Simple et robuste In vivo Et In vitro Démarche pour l'étude de l'assemblage du virus

L'objectif général de cette procédure est d'étudier l'assemblage viral in vivo et in vitro. Cela est réalisé en exprimant d'abord des ARN du virus de la mosaïque du brocoli dans des bactéries, puis en les exposant à des cellules végétales par infiltration agro-induite. Ensuite, les virions du virus de la mosaïque du brocoli (BMV) sont purifiés à partir des feuilles infiltrées.

Ensuite, les sous-unités de la protéine de capside destinées à l'assemblage in vitro sont préparées. Enfin, les varians de BMV sont assemblés in vitro à l'aide de la protéine de capside et du colorant indocyanine verte. En définitive, les résultats montrent l'assemblage in vitro de varians de la mosaïque du chou par la formation de fantômes optiques, qui peuvent être déterminés par l'absorbance et l'émission de fluorescence.

Aujourd'hui, nous allons présenter une technique appelée filtration, qui s'avère utile pour délivrer des composants viraux aux plantes. Le principal avantage de cette méthode réside dans l'élimination de la nécessité de produire des transcrits in vitro, tout en permettant l'acheminement simultané de plusieurs composants vers une même cellule, ce qui autorise une infection synchronisée. Les travaux que nous menons actuellement portent sur l'utilisation du virus de la mosaïque du chou en combinaison avec un chromophore approuvé par la FDA, le vert cyanine, afin de concevoir un nouveau type de nanoparticule destinée à des applications biomédicales.

Et plus précisément, notre objectif est d'utiliser ces structures, que nous appelons fantômes fil optique ou OB gs, pour des modalités d'imagerie optique, notamment l'imagerie par fluorescence et l'imagerie photoacoustique, ainsi que comme vecteur pour la thérapie laser. Une application clinique spécifique que nous étudions actuellement consiste à utiliser ces structures pour l'imagerie du cancer de l'ovaire en association avec des procédures intraopératoires. L'idée est que nous pouvons fonctionnaliser ces structures.

L'OBG doté du motif de ciblage spécifique capable de reconnaître les cellules tumorales résiduelles, qui, dans le cas du cancer de l'ovaire, peuvent se trouver particulièrement dans la cavité péritonéale. À partir d'une plaque d'agrobacterium préparée au préalable et contenant l'ARN du virus de la mosaïque brune un, deux ou trois, choisir une colonie isolée pour inoculer deux millilitres de LB contenant 50 microgrammes par millilitre de kanamycine et 100 microgrammes par millilitre de rifampicine. Incuber la culture pendant un jour à 28 degrés Celsius dans un agitateur orbital à 250 tr/min. Inoculer 50 millilitres de LB dans un flacon Erlenmeyer de 500 millilitres avec un millilitre de culture et incuber pendant 16 heures à 28 degrés Celsius dans un agitateur orbital à 250 tr/min le jour suivant. Lorsque les cultures auront atteint une DO 600 de 1,0, les transférer dans des tubes stériles de 30 millilitres et centrifuger pendant 10 minutes.

À 5 000 tr/min et à quatre degrés Celsius, dissoudre les culots dans 10 millilitres de chlorure de magnésium à 10 millimolaire et centrifuger pendant 10 minutes à 5 000 tr/min et à quatre degrés Celsius. Répéter cette étape une fois de plus afin de garantir l'élimination complète de l'antibiotique. Ensuite, resuspendre les culots dans 10 millilitres de tampon contenant du MES à 10 millimolaire et du chlorure de magnésium à 10 millimolaire.

Mesurez la DO à 600 nm pour chaque culture et ajustez-la à une DO de 600 nm de 0,1 à l’aide de chlorure de magnésium 10 millimolaire et de MES 10 millimolaire. Mélangez ensuite 10 millilitres de chacune des trois suspensions cellulaires à une DO de 600 nm de 0,1. Ajoutez de l’acétophénone à une concentration finale de 100 millimolaire.

Mélanger doucement et laisser le mélange au repos à température ambiante pendant trois heures. Après l'incubation, aspirer la culture dans une seringue de un millilitre sans aiguille. Infiltrer la suspension de culture dans la face axiale de deux à trois feuilles bien développées de N. benthamiana en appuyant doucement sur la seringue contre une moitié de la surface abaxiale de chaque feuille.

Gardez les plantes infiltrées dans la serre à 24 degrés Celsius pendant trois à quatre jours avant de récolter les feuilles. Après la purification des virions de BMV, préparez un litre de tampon de dissociation du virus à une concentration 1 x. Ensuite, préparez la membrane de dialyse.

Selon la méthode de Sambrook et al., distribuer cinq à 10 milligrammes par millilitre de virus purifié dans un sac de dialyse et placer le sac dans un flacon contenant un tampon de dissociation de virus 1 x. Dialyser le virus pendant 24 heures à quatre degrés Celsius sous agitation.

Recueillir la solution provenant du sac de dialyse et centrifuger à 30 000 tr/min pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius afin de faire précipiter les particules virales non associées. Centrifuger le surnageant à 30 000 tr/min pendant trois heures à quatre degrés Celsius. Après avoir préparé les transcrits d'ARN à réassembler en virion, mélanger les sous-unités de la capside et les transcrits d'ARN dans un rapport de un à cinq.

Dispenser le mélange dans un sac de dialyse et le fermer correctement afin d'éviter toute fuite. Après avoir préparé un litre de tampon d'assemblage d'ARN à une concentration X, dialyser le mélange de réaction d'assemblage dans ce tampon à quatre degrés Celsius pendant 24 heures. Le jour suivant, retirer le mélange du sac de dialyse et ajouter 1,5 millilitre de tampon d'assemblage d'ARN, puis centrifuger à nouveau à 30 000 tr/min pendant trois heures à quatre degrés Celsius. Ensuite, éliminer le surnageant et resuspendre le culot.

Ensuite, estimez la concentration de virions à 260 nanomètres d'OD. Puis déterminez la concentration des sous-unités protéiques de la capside à 280 nanomètres d'OD ou par d'autres méthodes telles que le dosage de Bradford afin d'évaluer l'intégrité des sous-unités protéiques de la capside dissociées. Réalisez une électrophorèse SDS-PAGE à 12 à 15 % suivie d'un immunotransfert. Enfin, suivez la procédure décrite dans le protocole écrit pour générer des fantômes viraux optiques ou des ov cheese.

On voit ici une image en microscopie électronique en transmission d'une préparation de BMV Varion purifiée à partir de plantes end hamana, soumises à une infiltration agro avec un mélange des trois constructions agri de type sauvage de BMV, puis colorée négativement. Cette image MET montre des particules virales vides contenant du vert d'indocyanine, colorées négativement. Ici, les spectres d'absorbance et de fluorescence des particules virales vides optiques sont présentés une fois maîtrisés.

Cette technique peut être réalisée en cinq minutes par échantillon. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez être en mesure de bien comprendre comment encapsuler un composant viral ou non viral dans des sous-unités de protéines de capsides.