Identification des partenaires protéine interagissant Utilisation Tandem Affinity Purification

L’objectif global de cette procédure est d’utiliser une méthode connue sous le nom de purification par affinité en tandem pour isoler les partenaires de liaison aux protéines. Bonjour, je suis dLAN Bailey de la section de virologie de l’Imperial College de Londres. Dans notre laboratoire, nous travaillons sur les interactions entre les hôtes des virus et les différents membres de la famille des virus.

L’identification des protéines qui interagissent avec d’autres protéines cellulaires ou virales est un excellent point de départ pour étudier l’interaction entre le virus et son hôte pendant l’infection. Dans cette vidéo, je vais expliquer une approche que nous utilisons dans notre laboratoire, la purification en tandem et e ou le marquage au robinet. L’étiquette Tap utilisée dans cette étude est une étiquette N terminale composée de deux unités de protéine G et d’un peptide de liaison au streptocoque adin.

Ceux-ci sont séparés par une séquence de clivage de la protéase TEV qui permet une élution spécifique de la protéine d’appât. Dans cet exemple, murine, EIF quatre E se trouve à l’extrémité C de cette construction de fusion. Le protocole de marquage des tapotements est une procédure en six étapes.

Après la transfection et la génération de lignées cellulaires, les cellules sont amenées à exprimer la protéine de marquage abattement avant d’être placées dans un tampon de lyse doux. Deux étapes de purification par affinité et deux solutions spécifiques sont utilisées pour purifier l’appât et tout partenaire d’interaction potentiel afin de générer des lignées cellulaires. HEC 2 93 cellules doivent être transfectées avec l’encodage du vecteur d’expression P met quatre.

Les cellules de protéine d’appât marquées au robinet sont ensuite sélectionnées avec cent microgrammes par mil d’hygromycine B. Comme le plasmide est maintenu épiso, il n’est pas nécessaire d’isoler des clones spécifiques. 10 flass confluents de cellules sont induits par un traitement avec 10 micromolaires de chlorure de cadium pendant 16 heures avant d’être grattés dans le milieu. Les cellules suspendues sont ensuite transférées dans des tubes de 15 M et les cellules sont granulées par centrifugation.

Ces cellules sont ensuite lavées trois fois avec du PBS glacé avant d’être finalement granulées. Deuxième étape : les cellules de lyse cellulaire sont placées dans cinq mils de tampon de lyse à froid par pipetage répété avant d’être laissées sur la glace pendant cinq minutes. Pour assurer une lyse efficace, les cellules sont ensuite seringunées à travers une aiguille émoussée de calibre étroit et décongelées par congélation.

L’état résultant est réparti dans des tubes de 1,5 mil et les cellules et les débris sont éliminés par centrifugation. Il est à noter que la taille des granulés est nettement réduite suite à cette étape de centrifugation. Les surnageants de lysat sont ensuite combinés dans un tube Falcon de 15 mil et passés à travers un filtre de 0,45 micromètre pour éliminer tout débris supplémentaire.

Une aliquote de 50 microlitres de ce lysat doit être prélevée pour une analyse ultérieure. Cet échantillon est appelé premier échantillon. Troisième étape, liaison au lapin IgG Aeros.

À ce stade du protocole, les marqueurs de la protéine G sont immunoprécipités par les IgG aros de lapin. Pour attribuer des perles aros, retirez l’extrémité de la pointe du singe. Cela permet d’éviter d’endommager les billes.

Remettez doucement en suspension la solution d’aro IgG de lapin en faisant tourner le flacon avant de retirer les aros dans un tube de 15 mil. Lavez les aros trois fois dans un tampon de lyse réfrigéré en utilisant une centrifugation à basse vitesse pour clarifier les billes à chaque étape. Les billes d’IgG de lapin en granulés doivent être visibles après la centrifugation.

Après chaque étape, retirez délicatement le tampon sans déranger les billes. Une fois le lavage final terminé, ajoutez le lysat filtré et clarifié aux billes tassées et incubez pendant trois heures ou toute la nuit. Il préférait à quatre degrés C à l’aide d’un mélangeur rotatif.

Après l’immunoprécipitation, faites tourner les billes d’agros et retirez le surnageant pour une analyse ultérieure. Si nécessaire, vous pouvez utiliser une pointe de construction fine pour retirer tout liquide restant de ce tube. Ce surnageant est le clivage de la protéase TEV de l’échantillon deux, étape quatre.

Dans cette étape, l’appât est clivé à partir des balises de la protéine G. Cette étape permet un clivage spécifique de la protéine d’appât, efficacement une étape d’élution des IgG du lapin suscite l’immunoprécipitation. Préparez le mélange de clivage TEV et ajoutez-le aux perles aros à l’aide de la pointe du singe avec son extrémité retirée, transférez ce mélange dans un microtube de centrifugation siliconé et retournez-le pour mélanger l’aros en suspension avant l’incubation pendant la nuit à quatre degrés C, retirez un alico de cette réaction de clivage TEV pour analyse.

Il s’agit du troisième échantillon. L’incubation d’une nuit sur le mélangeur rotatif devrait permettre à la réaction TEV de progresser jusqu’à la fin de sa vie. Cinquième étape, liaison pour immobiliser les perles d’adin strept.

Dans cette étape, l’appât Cleve et tous les partenaires de liaison potentiels sont purifiés par affinité à partir de la solution. Tout d’abord, centrifugez la réaction de clivage TEV contenant les billes d’IgG aros de lapin. Pour granuler l’aros, prélever un OTT du surnageant clarifié pour analyse.

Il s’agit du quatrième échantillon. Retirez soigneusement tout le surnageant restant, qui contient votre protéine d’appât, dans un tube frais. Encore une fois, utilisez bien.

Construisez des pointes de peppe pour éliminer tout surnageant possible. Conservez les billes d’IgG aros de lapin pour une analyse ultérieure. Il s’agit du cinquième échantillon.

Pour éviter d’endommager les billes de streptocoque, retirez l’extrémité d’une pointe d’animal. Remettez doucement les billes en suspension et retirez un alico dans un tube siliconé. Laver le streptocoque en ayant des billes avec un tampon S, en clarifiant par centrifugation à basse vitesse.

Après chaque lavage. Après chaque lavage, retirez délicatement le tampon. Les billes d’adin Strept sont très petites et peuvent être facilement déplacées même en cas d’utilisation fine.

Construisez des pointes pour animaux de compagnie. Après que les perles d’adin streptept aient été lavées. Ajoutez le surnageant de la réaction de clivage TEV à ces billes et incubez la réaction pendant trois heures ou toute la nuit à quatre degrés C, à l’aide d’un mélangeur rotatif.

Après l’incubation, la centrifugeuse a streptéré les billes d’havein et retiré le supnatum. Il s’agit du sixième échantillon. Important.

La protéine Beit est maintenant associée aux billes restantes dans le tube. Lavez les billes de streptavidine contenant votre protéine d’appât avec un tampon de lyse. Pour éliminer toute protéine contaminante supplémentaire, retirez la solution de lavage restante des billes et laissez-les sur de la glace.

Sixième étape, élution de la biotine. Dans cette étape, la biotine est ajoutée aux billes de streptavidine. L’interaction entre la biotine et les billes de streptavidine déplace l’appât, qui retourne en solution.

Ajoutez la solution de biotine directement aux billes et retournez pour mélanger. Incuber la réaction à quatre degrés C pendant trois heures ou toute la nuit à l’aide d’un mélangeur centrifuge rotatif, le mélange de biotine aéros et recueillir soigneusement le mélange dans un tube frais. Il s’agit de votre dernier EIT, appelé septième échantillon.

Les billes de strept havein restantes sont l’échantillon huit. En raison de sa faible concentration en protéines, cet éluat final doit être concentré avant l’analyse. Ceci est réalisé en utilisant de faibles poids moléculaires, des colonnes de centrifugation coupées, une réduction du volume par centrifugation en surveillant régulièrement le processus.

Cet échantillon concentré peut être divisé et analysé sur des gels de page SDS par kumasi et coloration à l’argent. Si les échantillons doivent être analysés selon la spécification de masse, nous vous conseillons d’utiliser des gels commerciaux préfabriqués. Des bandes individuelles peuvent ensuite être extraites et les protéines identifiées par spécification de masse.

Dans ce cas, l’appât était murin, EIF pour protéine E. L’avantage du système de robinet est que vous avez la possibilité d’exprimer la protéine qui vous intéresse dans une lignée cellulaire particulière, et selon la lignée cellulaire qui vous intéresse, il vous donne également la possibilité d’exprimer la protéine à des niveaux relativement faibles. Vous décidez de le faire, et toutes les modifications post-traductionnelles et la localisation conservées, de sorte que vous pouvez souvent purifier le complexe natif.