Name: Le modèle du CYP2D6 animale: Comment provoquer une hépatite auto-immune chez la souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Découvrez comment créer un modèle murin d'hépatite auto-immune en infectant des souris avec un adénovirus exprimant l'autoantigène CYP2D6. Cette méthode permet d'étudier l'inflammation chronique du foie et les réponses immunitaires spécifiques.

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Ce travail est soutenu par le Goethe de Francfort l&#39;hôpital universitaire et une subvention de la Fondation allemande pour la recherche vers les communications unifiées

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<li>Hintermann, E., Bayer, M., Pfeilschifter, J., Christen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+delivery+of+the+liver+autoantigen+cytochrome+P450+2D6+chronically+activates+hepatic+stellate+cells+and+induces+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Manuscript+Submitted%22%5BJournal%5D)">Adenoviral delivery of the liver autoantigen cytochrome P450 2D6 chronically activates hepatic stellate cells and induces fibrosis.</a> Manuscript Submitted. , (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Dans des études antérieures, l&#39;hépatite expérimentale a été souvent rapporté que seulement transitoires et beaucoup de modèles actuels de la maladie auto-immune du foie dépend des protocoles assez complexes induction de la maladie (pour revues, voir 3,5). Par exemple, plusieurs modèles d&#39;utiliser des souris transgéniques exprimant des antigènes cibles spécifiques et adoptive transférés cible spécifiques de l&#39;antigène, pour la plupart TcR transgéniques, de cellules T 14,15. Souvent une infection par des virus supplémentaires livertropic, bactéries ou parasites est nécessaire pour induire la maladie 16-18. Alternativement, l&#39;ADN-vaccination avec des plasmides codant pour les antigènes cibles, y compris le CYP2D6 19, est utilisé pour induire l&#39;hépatite. Toutefois, une vaccination supplémentaire avec des plasmides codant pour des cytokines pro-inflammatoires comme l&#39;IL-12, est nécessaire 20. Malheureusement, à quelques exceptions près 15,20 hépatite n&#39;est que transitoire. Le modèle utilise une CYP2D6 6,21 t méthode simpleo induire hépatite auto-immune par un simple d&#39;infecter des souris avec un adénovirus exprimant hCYP2D6, l&#39;auto-antigène majeur dans AIH-2 7,8. La livraison du CYP2D6 par une construction adénovirus garantisse à la fois une ciblage directe du foie ainsi que une inflammation locale qui fait la promotion la ventilation de la tolérance. Il est toutefois important de noter que les deux le titre du virus ainsi que la voie d&#39;administration est crucial pour ce modèle. D&#39;une part, Ad-2D6 est un virus de réplication déficiente, ainsi, un titre suffisamment élevé de virus est nécessaire pour générer une quantité critique de l&#39;antigène dans le foie. D&#39;autre part, une trop forte titre pourrait entraîner une insuffisance hépatique aiguë fatale. En outre, il a été démontré précédemment que l&#39;infection des souris par des titres élevés d&#39;adénovirus conduit à un épuisement fonctionnelle de la réponse immunitaire 22. Dans notre modèle, nous avons utilisé une combinaison de l&#39;infection par voie intraveineuse et intrapéritonéale afin d&#39;obtenir à la fois l&#39;infiltration chronique cellulaire ainsi que postefibrose ensive. Nous avons observé que l&#39;infection par voie intraveineuse seule cause encore une infiltration massive cellulaire, mais aucune fibrose de la région sous-capsulaire, ce qui indique que l&#39;inflammation péritonéale due à l&#39;injection intrapéritonéale pourrait être impliqué dans l&#39;accumulation continue de collagène sous-capsulaire (Hintermann &amp; Christen, manuscrit en préparation). Cependant, il est important de noter que la fibrose hépatique observée est spécifique d&#39;un antigène, puisque nous n&#39;avons pas de détecter l&#39;activation des cellules étoilées du foie et des dépôts de collagène après l&#39;infection par virus égalité des titres de Ad-GFP ou Ad-Control 23. Le modèle du CYP2D6 reflète de nombreux aspects de IAC 1,2 humain, telles que l&#39;hépatite chronique caractérisée par une infiltration cellulaire persistante et 6 fibrose hépatique. En outre, la présence de haute-titrage des anticorps anti-CYP2D6 avec spécificité de l&#39;épitope semblable et la diffusion de 13 à LKM-1 anticorps trouvés dans AIH-2 patients indique le présence d&#39;une réactivité commune chronique auto-immune. CYP2D6 est l&#39;antigène majeur dans AIH-2, mais il n&#39;est pas reconnu par les patients diagnostiqués avec le type 1 AIH plus fréquentes. En outre, les patients souffrant de maladies du foie autres dont l&#39;étiologie auto-immune, comme la cirrhose biliaire primitive (CBP) ou cholangite sclérosante primitive (CSP), de générer des anticorps avec une spécificité de cachet à des auto-antigènes hépatiques distinctes et leurs foies montrent différentes caractéristiques pathologiques de centrage sur les petites (PBC ) ou de grandes voies biliaires (CFP). Néanmoins, les modèles du CYP2D6 offre la possibilité d&#39;analyser les mécanismes impliqués dans les processus immunopathogéniques hépatiques chroniques inflammatoires comme survenant au cours de maladies auto-immunes du foie, d&#39;identifier les principaux acteurs qui animent la destruction auto-immune des hépatocytes et d&#39;évaluer d&#39;éventuelles interventions thérapeutiques pour guérir la maladie.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de l&#39;équipement </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Aiguille 23G </td><td> BD Biosciences </td><td> 300800 </td><td></td></tr><tr><td> 27 ½ G aiguille </td><td> VWR </td><td> 612-0151 </td><td></td></tr><tr><td> 30 ½ aiguille G </td><td> BD Biosciences </td><td> 304000 </td><td></td></tr><tr><td> Alanine aminotransférase (bandelettes de test TPG / ALT) </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 10 745 138 202 </td><td></td></tr><tr><td> Bandes aspartate aminotransférase (test GOT / AST) </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 10 745 120 202 </td><td></td></tr><tr><td> Anesthésie Unité Univentor 400 </td><td> <a href="http://www.agnthos.se" target="_blank" >AgnTho de</a> </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Moules de base, mm 37x24x10 jetable </td><td> VWR </td><td> 720-0208 </td><td></td></tr><tr><td> Cellule filtre 70mm </td><td> VWR </td><td> 734-0003 </td><td></td></tr><tr><td> Cryostat </td><td> Leica </td><td> CM1850 UV </td><td></td></tr><tr><td> Héparinisés tubes capillaires </td><td> Pêcheur </td><td> 3123987 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope glisse Superfrost Plus </td><td> Menzel Gläser </td><td> J1800AMNZ </td><td></td></tr><tr><td> Microtainer SST tubes </td><td> BD Biosciences </td><td> 365951 </td><td></td></tr><tr><td> Plaques de microtitration, à fond en V </td><td> VWR </td><td> 391-1924 </td><td></td></tr><tr><td> Reflotron plus </td><td> Roche Diagnostics </td><td></td><td> Determiniation de sérum ASAT / ALAT </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> O Nomf le réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> De lapin anti-anticorps de souris anti-collagène de type I IgG, </td><td> Chemicon </td><td> AB765P </td><td></td></tr><tr><td> Biotinylé de chèvre anti-IgG de lapin </td><td> Vecteur (AXXORA) </td><td> VC-BA-1000-MC15 </td><td></td></tr><tr><td> FITC-conjugué anticorps de souris anti anticorps CD8a </td><td> Southern Biotech </td><td> 1550-1502 </td><td></td></tr><tr><td> PE-conjugué anticorps anti IFN-souris </td><td> BD Biosciences </td><td> 554412 </td><td></td></tr><tr><td> PE-anti-souris conjugué anticorps CD16/CD32 (FcR bloc) </td><td> BD Biosciences </td><td> 553141 </td><td></td></tr><tr><td> Aquatex </td><td> VWR </td><td> 1.08562.0050 </td><td></td></tr><tr><td> Avidine / biotine Blocage kit </td><td&gt; Vecteur (AXXORA) </td><td> VC-SP-2001-KI01 </td><td></td></tr><tr><td> Brefeldine A </td><td> Sigma </td><td> B6542 </td><td></td></tr><tr><td> Collagénase IV </td><td> Sigma </td><td> C5138-100MG </td><td></td></tr><tr><td> DAB substrat kit 3&#39;3&#39;diaminobenzidine </td><td> Vecteur (AXXORA) </td><td> VC-SK-4100-KI01 </td><td></td></tr><tr><td> DNase </td><td> Sigma </td><td> DN-25 </td><td></td></tr><tr><td> Elite ABC réactif </td><td> Vecteur (AXXORA) </td><td> VC-PK-7100-L050 </td><td></td></tr><tr><td> Éosine G / Y solution </td><td> Roth </td><td> X883.1 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de veau foetal (FCS) </td><td> Biochrom AG </td><td> S 0115 </td><td></td></tr><tr><td> Isofluran </td><td> Forene </td><td> B506 </td><td></td></tr><tr><td> Meyer Hématoxyline en solution </td><td> APPLICHEM </td><td> A4840, 1000 </td><td></td></tr><tr><td> Composé OCT </td><td> Sakura Finetek l&#39;Europe </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> PBS tamponnée de formaldéhyde 10% </td><td> Roth </td><td> A146.3 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> Amersham </td><td> 17-0891-01 </td><td></td></tr><tr><td> Roti-Histokit </td><td> Roth </td><td> 6638,1 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Invitrogen </td><td> 61870 </td><td></td></tr><tr><td> La saponine de l&#39;écorce de Quillaja </td><td> Sigma </td><td> S7900 </td><td></td></tr></tbody></table>

le modèle du cyp2d6 animale: comment provoquer une hépatite auto-immune chez la souris

The CYP2D6 Animal Model: How to Induce Autoimmune Hepatitis in Mice

L&#39;hépatite auto-immune est une maladie rare mais mortelle auto-immune du foie de 1,2 étiologie inconnue. Dans les tentatives passées de nombreuses ont été effectués afin de générer un modèle animal qui reflète les caractéristiques de la maladie humaine 3-5. Toutefois, dans divers modèles de l&#39;induction de la maladie était assez complexe et souvent l&#39;hépatite était transitoire 3-5. Par conséquent, nous avons développé un modèle de souris simple qui utilise l&#39;auto-antigène majeur humaine de type 2 auto-immune contre l&#39;hépatite (IAC-2), à savoir hCYP2D6, comme un déclencheur 6. Type 1 foie et du rein (LKM anticorps microsomales-1) anticorps reconnaissant hCYP2D6 sont la marque de IAC-2 7,8. Livraison de type sauvage dans hCYP2D6 FVB ou C57BL / 6 a été construit par un adénovirus (Ad-2D6) qui assure une prestation directe de l&#39;antigène déclenchant au niveau du foie. Ainsi, l&#39;inflammation qui a suivi local génère un champ fertile 9 pour le développement ultérieur de l&#39;auto-immunité. Un combination de l&#39;injection intraveineuse et intrapéritonéale d&#39;Ad-2D6 est la voie la plus efficace pour induire un dommage durable auto-immune du foie (section 1). Ici nous fournissons un protocole détaillé sur la façon dont une maladie du foie auto-immune est induite dans le modèle du CYP2D6 et comment les différents aspects de dommages au foie peuvent être évalués. Tout d&#39;abord, les niveaux sériques de marqueurs indiquant la destruction des hépatocytes, comme aminotransférases, ainsi que les titres de hCYP2D6 anticorps sont déterminés par prélèvement de sang retroorbitaly (section 2). Deuxièmement, la réponse hCYP2D6-spécifique des lymphocytes T est caractérisée par la collecte de lymphocytes de la rate et le foie. Afin d&#39;obtenir des lymphocytes hépatiques pures, les foies sont perfusés par PBS par la veine porte (section 3), digéré en collagène et purifié sur gradient de Percoll (section 4). La fréquence des cellules T spécifiques hCYP2D6 est analysé par une stimulation par peptides hCYP2D6 et l&#39;identification des cellules productrices d&#39;IFN-par cytométrie en flux (section 5). Troisièmement,infiltration cellulaire et la fibrose est déterminée par immunohistochimie de coupes de foie (article 6). Une telle analyse schéma doit être menée à plusieurs reprises après le début de la maladie afin de prouver le caractère chronique du modèle. L&#39;ampleur de la réponse immune, caractérisée par la fréquence et l&#39;activité de hCYP2D6 T spécifiques et / ou des cellules B et le degré de l&#39;atteinte hépatique et la fibrose doivent être évalués pour une évaluation ultérieure des traitements possibles pour prévenir, retarder ou d&#39;abroger la autodestructrice procédé de l&#39;du foie.

L&#39;infection de souris avec une Adénovirus exprimant l&#39;auto-antigène majeur humaine cytochrome P450 2D6 (hCYP2D6) reconnus par des sérums de patients souffrant de de type 2 résultats des l&#39;hépatite auto-immunes dans une forme persistante de maladie du foie auto-immune à médiation caractérisé par l&#39;hépatite, fibrose extensive et de génération d&#39;un CYP2D6 -réponse immunitaire spécifique.

Le modèle du CYP2D6 animale: Comment provoquer une hépatite auto-immune chez la souris

L'hépatite auto-immune est une maladie auto-immune du foie rare mais potentiellement mortelle, dont l'étiologie est inconnue1,2. Par le passé, de nombreuses tentatives ont été entreprises pour...

L'objectif général des expériences suivantes est de générer et de valider un modèle murin de l'hépatite auto-immune, une maladie hépatique auto-immune humaine caractérisée par une inflammation chronique de l'interface hépatique, une hyper-gammaglobulinémie et la production d'auto-anticorps caractéristiques. Les animaux sont d'abord infectés par un adénovirus exprimant l'auto-antigène responsable de la maladie, CYP2D6, afin d'induire une inflammation locale au niveau du foie. Ensuite, les lymphocytes hépatiques sont isolés par perfusion hépatique et centrifugation en gradient de densité. Enfin, les lésions hépatiques et l'identification des lymphocytes T spécifiques de l'auto-antigène peuvent être évaluées respectivement par immunohistochimie et coloration intracellulaire des cytokines.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes réside dans le fait que notre modèle de l'hépatite auto-immune se caractérise par une inflammation chronique du foie et une réponse immunitaire spécifique à l'auto-antigène, presque identique à celle observée chez les patients atteints d'hépatite auto-immune de type deux. Notre modèle peut aider à répondre à des questions essentielles dans le domaine des maladies hépatiques auto-immunes, telles que la manière dont se produit la destruction progressive du foie chez les patients souffrant d'hépatite auto-immune. En général, avec la méthode utilisant des flacons, nous éprouvons des difficultés à réaliser l'infection intraveineuse et le prélèvement sanguin par le sinus veineux ophtalmique, ainsi que la perfusion du foie, car la manipulation du porteur nécessite une bonne maîtrise pratique.Après anesthésie, maintenez la souris par l'arrière du cou et tendez la peau lâche de la tête avec le pouce et le majeur. Observez comment, dans cette position, l'œil fait saillie légèrement en raison de la traction exercée sur la peau adjacente à l'œil. Placez ensuite l'aiguille au niveau du canthus médial, à la jonction de la paupière la plus proche du nez de l'animal, et injectez lentement 100 microlitres de la solution virale 80 2D six.Ensuite, retirez légèrement l'aiguille et fermez les paupières. Commencez par remplir une seringue de cinq millilitres avec du PBS froid et fixez une aiguille de calibre 27 à la seringue. Puis, après avoir euthanasié la souris, faites une incision avec des ciseaux à environ un centimètre des pattes arrière de l'animal, à travers les couches de peau et de muscle, des deux côtés de l'animal, en remontant jusqu'au diaphragme.Et lorsque le diaphragme est atteint, tirer la peau vers l'arrière et couper le diaphragme en le détachant des côtes à l’aide de ciseaux, puis disséquer la veine cave. À ce stade de la dissection, déplacer l’estomac et les intestins sur le côté afin d’exposer la veine porte. La perfusion du foie est la partie la plus délicate de la procédure, en particulier lorsque le foie est chroniquement enflammé ou même fibrosé. La souris étant très petite, il faut une main ferme pour piquer précisément la veine porte.En outre, il est important d'appliquer le PBS lentement, sinon le tissu peut être endommagé. Insérez l'aiguille préparée précédemment dans la veine porte, puis appliquez doucement une pression sur le piston de la seringue pour permettre au PBS de laver lentement le sang du foie. Une fois la perfusion terminée, retirez le foie en saisissant le diaphragme avec une paire de forceps et en utilisant les ciseaux pour détacher le diaphragme du corps.Enfin, transférez l'organe dans une boîte de Pétri et retirez le diaphragme, la vésicule biliaire et tout autre tissu encore attaché au foie. Notez que le foie de l'animal atteint d'hépatite auto-immune est fibrosé et que les lobes individuels sont soudés. Commencez par remplir une boîte de Pétri avec 10 millilitres de PPS frais et placez-la sur de la glace.Transférez le foie perfusé dans la boîte et, à l’aide de ciseaux, découpez le tissu en petits morceaux. Ensuite, versez le tissu et le PBS dans un tamis cellulaire de 70 micromètres et, à l’aide d’un pilon en verre, pressez les morceaux de foie à travers le tamis. Versez maintenant soigneusement 10 millilitres de tampon au collagénase froid sur les morceaux de tissu, en continuant d’utiliser le pilon selon les besoins.Faire centrifuger les cellules à 30 ×g pendant trois minutes à quatre degrés Celsius. Transférer le surnageant dans un tube propre, en laissant cinq millimètres de liquide au-dessus du culot. Centrifuger à 650 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Éliminer tout le surnageant sauf les derniers trois millimètres.Resuspendre le culot dans 20 millilitres de tampon par cellule, puis après avoir centrifugé les cellules à 600 ×g pendant 20 minutes à 4 °C, éliminer le surnageant et resuspendre le culot en agitant le tube, dans le contexte d'une hépatite auto-immune persistante se développant après une infection par l'adénovirus 2D6 chez des souris de type sauvage dans le modèle CYP2D6. Le foie présente une morphologie apparemment modifiée, comme observé ici sur la figure de droite. En particulier, les lobes hépatiques sont fusionnés, comme indiqué par des flèches noires, et des nodules hyperphagiques, indiqués par des flèches noires, apparaissent disséminés sur l'ensemble du foie, tandis qu'une fibrose capsulaire massive est visible après infection avec un contrôle.L'adénovirus n'exprimant pas la CYP 2D six humaine n'a aucun effet sur la morphologie hépatique, comme illustré sur la figure de gauche. Des infiltrations cellulaires importantes et persistantes apparaissent dans les régions périportales et parenchymateuses du foie des souris infectées par l'adénovirus 2D six, mais pas chez celles infectées par l'adénovirus contrôle. Remarquez les infiltrations significatives de cellules mononucléées présentes uniquement chez les souris infectées par l'adénovirus 2D six, indiquées par les flèches noires simples. Ici.Les triples flèches indiquent de plus importantes infiltrations cellulaires dans le parenchyme hépatique reliant des tracts portaux voisins. Sur cette image, on peut observer comment la fibrose se développe principalement dans la région sous-capsulaire, avec certains faisceaux de collagène s'étendant vers le parenchyme. Remarquez les multiples couches de dépôt de collagène situées sous la capsule hépatique, indiquées par les triples flèches noires, ainsi que certains faisceaux s'étendant vers le parenchyme, indiqués par les flèches simples, et la présence de grands amas de cellules infiltrantes, indiqués par les têtes de flèches noires.Une troisième caractéristique de l'hépatite auto-immune persistante chez les souris infectées par l'adénovirus 2D6 est la génération prédominante de lymphocytes T CD4 et CD8 spécifiques de l'humain CYP 2D6, à destination hépatique, comme le montrent ces représentations typiques de plots de coloration cytokinique intracellulaire. Après une stimulation nocturne des lymphocytes hépatiques par le peptide immunodominant CD4 ou CD8 de l'humain CYP 2D6, on observe respectivement une expression de l'interféron gamma par les lymphocytes T CD4 positifs ou CD8 positifs. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que la perfusion optimale du foie constitue une étape cruciale afin d'éviter une contamination des lymphocytes hépatiques par des cellules mononucléées du sang périphérique. Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que l'isolement des cellules stellaires hépatiques primaires, peuvent être réalisées afin d'étudier l'état d'activation et le potentiel migratoire des lymphocytes T après leur développement.Ce modèle animal devrait ouvrir la voie aux chercheurs dans le domaine des maladies hépatiques auto-immunes pour explorer les facteurs clés à l'origine de l'inflammation chronique du foie, et pour évaluer des traitements possibles pour les patients.

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