommages à l'ADN, l'unité détectrice marquée par Fitz s'attache sélectivement aux cassures d'ADN à extrémités franches portant un hydroxyle en cinq-prime.

L'unité de détection marquée R domine se ligatuera à une cassure contondante portant un phosphate en extrémité cinq primes. En présence de la ligase ADN T4, les résultats obtenus montrent la présence et la répartition des cassures d'ADN de type un et de type deux dans les cellules, selon une microscopie de fluorescence. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes de détection des HESIs, comme le test TUNEL, est qu'elle est plus spécifique et fournit des informations supplémentaires en marquant à la fois les phases autonomes et phagocytaires de l'apoptose.

De point de vue de la nanotechnologie, le capteur illustre une approche bio-inspirée qui adapte des structures et architectures biologiques réelles à la conception de dispositifs moléculaires non toxiques. En général, les personnes novices dans cette méthode pourraient éprouver des difficultés, car son succès dépend de l'utilisation d'une préparation hautement active de Toro SOM et d'un traitement adéquat des sections afin d'éviter une sur-digestion par la protéinase K. Les coupes de tissu destinées à cette procédure doivent être préparées avant l'assemblage du dispositif moléculaire. Des sections de cinq à six micromètres d'épaisseur découpées à partir de paraldéhyde.

Des blocs de tissus inclus dans de la paraffine fixés sont recommandés. Placer la lame contenant la section de tissu dans un porte-lames et éliminer la paraffine avec du xylène pendant 15 minutes. Après 15 minutes, transférer dans un bain frais de xylène pendant cinq minutes supplémentaires.

Réhydratez la section en faisant passer la lame à travers ces concentrations d'éthanol graduelles : 96 % d'éthanol deux fois pendant cinq minutes chacune, puis 80 % d'éthanol pendant cinq minutes, suivis d'eau.

Deux fois pendant cinq minutes chacune. Après la réhydratation, digérer la section avec la protéinase K. En utilisant 100 microlitres d'une solution de 50 microgrammes par millilitre par section, incuber pendant 15 minutes à température ambiante dans une chambre humide. Selon le type de tissu, la durée de la digestion peut nécessiter un ajustement, mais veiller à éviter une sur-digestion car elle provoque la disparition du signal et la détérioration de la section lorsque la digestion est terminée.

Rincez la lame deux fois dans de l'eau distillée, 10 minutes chaque fois. Appliquez du BSA à 2 % pour la pré-blocage, puis incubez 15 minutes à température ambiante dans une chambre humide. Pendant ce temps, assemblez la machine moléculaire comme indiqué dans la suite de cette vidéo.

Tous les réactifs pour l'assemblage de la machine moléculaire sont dosés pour un volume total de 25 microlitres, ce qui est suffisant pour une détection unique sur une section tissulaire de taille moyenne. Le volume peut être augmenté selon les besoins dans un petit tube en plastique. Mélanger les réactifs suivants dans l'ordre indiqué à l'aide d'eau distillée.

15 % de polyéthylène glycol 8 000, tampon de l'ADN ligase T4, oligonucléotide doublement marqué, vaccinia topoisomérase I et ADN ligase T4 mélangés doucement par pipetage. La construction moléculaire s'auto-assemble presque instantanément dans cette solution et peut être utilisée immédiatement à température ambiante. Pour commencer la procédure de marquage des cassures d'ADN, aspirez la solution de pré-blocage de la lame.

Appliquer 25 microlitres du mélange réactionnel complet sur chaque section. Placer une lame en plastique par-dessus la section et introduire la lame dans une chambre humidifiée. Protéger de la lumière en enveloppant la chambre avec du papier d'aluminium et incuber une heure à température ambiante.

Bien que les signaux de la ligase et de la topo puissent être observés après une heure d'incubation, dans de nombreux cas, le signal de la ligase peut être davantage amélioré. Pour renforcer le signal, réappliquez le mélange réactionnel sans vac topo et l'oligonucléotide un, mais avec l'oligonucléotide trois et la ligase ADN T4, placez une lame de couverture en plastique sur la section et incubez dans une chambre humidifiée pendant 18 heures. Le jour suivant, à température ambiante, immergez délicatement la lame verticalement dans un bocal Coplin contenant de l'eau à température ambiante afin de retirer la lame de couverture.

Ensuite, laver la section à l'eau distillée trois fois pendant 10 minutes chacune. Rincer la section avec un tampon de bicarbonate de sodium. Ce rinçage à l'aide d'une solution alcaline améliore la fluorescence de la fitzy, sensible au pH et nettement réduite en dessous d'un pH de sept.

Enfin, recouvrir la coupe avec une solution anti-décoloration contenant également du DPI pour marquer les noyaux, puis appliquer une lamelle. Les coupes sont désormais prêtes pour la microscopie en fluorescence. Cette figure montre une section tissulaire de thymus traité à la dexaméthasone, dans laquelle la machine moléculaire a détecté des cassures d'ADN de type ADN un et ADN deux à extrémités franches, présentes dans les zones corticales thymiques subissant une apoptose, ainsi qu'une fluorescence cytoplasmique verte indiquant des cassures d'ADN de type deux, et des macrophages corticaux de type Marx en train de digérer le matériel nucléaire des thymocytes apoptotiques.

Ce signal est produit par vac topo et se localise dans les lysosomes FGA contenant de l'ADN avec un groupement hydroxyle en position cinq prime. Les cassures double brin présentent une fluorescence rouge indiquant un type de cassure de l'ADN, marquant les noyaux des thymocytes apoptotiques non englobés par les macrophages. Un grand nombre de thymocytes subissent simultanément l'apoptose.

Accompagné par la génération de cassures double brin à phosphate en 5' visualisées par marquage basé sur une ligase. Ces cassures se situent en périphérie nucléaire et forment des motifs en forme d'anneau. Tous les noyaux cellulaires sont en bleu, visualisés par contre-coloration au DAPI.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de ne jamais laisser les sections sécher entre les ajouts de différentes solutions. Conservez également toutes les préparations enzymatiques sur glace avant d'ajouter les sections et protégez vos sondes fluorescentes de la lumière pendant la réaction de marquage après son développement. La technique a permis la visualisation de toutes les phases de la désassemblage des cellules hétéro.

Ce capteur constitue en lui-même un exemple de l'approche nanotechnologique verte appliquée à la conception de particules, de sondes et de machines à l'échelle nanométrique. Cette approche associe des composants artificiels à des éléments moléculaires de machines présents naturellement. L'objectif est d'éliminer la toxicité et les réactions biologiques indésirables de ces nanomatériaux fortement dispersés.