Name: Lisolement et lexpansion des cellules humaines de glioblastome multiforme tumeur utilisant le test Neurosphère (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Découvrez l'isolement et l'expansion de cellules souches de glioblastome humain par le test neurosphère. Cette méthode permet d'étudier la biologie tumorale et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par des subventions du Centre de Recherche en Floride tumeur cérébrale; Preston A. Wells Jr. Center for Therapy tumeur au cerveau.

1. Prélèvement de tissus GBM primaire <ol><li> Un glioblastome mutliforme (GBM) tumeur est obtenue à partir d&#39;un patient diagnostiqué avec le cancer et subissant une chirurgie. </li><li> Dispositions doivent être prises avec l&#39;équipe de neurochirurgie. Le neurochirurgien aura lieu la tumeur réséquée GBM dans un tube de taille appropriée contenant des cellules souches neurales (NSC) milieu de base additionné d&#39;antibiotiques 10-15% (Peniciline / streptomycine). Milieu froid doit être fournie à la salle d&#39;opération par le laboratoire. Alternativement, le froid tamponné HEPES milieu essentiel minimum (HEM) ou de tampon phosphate salin (PBS) à forte concentration d&#39;antibiotiques peuvent également être utilisés à cette fin. </li><li> Le tissu tumoral réséqué est livré au laboratoire sur la glace et placé sous le capot. </li></ol> 2. La dissociation de la tumeur primitive en une seule cellule de suspension <ol><li> L&#39;excès du support original / PBS est éliminé du tube Falcon et l&#39;échantillon est lavé 2-3 fois avec le 5-10ml de PBS / NSC milieu basal pour enlever le sang et les débris. Le PBS / milieu est éliminé et le tissu tumoral GBM est placé dans une boîte de Pétri. </li><li> Le tissu est coupé en petits morceaux et émincé avec une lame de bistouri n ° 10 en petits morceaux pour augmenter la surface pour le processus de traitement à la trypsine. Mincing peut prendre 1-3 minutes selon la taille de la tumeur. </li><li> Le tissu émincé est trypsinisées en 3-5ml de pré-chauffé à 0,05% de trypsine-EDTA pendant 10-15 minutes dans un bain d&#39;eau à 37 ° C. Une pipette électronique est utilisé pour transférer les morceaux minuscules tumeurs et de la trypsine dans un tube de 15ml Falcon. </li><li> Un volume égal de l&#39;inhibiteur de trypsine de soja est ajouté pour arrêter la réaction enzymatique trypsine après la période d&#39;incubation. </li><li> Inactivation trypsine est assurée par la suspension de pipetage de haut en bas plusieurs fois. Ensuite, la suspension est granulé par centrifugation à 800rpm (110g) pendant 5 min. </li><li> Le surnageant est éliminé et les morceaux de tissus sont remis en suspension dans 1ml de solution stérile NSC bamoyennes sal. Les bouquets sont dissociés par un léger pipetage haut et en bas (3-7 fois) jusqu&#39;à ce qu&#39;une bonne suspension laiteuse seule cellule est atteint. Le nombre d&#39;étapes de pipetage dépend directement de la taille des particules dans les tissus hachés. De longs et vigoureux dissociation mécanique devrait être évitée car elle pourrait entraîner la mort cellulaire et une réduction de la formation sphère. </li><li> Pour supprimer l&#39;ONU dissocié des pièces et des débris, 10-15 ml de milieu de base est ajoutée dans le tube et la suspension cellulaire est filtrée à travers une passoire de 40 microns de cellules dans un tube de 50ml. </li><li> La suspension filtrée est centrifugé à 800rpm (110g) pendant 5 min. Le surnageant est éliminé par la suite. </li><li> Cellules Pelletted sont ensuite resuspendues dans 1-2ml de NSC milieu complet pour le comptage cellulaire. </li></ol> 3. Numération cellulaire et placage <ol><li> 10 pl de la suspension cellulaire sont ajoutés à 90 uL de 0,04% bleu trypan dans un tube eppendorf 1ml. Remarque: d&#39;autres cellules appropriées dilutiontions peuvent également être utilisés. </li><li> Pipeter haut et en bas pour mélanger la suspension. 10 uL des cellules / bleu trypan mélange est transféré à hémocytomètre pour compter la densité cellulaire. </li><li> Les cellules sont étalées au NSC milieu complet (un mélange de NSC milieu basal et NSC prolifération supplément à un ratio de 9:1) complété avec 20ng/ml EGF, bFGF et 10ng/ml 1μl/ml de l&#39;héparine de 0,2% (2μg/ml) dans appropriée des récipients de culture tissulaire. 5 ml, 20 et 40 du milieu est utilisé pour des flacons T25, T80 et T175, respectivement. Des antibiotiques peuvent être ajoutés dans le milieu à une concentration de 1:100 pour diminuer risques de contamination. </li><li> Le ballon est placé dans un incubateur réglé à 37 ° C et 5% de CO 2. </li></ol> 4. Le repiquage et l&#39;expansion du GBM sphères dérivés: <ol><li> Lorsque les neurosphères atteint une taille moyenne de 150-200 m de diamètre, la culture est prêt pour la sous-culture. Le contenu de chaque flacon est retiré et placé dans une taille appropriée TISS stérilestube de culture ue, et centrifugé à 800 rpm (110 g) pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Le surnageant est éliminé et le culot est resuspendu dans 1 ml de 0,05% de trypsine-EDTA. </li><li> Pour parvenir à une trypsinisation optimale, la suspension cellulaire est incubée à 37 ° C dans un bain d&#39;eau pendant 2-3 min. Pour arrêter l&#39;activité de la trypsine un volume égal de l&#39;inhibiteur de trypsine de soja est ajoutée à la suspension cellulaire et la suspension cellulaire est doucement introduit à la pipette de haut en bas. </li><li> La suspension cellulaire est centrifugée à 800 tours par minute (110g) pendant 5 min. Ensuite, le surnageant est éliminé et les cellules sont remises en suspension dans 1 ml de milieu NSC. </li><li> Un comptage des cellules est effectué comme décrit précédemment. </li><li> Les cellules sont étalées à une concentration de 5x10 4 cellules / ml dans NSC milieu complet additionné de facteurs de croissance et plaquées dans des navires de taille appropriée la culture de tissus tels que décrits dans la partie précédente. </li><li> Neurosphères secondaires se forment dans les 7-10 jours lorsqu&#39;elle est incubée à 37 ° C dans un environnement humideified incubateur avec 5% de CO 2. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Après étalement de la récolte des cellules individuelles à partir de tissus tumoraux GBM, une tumeur proche des cellules souches prolifèrent et génèrent de petits amas de cellules composée de quelques cellules dans 3-4 jours (voir la vidéo et graphique 1). Comme ces grappes de croître, ils acquièrent une forme plus sphérique afin que par 7-8 jours, des sphères lumineuses bonne phase avec un diamètre moyen de 150-200 microns forme (voir la vidéo et graphique 2). A plus fort grossissement, de sphères saines habituellement démontrer microspikes à leur périphérie. Ayant grande sphère comme les grappes de 1-2 jours après l&#39;initiation de la culture est due à l&#39;existence de non-dissociée des touffes à l&#39;binging de la culture et ne doivent pas être confondus avec les sphères vrai. La quantité de débris dans la culture sphère tumeur primitive varie en fonction de la source initiale de tissu et si oui ou non il comprend tout tissu cérébral environnant. Techniques appropriées de préparation des tissusnotamment la dissociation enzymatique et mécanique et la filtration ultérieure de l&#39;échantillon avec une quantité suffisante de milieu peut aboutir à moins de débris dans la culture. <img src="/files/ftp_upload/3633/3633fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Primaires de la culture sphère GBM 4 jours après placage. Tumeur proche des cellules souches prolifèrent et génèrent de petits amas de cellules dans les 3-4 jours. Grossissement original; 20x. <img src="/files/ftp_upload/3633/3633fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Passage d&#39;une culture sphère GBM 8 jours après placage. Grossissement original; 20x.

<ol><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Adult+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22+Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells.</a> Methods Mol Biol. 750, 61-77 (2011).</li>
<li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).</li>
<li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+Embryonic+Mouse+Neural+Stem+Cell+Culture+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2457-e2457 (2011).</li>
<li>Eramo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+expansion+of+the+tumorigenic+lung+cancer+stem+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population.</a> Cell Death Differ. 15, 504-514 (2008).</li>
<li>Patrawala, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+purified+CD44%2B+prostate+cancer+cells+from+xenograft+human+tumors+are+enriched+in+tumorigenic+and+metastatic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Highly purified CD44+ prostate cancer cells from xenograft human tumors are enriched in tumorigenic and metastatic progenitor cells.</a> Oncogene. 25, 1696-1708 (2006).</li>
<li>Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+resistance+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+to+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl.+Cancer.+Inst%22%5BJournal%5D)">Intrinsic resistance of tumorigenic breast cancer cells to chemotherapy.</a> J Natl. Cancer. Inst. 100, 672-679 (2008).</li>
<li>Galli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+tumorigenic%2C+stem-like+neural+precursors+from+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma.</a> Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).</li>
<li>Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+label-retaining+tumour-initiating+cells+in+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma.</a> Brain. 134, 1331-1343 (2011).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Pour isoler souches neurales et de cellules progénitrices d&#39;adulte normal et le cerveau du fœtus 1, 2, 3, 4 et aussi une tumeur proche des cellules souches provenant de tissus de cancer comme le poumon 5, de la prostate 6, 7 et le cerveau maternel 8, 9 le dosage a été Neurosphère fréquemment utilisées comme la méthode de choix. L&#39;utilisation de ce test simple et reproductible, on peut générer un nombre indéfini de cellules de tissu tumoral réséqué qui montrent les mêmes caractéristiques que les cellules souches somatiques; multipotence ex vivo, la capacité de créer de nouvelles tumeurs lors de l&#39;implantation, et l&#39;auto-renouvellement. Ces cellules pourraient être utilisées pour étudier la biologie fondamentale sur le cancer des cellules dont la cellule à cellule des interactions, et de la différenciation, la migration, l&#39;invasion et la mort cellulaire. En outre, les tumeurs isolées proche des cellules souches de fournir un outil précieux pour étudier comment se forment les tumeurs, les progrès et rechutes et aussi de démêler les sous-tendent les mécanismes cellulaires dérivant qui pourraient éventuellement fournir des indications aux thérapeutiquesoptions.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Tapez </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC milieu de base (l&#39;homme) </td><td> Medium </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05750 </td><td></td></tr><tr><td> NeuroCult NSC Suppléments prolifération (Human) </td><td> Supplément de milieu </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05753 </td><td></td></tr><tr><td> 0,05% de trypsine-EDTA </td><td> Réactif </td><td> Gibco </td><td> 25300-062 </td><td></td></tr><tr><td> * MEM </td><td> Réactif </td><td> Gibco </td><td> 41500-018 </td><td> Composante HEM </td></tr><tr><td> * HEPES </td><td> Réactif </td><td> Sigma </td><td> H4034 </td><td> Composante HEM </td></tr><tr><td> * L&#39;eau distillée </td><td> Réactif </td><td&gt; Gibco </td><td> 15230-147 </td><td></td></tr><tr><td> ** DNase I </td><td> Réactif </td><td> Roche </td><td> 104159 </td><td></td></tr><tr><td> ** Inhibiteur de la trypsine de soja </td><td> Réactif </td><td> Sigma </td><td> T6522 </td><td></td></tr><tr><td> Pen / Strep </td><td> Réactif </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> N ° 10 lame de bistouri </td><td> Outil chirurgical </td><td> BD </td><td> 371610 </td><td></td></tr><tr><td> Boîte de Pétri </td><td> Culture de la céramique </td><td> BD Falcon </td><td> 353003 </td><td></td></tr><tr><td> Une petite pince </td><td> Outils chirurgicaux </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11050-10 </td><td></td></tr><tr><td> Tamis cellulaire </td><td> Tamis </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> T25 flacon </td><td> Culture de la céramique </td><td> Nalge Nunc internationale </td><td> 136196 </td><td></td></tr><tr><td> T80 flacon </td><td> Culture de la céramique </td><td> Nalge Nunc International </td><td> 178905 </td><td></td></tr><tr><td> Tubes de 15 ml </td><td> Culture de la céramique </td><td> BD Falcon </td><td> 352096 </td><td></td></tr><tr><td> Tubes de 50 ml </td><td> Culture de la céramique </td><td> BD Falcon </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> EGF </td><td> Facteur de croissance </td><td> R &amp; D </td><td> 2028-EG </td><td></td></tr><tr><td> b-FGF </td><td> Facteur de croissance </td><td> R &amp; D </td><td> 3139-FB </td><td></td></tr><tr><td> Héparine </td><td> Facteur de croissance </td><td> Sigma </td><td> H4784 </td><td> Reconstitué en PBS </td></tr></tbody></table> * Pour faire HEM, mélanger des paquets 1x10L de MEM and160ml d&#39;HEPES 1M et porter le volume à 8,75 L en utilisant de l&#39;eau distillée. Réglez le pH final à 7,4 uned stocker à 4 ° C. ** Pour préparer la solution d&#39;inhibiteur de trypsine, faites d&#39;abord 10 ml de solution de DNase I (100 mg DNase dissous dans 100 ml de HEM), puis ajouter 0,14 g d&#39;inhibiteur de la trypsine à la solution de DNase et enfin faire le volume à 1 litre avec de HEM. Gardez aliquotes des produits finaux de -20 ° C au congélateur.

l&#39;isolement et l&#39;expansion des cellules humaines de glioblastome multiforme tumeur utilisant le test neurosphère

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

Proche des cellules souches ont été isolées dans les tumeurs comme le sein, poumon, côlon, prostate et du cerveau. Une question essentielle dans toutes ces tumeurs, en particulier dans mutliforme glioblastome (GBM), est d&#39;identifier et d&#39;isoler la tumeur population cellulaire initiateur (s) pour enquêter sur leur rôle dans la formation tumorale, la progression, et les récidives. Comprendre la tumeur initier les populations de cellules fournira des indices pour trouver des approches thérapeutiques efficaces pour ces tumeurs. Le dosage de Neurosphère (NSA) en raison de sa simplicité et sa reproductibilité a été utilisée comme méthode de choix pour l&#39;isolement et la propagation de nombreuses de cette cellules tumorales. Ce protocole illustre la méthode de culture Neurosphère à isoler et à étendre aux cellules souches dans la résection chirurgicale du tissu tumoral humain GBM. Les procédures comprennent une digestion chimique initial et de dissociation mécanique du tissu tumoral, et par la suite plaquage de la suspension cellulaire unique résultant de la culture NSA. Après 7-10 jours, primaire neurosphères du 150-200 m de diamètre peuvent être observés et sont prêts pour d&#39;autres repiquage et d&#39;expansion.

Ce protocole vidéo démontre l&#39;isolement et l&#39;expansion des cellules souches comme des cellules de glioblastome mutliforme résection chirurgicale humaine (GBM) tissu tumoral en utilisant la méthode de dosage Neurosphère culture.

L&#39;isolement et l&#39;expansion des cellules humaines de glioblastome multiforme tumeur utilisant le test Neurosphère

Des cellules souches ou de type souche ont été isolées dans des tumeurs telles que celles du sein, du poumon, du colon, de la prostate et du cerveau. Un problème critique dans toutes ces tumeurs, en particulier dans...

L'objectif de ce protocole est l'isolement et l'expansion de cellules tumorales humaines de glioblastome multiforme en utilisant le modèle des neurosphères. Cette procédure consiste d'abord à hacher le tissu tumoral prélevé, puis à effectuer une dissociation mécanique, et enfin à ensemencer les cellules obtenues afin de les faire croître en culture de neurosphères. Dans cette vidéo, nous allons montrer comment isoler et amplifier des cellules de type souche à partir de tissu tumoral humain de glioblastome en utilisant la méthode de culture en neurosphères.Cette méthode peut également être utilisée pour cultiver des cellules provenant d'autres tumeurs cérébrales ainsi que de tumeurs solides telles que celles du sein, de la prostate, du foie et des poumons. Très bien, commençons. Après réception du tissu tumoral de GBM réséqué provenant de la chirurgie, le milieu est retiré.La tumeur est lavée deux ou trois fois à l'aide de PBS stérile afin d'éliminer les contaminants tels que le sang et les débris. Après le lavage, placer la tumeur résectionnée dans une boîte de Pétri stérile. Tout d'abord, découper la tumeur en fragments plus petits, puis transférer une portion du tissu tumoral dans une boîte de Pétri séparée et hacher le tissu à l'aide d'un scalpel n°10 en petits morceaux.Cela augmentera la surface disponible pour la dissociation enzymatique. La trituration peut prendre de une à trois minutes selon la taille de la tumeur. Ajoutez maintenant trois à cinq ml de trypsine préchauffée au tissu haché et transférez-le dans un tube stérile de 15 ml.Placer le tube de 15 ml dans un bain-marie à 37 degrés pendant 10 à 15 minutes. Agiter le tube toutes les cinq minutes. Pour assurer une meilleure digestion du tissu, ajouter un volume équivalent d'inhibiteur de la trypsine afin d'arrêter la réaction.L'activation de la trypsine est assurée en pipetant plusieurs fois vers le haut et vers le bas. Centrifuger la suspension à 800 RRP M ou 110 G pendant cinq minutes. Éliminer le surnageant, puis resuspendre le culot dans un ml de milieu basal pour cellules souches neuronales, en plaçant la pointe contre le fond du tube.Pipetez de haut en bas trois à sept fois pour briser les agrégats jusqu'à l'obtention d'une suspension laiteuse, car une pipetage excessif pourrait entraîner la mort cellulaire. Placez un filtre de 40 microns sur un tube de 50 ml. Ajoutez maintenant 10 à 15 ml de milieu basal à la suspension cellulaire et mélangez délicatement, puis faites passer la suspension cellulaire à travers le filtre de 40 microns afin d'éliminer les débris et les agrégats non associés.PT les cellules et aspirez le surnageant. Resuspendez les cellules dans un à deux ml de milieu complet. Ensuite, pipetez doucement plusieurs fois afin d'homogénéiser la suspension.Mélangez 10 microlitres de suspension cellulaire dans 90 microlitres de bleu de Trypan. Homogénéisez bien la suspension et transférez 10 microlitres dans une cellule de comptage hématologique. Effectuez un décompte cellulaire comme indiqué ici.Une suspension monocellulaire sans agrégats est nécessaire pour obtenir un décompte cellulaire précis. N'incluez pas les cellules positives au bleu de trypan. Lors du décompte pour la mise en culture des cellules dans un flacon T80.Ajouter 20 ml de milieu complet pour cellules souches neuronales dans un tube de 50 ml. Ajouter la quantité appropriée de suspension cellulaire pour atteindre une densité de 200 000 cellules par ml. Ajouter ensuite le facteur de croissance épidermique (EGF) pour obtenir une concentration finale de 20 nanogrammes par ml.Ajouter de l'héparine à 0,2 % à une concentration d'un microlitre par ml. Enfin, ajouter du BFGF pour atteindre une concentration finale de 10 nanogrammes par ml. Mélanger les cellules dans un milieu complet supplémenté en facteurs de croissance.Transférez ensuite la suspension dans un flacon T 80. Placer le flacon dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % CO2 pendant sept à dix jours. Après huit jours de culture, les sphéroïdes sont complètement développés et prêts à être repiqués.Prélevez le contenu du flacon et transférez-le dans une centrifugeuse de 50 ml. Centrifugez les cellules à 800 tr/min pendant cinq minutes. Aspirez le surnageant, puis resuspendez le culot dans 1 ml de trypsine préchauffée.Incuber les cellules dans un bain d'eau à 37 degrés Celsius pendant deux minutes. Ajouter une quantité équivalente d'inhibiteur de la trypsine et mélanger soigneusement pour assurer une activation. Ensuite, centrifuger les cellules.Éliminer le surnageant et resuspendre les cellules dans 1 ml de milieu complet en pipetant doucement plusieurs fois pour homogénéiser la suspension cellulaire. Réaliser un dénombrement cellulaire comme décrit précédemment afin de semer les cellules dans un flacon T80 avec 20 ml de milieu complet dans un tube de 50 ml. Ajouter une quantité appropriée de suspension cellulaire pour atteindre une densité de 50 000 cellules par ml.Ajoutez maintenant les facteurs de croissance, notamment l'E-G-F-B-F-G-F et l'héparine, à la concentration décrite précédemment. Mélangez délicatement la suspension cellulaire obtenue, puis transférez-la dans une flasque T 80 et placez-la dans l'incubateur pendant sept à dix jours. Voici un exemple de culture primaire de GBM.Après quatre jours à ce stade, vous pouvez observer que les cellules prolifèrent et commencent à former des sphères. Vous ne devriez pas observer de grands agrégats sphériques de cellules à ce stade. Cela serait dû à une préparation inappropriée du tissu.Après une culture de sept à dix jours, des sphéroïdes de tailles variables se sont formés ; lorsque ces derniers atteignent un diamètre moyen de 150 à 200 microns, ils sont prêts à être repiqués. Voici un exemple de culture de GBM au huitième jour de passage. On observe à nouveau des sphéroïdes de tailles différentes ; les sphéroïdes sains présentent des micro-excroissances à leur périphérie.La préparation d'une suspension de cellules individuelles est une question très importante dans toutes les cultures de sphéroïdes. Sinon, vous risquez d'observer des agrégats cellulaires dès le lendemain de la mise en culture des cellules. Ces agrégats peuvent être considérés comme des sphéroïdes, mais il convient de noter qu'il faut au moins une semaine aux cellules en prolifération pour former de véritables sphéroïdes.La quantité de débris dans la culture de sphéroïdes de tumeur primitive varie selon de nombreux facteurs, tels que l'origine du tissu, la précision avec laquelle le tissu a été prélevé, ainsi que la technique de traitement du tissu. Nous espérons que cette vidéo vous sera utile et vous souhaitons bonne chance dans vos expériences.

isolation-expansion-human-glioblastoma-multiforme-tumor-cells-using

Research

Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

Ce protocole vidéo illustre la méthode de dosage Neurosphère de générer et de développer des cellules souches neurales de la région périventriculaire souris adulte, et donne un aperçu technique afin de garantir l'on peut obtenir des cultures Neurosphère reproductibles.

L&#39;isolement et expansion des cellules souches neurales de souris adultes utilisant le test Neurosphère

Cette vidéo montre le test d’invasion in vitro des cellules souches de tumeurs cérébrales (BTSC) pour déterminer l’effet du traitement médicamenteux sur la capacité d’invasion des BTSC de la neurosphère via la technique d’imagerie de cellules vivantes.

Test d’invasion de la neurosphère par cellules souches de tumeurs cérébrales (BTSC) : un test in vitro pour analyser l’effet du traitement médicamenteux sur l’invasion de BTSC à partir de la neurosphère

Protocole pour la propagation des spécimens chirurgicaux à haute teneur dissociés de gliome dans le milieu sans sérum de neurosphère pour sélectionner pour des cellules avec le phénotype de cellules souches cancéreuses. Pour les spécimens qui ne se développent pas en tant que neurosphères, un protocole alternatif est suggéré. Une technique de incorporation de paraffine pour maintenir l’architecture 3D de neurosphère pour immunocytochemistry est décrite.

Optimisation de la culture cellulaire de gliome de haut grade à partir d’échantillons chirurgicaux pour une utilisation dans des modèles animaux cliniquement pertinents et l’immunochimie 3D

Nous décrivons ici les techniques d’imagerie de cellules vivantes pour mesurer quantitativement la migration et l’invasion du glioblastome cerveau tumeur des cellules souches au fil du temps et dans plusieurs conditions de traitement.

Épreuves d’imagerie de cellules vivantes pour étude glioblastome Brain Tumor Stem Cell Migration et Invasion

Neurospheres cultivés comme 3D cultures constituent un outil puissant pour étudier la biologie de gliome. Nous présentons ici un protocole pour effectuer l’immunohistochimie en conservant la structure 3D de gliome neurospheres par enrobage de paraffine. Cette méthode permet la caractérisation des propriétés neurosphère gliome tels que stemness et différenciation neurale.

Évaluation de biomarqueurs dans les gliomes par immunohistochimie sur la paraffine 3D gliome Neurosphère Cultures

Ici, nous présentons un système de culture monocouche mixte ex-vivo pour l'étude de la migration des cellules de gliome humain (hGC) en temps réel. Ce modèle permet d'observer les interactions entre les hGC et les axones myélinisés et non myélinisés dans une chambre compartimentée.

Surveillance en temps réel de la migration cellulaire des gliomes humains sur les co-cultures d'Axon-Oligodendrocyte de Ganglion de racine dorsal

Dans cet article, nous décrivons, en détail, un protocole pour la génération des cultures de neurosphère à partir de cellules souches neurales de souris postnatales dérivées des principales niches neogènes de souris. Les neurosphères sont utilisées pour identifier les cellules souches neuronales à partir de tissus cérébraux permettant l’estimation du nombre de cellules précurseurs. En outre, ces structures 3D peuvent être plaquées dans des conditions différenciatives, donnant lieu à des...

Isolement et expansion des neurosphères des niches neurogéniques de souris postnatales (P1-3)

La microdissection laser (LMD) est une technique sensible et hautement reproductible qui peut être utilisée pour découvrir des voies qui médité glioma hétérogénéité et invasion. Ici, nous décrivons un protocole optimisé pour isoler les zones discrètes du tissu de gliome utilisant le LMD laser suivi de l’analyse transcriptomique.

Microdissection laser de sous-régions de Glioma pour la caractérisation spatiale et moléculaire de l’hétérogénéité intratumorale, des oncostreams et de l’invasion

Ici, nous décrivons un essai d’invasion facile à utiliser pour le glioblastome. Cet essai convient aux cellules souches du glioblastome. Une macro fidjienne pour faciliter la quantification de l’invasion, de la migration et de la prolifération est également décrite.

Un modèle sphéroïde 3D pour le Glioblastome

Nous présentons un modèle de migration 3D du glioblastome utilisant des gliomasphères magnétiques dérivées du patient générées à partir de tumeurs nouvellement diagnostiquées et récurrentes. Cette plateforme permet de visualiser la dynamique migratoire spécifique au patient et d’évaluer l’efficacité thérapeutique. Le test peut être multiplexé après migration afin d’évaluer la localisation et les schémas d’expression des protéines.

Essai de migration du glioblastome 3D reproductible avec localisation sphéroïde médiée par nanoparticules magnétiques dans des conditions hypoxiques

Découvrez l'isolement et l'expansion de cellules souches de glioblastome humain par le test neurosphère. Cette méthode permet d'étudier la biologie tumorale et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

L'isolement et l'expansion des cellules humaines de glioblastome multiforme tumeur utilisant le test Neurosphère

Explorer plus de vidéos