L'isolement et l'expansion des cellules humaines de glioblastome multiforme tumeur utilisant le test Neurosphère
30 octobre 2011
Ce protocole vidéo démontre l'isolement et l'expansion des cellules souches comme des cellules de glioblastome mutliforme résection chirurgicale humaine (GBM) tissu tumoral en utilisant la méthode de dosage Neurosphère culture.
L'objectif de ce protocole est l'isolement et l'expansion de cellules tumorales humaines de glioblastome multiforme en utilisant le modèle des neurosphères. Cette procédure consiste d'abord à hacher le tissu tumoral prélevé, puis à effectuer une dissociation mécanique, et enfin à ensemencer les cellules obtenues afin de les faire croître en culture de neurosphères. Dans cette vidéo, nous allons montrer comment isoler et amplifier des cellules de type souche à partir de tissu tumoral humain de glioblastome en utilisant la méthode de culture en neurosphères.
Cette méthode peut également être utilisée pour cultiver des cellules provenant d'autres tumeurs cérébrales ainsi que de tumeurs solides telles que celles du sein, de la prostate, du foie et des poumons. Très bien, commençons. Après réception du tissu tumoral de GBM réséqué provenant de la chirurgie, le milieu est retiré.
La tumeur est lavée deux ou trois fois à l'aide de PBS stérile afin d'éliminer les contaminants tels que le sang et les débris. Après le lavage, placer la tumeur résectionnée dans une boîte de Pétri stérile. Tout d'abord, découper la tumeur en fragments plus petits, puis transférer une portion du tissu tumoral dans une boîte de Pétri séparée et hacher le tissu à l'aide d'un scalpel n°10 en petits morceaux.
Cela augmentera la surface disponible pour la dissociation enzymatique. La trituration peut prendre de une à trois minutes selon la taille de la tumeur. Ajoutez maintenant trois à cinq ml de trypsine préchauffée au tissu haché et transférez-le dans un tube stérile de 15 ml.
Placer le tube de 15 ml dans un bain-marie à 37 degrés pendant 10 à 15 minutes. Agiter le tube toutes les cinq minutes. Pour assurer une meilleure digestion du tissu, ajouter un volume équivalent d'inhibiteur de la trypsine afin d'arrêter la réaction.
L'activation de la trypsine est assurée en pipetant plusieurs fois vers le haut et vers le bas. Centrifuger la suspension à 800 RRP M ou 110 G pendant cinq minutes. Éliminer le surnageant, puis resuspendre le culot dans un ml de milieu basal pour cellules souches neuronales, en plaçant la pointe contre le fond du tube.
Pipetez de haut en bas trois à sept fois pour briser les agrégats jusqu'à l'obtention d'une suspension laiteuse, car une pipetage excessif pourrait entraîner la mort cellulaire. Placez un filtre de 40 microns sur un tube de 50 ml. Ajoutez maintenant 10 à 15 ml de milieu basal à la suspension cellulaire et mélangez délicatement, puis faites passer la suspension cellulaire à travers le filtre de 40 microns afin d'éliminer les débris et les agrégats non associés.
PT les cellules et aspirez le surnageant. Resuspendez les cellules dans un à deux ml de milieu complet. Ensuite, pipetez doucement plusieurs fois afin d'homogénéiser la suspension.
Mélangez 10 microlitres de suspension cellulaire dans 90 microlitres de bleu de Trypan. Homogénéisez bien la suspension et transférez 10 microlitres dans une cellule de comptage hématologique. Effectuez un décompte cellulaire comme indiqué ici.
Une suspension monocellulaire sans agrégats est nécessaire pour obtenir un décompte cellulaire précis. N'incluez pas les cellules positives au bleu de trypan. Lors du décompte pour la mise en culture des cellules dans un flacon T80.
Ajouter 20 ml de milieu complet pour cellules souches neuronales dans un tube de 50 ml. Ajouter la quantité appropriée de suspension cellulaire pour atteindre une densité de 200 000 cellules par ml. Ajouter ensuite le facteur de croissance épidermique (EGF) pour obtenir une concentration finale de 20 nanogrammes par ml.
Ajouter de l'héparine à 0,2 % à une concentration d'un microlitre par ml. Enfin, ajouter du BFGF pour atteindre une concentration finale de 10 nanogrammes par ml. Mélanger les cellules dans un milieu complet supplémenté en facteurs de croissance.
Transférez ensuite la suspension dans un flacon T 80. Placer le flacon dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % CO2 pendant sept à dix jours. Après huit jours de culture, les sphéroïdes sont complètement développés et prêts à être repiqués.
Prélevez le contenu du flacon et transférez-le dans une centrifugeuse de 50 ml. Centrifugez les cellules à 800 tr/min pendant cinq minutes. Aspirez le surnageant, puis resuspendez le culot dans 1 ml de trypsine préchauffée.
Incuber les cellules dans un bain d'eau à 37 degrés Celsius pendant deux minutes. Ajouter une quantité équivalente d'inhibiteur de la trypsine et mélanger soigneusement pour assurer une activation. Ensuite, centrifuger les cellules.
Éliminer le surnageant et resuspendre les cellules dans 1 ml de milieu complet en pipetant doucement plusieurs fois pour homogénéiser la suspension cellulaire. Réaliser un dénombrement cellulaire comme décrit précédemment afin de semer les cellules dans un flacon T80 avec 20 ml de milieu complet dans un tube de 50 ml. Ajouter une quantité appropriée de suspension cellulaire pour atteindre une densité de 50 000 cellules par ml.
Ajoutez maintenant les facteurs de croissance, notamment l'E-G-F-B-F-G-F et l'héparine, à la concentration décrite précédemment. Mélangez délicatement la suspension cellulaire obtenue, puis transférez-la dans une flasque T 80 et placez-la dans l'incubateur pendant sept à dix jours. Voici un exemple de culture primaire de GBM.
Après quatre jours à ce stade, vous pouvez observer que les cellules prolifèrent et commencent à former des sphères. Vous ne devriez pas observer de grands agrégats sphériques de cellules à ce stade. Cela serait dû à une préparation inappropriée du tissu.
Après une culture de sept à dix jours, des sphéroïdes de tailles variables se sont formés ; lorsque ces derniers atteignent un diamètre moyen de 150 à 200 microns, ils sont prêts à être repiqués. Voici un exemple de culture de GBM au huitième jour de passage. On observe à nouveau des sphéroïdes de tailles différentes ; les sphéroïdes sains présentent des micro-excroissances à leur périphérie.
La préparation d'une suspension de cellules individuelles est une question très importante dans toutes les cultures de sphéroïdes. Sinon, vous risquez d'observer des agrégats cellulaires dès le lendemain de la mise en culture des cellules. Ces agrégats peuvent être considérés comme des sphéroïdes, mais il convient de noter qu'il faut au moins une semaine aux cellules en prolifération pour former de véritables sphéroïdes.
La quantité de débris dans la culture de sphéroïdes de tumeur primitive varie selon de nombreux facteurs, tels que l'origine du tissu, la précision avec laquelle le tissu a été prélevé, ainsi que la technique de traitement du tissu. Nous espérons que cette vidéo vous sera utile et vous souhaitons bonne chance dans vos expériences.
Aperçu
Ce protocole vidéo démontre l'isolement et l'expansion de cellules souches à partir de tissus tumoraux de glioblastome multiforme humain (GBM) obtenus par résection chirurgicale, en utilisant la méthode de culture par test des neurosphères. Le protocole décrit les étapes allant de la préparation du tissu à la culture cellulaire, en fournissant des informations sur les techniques utilisées pour une expansion cellulaire réussie.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Oncologie
Contexte
- Le glioblastome multiforme (GBM) est une tumeur cérébrale hautement agressive.
- L'isolement des cellules souches est essentiel pour l'étude de la biologie tumorale.
- Les méthodes de culture en neurosphères permettent la croissance de ces cellules in vitro.
- Ce protocole peut également être appliqué à d'autres tumeurs cérébrales et solides.
Objectif de l'étude
- Isoler et amplifier des cellules souches à partir de tissu de GBM.
- Fournir une méthode fiable pour l'étude de la biologie du glioblastome.
- Faciliter la recherche sur des cibles thérapeutiques potentielles.
Méthodes utilisées
- Prélèvement et lavage du tissu tumoral.
- Hachage et dissociation enzymatique du tissu.
- Comptage cellulaire et mise en culture en sphéroïdes neuronaux.
- Supplémentation avec des facteurs de croissance pour l'expansion cellulaire.
Résultats principaux
- Isolation réussie de cellules souches à partir de tissu de GBM.
- Formation de neurosphères indiquant une croissance cellulaire saine.
- Démonstration de l'importance de la suspension monocellulaire pour la culture.
- Observation de la morphologie des sphères comme indicateur de la santé de la culture.
Conclusions
- Le test des neurosphères est efficace pour la culture des cellules souches de type GBM.
- Une préparation adéquate des tissus est essentielle pour des résultats concluants.
- Cette méthode peut contribuer à la compréhension du GBM et au développement de traitements.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Le test de formation de neurosphères permet l'isolement et l'expansion de cellules souches de type glioblastome, offrant un système pertinent pour la validation de cibles et la réduction des risques mécanistiques dans la découverte de médicaments en oncologie. Cette approche renforce la fiabilité prédictive en modélisant les populations de cellules initiatrices de tumeurs, essentielles à la compréhension de la progression du GBM et de la résistance thérapeutique. Elle facilite les flux de travail de la phase de découverte précoce en générant des modèles cellulaires reproductibles et évolutifs pour le développement de tests et l'identification de candidats thérapeutiques.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation des populations de cellules initiatrices tumorales afin de clarifier les hypothèses thérapeutiques et les dépendances aux voies de signalisation dans le GBM.
- Valeur opérationnelle : Fournit une méthode reproductible pour isoler des cellules souches à partir de tissus humains résectés chirurgicalement, en vue de la validation fonctionnelle de cibles.
- Valeur prédictive : Contribue à la réduction des risques en phase préclinique en modélisant l'auto-renouvellement et le potentiel tumorigène des cellules souches cancéreuses.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Génère des cultures de neurosphères uniformes, adaptées au criblage à haut contenu de composés ciblant les voies de la souche cellulaire.
- Valeur opérationnelle : Établit des conditions de culture standardisées avec une supplémentation définie en facteurs de croissance (EGF, bFGF, héparine) pour assurer la reproductibilité des tests.
- Extensibilité : Permet le repiquage et l'expansion de cultures primaires, facilitant des études longitudinales sur la réponse aux médicaments.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Préserve la pertinence pathologique en maintenant in vitro les caractéristiques génomiques et phénotypiques des tumeurs primaires de GBM.
- Valeur opérationnelle : Facilite l'alignement des biomarqueurs grâce aux paramètres de morphologie et de taille des sphéroïdes (150-200 µm), utilisés comme indicateurs de santé de la culture.
- Atténuation des risques : Permet d'évaluer l'impact thérapeutique sur l'auto-renouvellement des cellules souches, orientant les décisions d'avancement ou d'abandon en phase préclinique.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Le test de formation de neurosphères s'inscrit dans la phase précoce de la découverte, en soutenant la validation de cibles grâce à des tests fonctionnels menés sur des modèles de cellules souches avant l'identification de candidats-médicaments et les évaluations précliniques de l'efficacité.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses en permettant l'isolement de cellules initiatrices tumorales afin d'étudier les facteurs responsables de la progression et de la récidive du GBM.
- Criblage : Fournit une formation quantitative et reproductible de neurosphères comme indicateur fonctionnel pour le criblage de composés et la modulation de voies biologiques.
- Analyse : Offre des paramètres mesurables tels que le diamètre, le nombre et la morphologie des sphères pour évaluer l'intégrité des cultures et la réponse aux médicaments.
- Recherche translationnelle : Relie la découverte à la recherche préclinique en préservant les propriétés des cellules souches, essentielles pour modéliser l'hétérogénéité tumorale.
- Réutilisation en milieu professionnel : Met en place une plateforme réutilisable pour l'étude de multiples tumeurs solides, notamment les cancers du sein, de la prostate, du foie et du poumon, comme indiqué dans le protocole.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Renforce la confiance dans la cible en modélisant la sous-population cellulaire responsable de l'initiation, de la progression et de la récidive tumorale.
- Valeur opérationnelle : Assure la reproductibilité grâce à des étapes standardisées de dissociation, de filtration et de mise en culture permettant d'obtenir des suspensions monocellulaires.
- Valeur stratégique : Améliore l'efficacité du capital en permettant l'élimination précoce des risques associés aux cibles grâce à des tests fonctionnels sur les cellules souches.
- Impact sur le portefeuille : Éclaire la priorisation ajustée au risque en identifiant les composés capables de moduler l'automultiplication et la différenciation des cellules souches cancéreuses.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation stérile des tissus, la dissociation enzymatique et les techniques de culture de neurosphères.
- Dépend de l'accès à des incubateurs stériles pour la culture cellulaire, des centrifugeuses et des hématimètres pour le décompte cellulaire et l'évaluation de la viabilité.
- Exige des protocoles standardisés pour le traitement des tissus afin de minimiser la formation de débris et d'agrégats, qui compromettent la qualité des sphères.
- Requiert l'ajustement des concentrations de facteurs de croissance en fonction de la source tumorale et de la qualité du tissu, car la variabilité influence la formation des neurosphères.
- Est limité par la nécessité d'utiliser un tissu tumoral frais ou correctement préservé afin d'assurer l'isolement et l'expansion de cellules souches-like viables.
