Name: Système de culture de la soie du film pour In vitro Analyse et conception des biomatériaux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Découvrez un système de culture sur films de soie pour analyses in vitro et conception de biomatériaux. Cette méthode permet d'étudier les réponses cellulaires avant applications in vivo.

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Le financement du NIH K08EY015829, R21EY019561, R24EY015656, P41 EB002520, et R01 EY020856 Research to Prevent Blindness Prix du développement de carrière, et Tri-institutionnel Stem Cell Initiative. Lignée cellulaire HCLE est une gracieuseté de M. Ilene Gipson. Les auteurs tiennent à remercier le Dr Liu Aihong au Weill Cornell Medical College pour son aide technique et des conseils à la culture cellulaire, Anthony Labissiere à l&#39;hôpital pour les chirurgies spéciales pour son assistance technique avec la SEM d&#39;imagerie, le génie tissulaire Resource Center (TERC) à l&#39;Université Tufts de soutien technique avec le développement matériel, et le Cornell Center for Nanoscale Science and Technology Facility (CNF) de l&#39;aide pour la fabrication de plaquettes de silicium.

1. Fabrication de moules en caoutchouc de silicone <ol><li> Produire ou acheter une surface topographique souhaitée pour la coulée. Pour cette publication, une norme de 100 mm plaquette de silicium gravée sera décrite (Figure 1). </li><li> Peser polydiméthylsiloxane (PDMS) enrobage (composant A) et le catalyseur (composant B) solution dans un rapport de 1:9 (9 g d&#39;empotage et de 1 g de catalyseur) tel que prévu dans le kit acheté. </li><li> Mélanger soigneusement des solutions pour lancer processus de durcissement. </li><li> Surface de la plaquette de silicium Lieu dans un plat de coulée. </li><li> Peser 4,5 g de solution PDMS sur tranche de silicium. </li><li> Propagation PDMS solution à recouvrir une zone de 100 mm diamètre de la surface de la plaquette. </li><li> Inclinez plaquette de répandre solution PDMS uniformément. </li><li> Couvrir plaquette avec 100 mm de diamètre couvercle boîte de Pétri. </li><li> Lieu de coulée de configuration dans le four à 60 ° C pendant la nuit, ce qui rend certains que le durcissement se déroule sur une surface plane. </li><li> Lieu guéri PDMS / plaquette de silicium dans l&#39;éthanol à 70%salle de bain avant de les enlever. </li><li> Commencez à retirer à partir de PDMS plaquette en utilisant une lame de rasoir pour soulever bord (circonférence) en premier. </li><li> Tirez doucement sur PDMS hors aide d&#39;une pince dans un bain d&#39;éthanol 70% en faisant attention à ne pas déchirer la coulée de caoutchouc de silicone. </li><li> Punch out moules individuels à l&#39;aide de PDMS 14 mm de perforation. Ce diamètre est conçu pour s&#39;intégrer dans une configuration de plaque de 24 puits. </li></ol> 2. La production de soie Solution <ol><li> Apportez 2 L d&#39;eau distillée (dH 2 O) à ébullition dans un bécher de verre 7. </li><li> Couper 5 g de cocons de vers à soie Bombyx mori en trois tiers. </li><li> Éliminer des cocons largement contaminés, comme indiqué par les insectes particules revêtement de la surface intérieure excessive cocon. </li><li> Mesurer 4,24 g de carbonate de sodium. </li><li> Ajouter lentement le carbonate de sodium à l&#39;ébullition dH 2 O pour empêcher le volume de déborder de l&#39;eau, et de permettre la dissolution complète avant de continuer. </li><li> Ajouter les morceaux de cocon à ébullition dH <sub&gt; 2 O pendant 40 min., et utiliser une barre de téflon agitation revêtu de remuer les cocons pendant le processus d&#39;ébullition. </li><li> Après la cuisson, égoutter soigneusement dH 2 O dans l&#39;évier et la bague à l&#39;extrait de soie à la main pour enlever l&#39;excès d&#39;eau. </li><li> Lavez la soie extraire trois fois pendant 20 min. chacun dans 1 L de dH 2 O dans un bécher de laboratoire, et d&#39;utiliser une barre d&#39;agitation pour faire circuler volume dans le bécher. </li><li> Après le lavage, la bague à l&#39;extrait de soie à la main et l&#39;extrait de la fibre de soie à l&#39;intérieur lieu une hotte chimique pour permettre le séchage pour un h 12. période. </li><li> Le lendemain, peser les fibres de soie séchés, ce qui est typiquement ~ 3,5 g: ___________-g </li><li> Préparer une solution 9,3 M pour une LiBr 20% p / v de la soie. Utiliser les équations suivantes pour calculer le poids nécessaire et volumes: <ol class="lalpha"><li> (Poids d&#39;extrait de soie de l&#39;étape 10) x (4) = ___________ ml de solution 9,3 M au total LiBr </li><li> [(807,705) x (volume de LiBr à partir de la pièce 11.a)] / 1000 g = ___________ de LiBr à ajouter à dH 2 O </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Ajouter du poids LiBr mesurée dans un bécher de verre de ce qui suit dH 2 O du volume: <ol class="lalpha"><li> (0,8) x (volume calculé de l&#39;étape 11.a) = ___________ ml de dH 2 O </li></ol></li><li> Verser cette solution dans une éprouvette graduée de taille appropriée, et apporter une solution au volume final tel que calculé dans le cadre 11.a. </li><li> Placez l&#39;extrait de soie dans un bécher et verser la solution de LiBr sur les fibres de soie en s&#39;assurant que les fibres de soie sont immergés dans une solution de LiBr aide d&#39;une spatule de laboratoire. </li><li> Placez la soie dissous dans 60 ° C four pendant 4 heures: Heure de début: ___________ Heure de fin: ___________ </li><li> Utilisation d&#39;une seringue de taille appropriée élaborer 12 ml de la solution de la soie. Placez une aiguille 18G sur la fin de la seringue, puis injecter la solution dans une cassette de dialyse (3.500 MW coutoff, Slide-A-Lyzer, Thermo Scientific). Après le remplissage de la cassette, aspirer l&#39;air restant hors de la cassette avec la seringue vidée. </li><li> Lieu ficassette de dialyse lled dans 1 L de dH 2 O. </li><li> Changer dH 2 O du volume après 1 h, 4 h, 8 h, puis toutes les 12 heures 3x pour un total de 6 changements: <ol class="lalpha"><li> Début: ___________ </li><li> 1h: ___________ </li><li> 4h: ___________ </li><li> 8 h: ___________ </li><li> 12 h: ___________ </li><li> 12 h: ___________ </li><li> 12 h: ___________ </li><li> Fin: ___________ </li></ol></li><li> Après la dialyse, lentement recueillir la solution de la soie à partir de cassettes avec une seringue. Placer dans la solution des tubes à centrifuger g 10.000 notés. </li><li> Centrifuger la solution deux fois à 10000 g à 4 ° C pendant 20 min chacun. Après chaque surnageant de centrifugation lieu dans un nouveau tube. </li><li> Conserver la solution de soie thr dans le 4 ° C réfrigérateur. </li><li> Prélever 2 échantillons de 0,5 ml solution de soie en petits peser la capsule, et le lieu pèsent plats dans un four à 60 ° C à sec pendant 12 heures ou jusqu&#39;à ce que la solution ne sèche soie. </li><li> Peser le film de soie reste solide à partir de both des échantillons pour mesurer pour cent en poids de soie solution à la concentration de protéines de volume: <ol class="lalpha"><li> Poids du combiné 2 échantillons de films de soie: ___________ mg </li><li> (Poids du 23.a) x (100) = ___________% soie </li></ol></li></ol> 3. Préparation de films de soie et d&#39;installation de système de culture <ol><li> Préparer les surfaces de moulage de PDMS par le nettoyage avec du ruban adhésif clair pour enlever la poussière. </li><li> Clean PDMS substrats par trempage dans de l&#39;EtOH 70% et laver trois fois avec dH 2 O. </li><li> Lieu 14 mm sur la plaque de moules PDMS titulaire, qui est généralement un couvercle plaque à 24 puits. </li><li> Pour produire un film de 50 um d&#39;épaisseur, la propagation de la solution 70 μls soie 8% sur les moules en PDMS en utilisant un outil de liquide répandu qui est typiquement une seringue de 1 ml pointe 2. </li><li> Permettre à des films de soie pour sécher non couvert sur un banc propre exécutant une pression d&#39;écoulement d&#39;air de 150 Pa pendant une période de 90 minutes, ou jusqu&#39;à films sont sèches. </li><li> Une fois que les films sont un endroit sec toute série de films, y compris PDMS mâgés, dans une chambre de l&#39;eau-recuit pendant plus de 4 heures pour produire un film insoluble dans l&#39;eau. Il s&#39;agit généralement d&#39;une chambre vide avec de l&#39;eau dessicateur dans le fond du bassin tiré à un vide de 25 kPa 15. </li><li> Retirez les films de soie en provenance de l&#39;eau-de recuit chambre et le lieu sur un banc propre. </li><li> Préparer un bain EtOH 70% dans un plat de 35 mm de Pétri, et les substrats de contrôle de lieux (de verre ou des surfaces en plastique) et des anneaux en acier inoxydable dans des puits pendant au moins 10 min à stériliser. </li><li> Retirez les films de soie à partir de moules en PDMS en utilisant une pince, trempez-les dans EtOH à 70%, et l&#39;échantillon lieu dans 24 puits de plaque pré-remplie avec 1 ml d&#39;EtOH à 70% en s&#39;assurant face à dessin est orienté vers le haut pour permettre l&#39;adhésion cellulaire. </li><li> Après avoir placé chaque échantillon de film de soie dans un lieu qui correspond bien inoxydable poids bague en acier (11,65 mm de diamètre intérieur, 15,45 mm de diamètre extérieur, et de 1,18 mm d&#39;épaisseur) sur le dessus. </li><li> Laisser les échantillons avec des anneaux à incuber pendant 10 minutes pour garantir la stérilité. </li><li> Remove EtOH et laver chaque échantillon 3x avec 1 ml de PBS. Que chacun de lavage s&#39;asseoir pendant 5 min pour permettre la diffusion complète. </li><li> Retirer à l&#39;aide du PBS pipette en verre d&#39;aspiration, tout en veillant à éliminer la majorité des bulles sous échantillons de films de soie. </li><li> Préparer lignée cellulaire pour l&#39;ensemencement. A titre d&#39;exemple, trypsiniser cornéen humain-limbique ligne cellules épithéliales (HCLE) avec de la trypsine 0,25% et l&#39;acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) pour une solution de 7 minutes. Désactiver la trypsine en utilisant 01h01 volume de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) les médias de passage avec FBS 10% ajouté. Centrifuger les cellules trypsinisées HCLE, ajouter 8 mL de kératinocytes milieux exempts de sérum (K-SFM) à culot cellulaire, agiter doucement pour disperser HCLEs, et de générer le nombre de cellules. </li><li> Échantillon de 500 ul de la suspension HCLE par puits typiquement en utilisant un 10000 cellules / cm 2 de densité. </li><li> Cultures au sein de la Place étuve à 37 ° C et 5% de CO 2 et d&#39;exécuter souhaité protocole expérimental. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3646/3646fig1.jpg" /> Diagramme Figure 1. Illustrant résumé 10-étape du processus de la production cinématographique de soie et de préparation du système de culture. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3646/3646fig2.jpg" /> Figure 2. (A) 21-colorant tableau de topographies de surface à motifs en ligne produites sur une plaquette de silicium de diamètre 90 mm ​​utilisant des techniques standard de gravure de photolithographie et sec. (B) des films de la soie d&#39;origine conservent les caractéristiques de lignes parallèles à motifs après la coulée sur des surfaces de moulage de PDMS. (C) Schéma de conception démontrant dimension de l&#39;élément choisi, pour promouvoir l&#39;alignement cellulaire. (D) de la Croix-section de film illustrant la soie retenu surface parallèle bordée motifs. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3646/3646fig3.jpg" /> Figure 3. Microscope électronique à balayage de la lignée cellulaire HCLE adhérant à (A) à motifset (B) des films de soie plates à jour 2 dans la culture. Cultures HCLE continuent de proliférer au confluent sur (C) à motifs et (D) des surfaces planes dans les 8 jours dans la culture. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3646/3646fig4.jpg" /> Figure 4. (A, D, G) à motifs et (B, E, H) plats films de soie cellules HCLE culture relativement à (C, F, I) des substrats de verre à contrôle (AC) 1 jour, (DF) le jour 4, et 8 jours (IG) dans la culture. (J) contenu CyQuant acide nucléique et (K) (3 - (4,5-diméthylthiazol-2-yl) -2,5-diphényltétrazolium (MTT) métaboliques des données de dosage d&#39;activité prouvant la viabilité HCLE sur deux motifs et plates substrats de film de soie par rapport aux surfaces de contrôle du verre au fil du temps (barres d&#39;échelle = 100 m). Vidéo 1. Laps de temps d&#39;imagerie à contraste de phase de cellules qui migrent HCLE sur une surface du film de soie à motifs au cours d&#39;une heure 18. période de temps. Les cellules ont été ensemencées à la densité 10k/cm 2 et cultivées pendant 2 heures. avant l&#39;imagerie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3646/3646movie1.MOV" target="_blank">Cliquez ici pour voir le film</a> . Vidéo 2. Laps de temps d&#39;imagerie à contraste de phase de cellules qui migrent HCLE sur une surface de contrôle TCP plat au cours d&#39;une heure 18. période de temps. Les cellules ont été ensemencées à la densité 10k/cm 2 et cultivées pendant 2 h. avant l&#39;imagerie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3646/3646movie2.MOV" target="_blank">Cliquez ici pour voir le film</a> .

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</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

L&#39;utilisation de films de soie régénérées en tant que substrat pour la culture cellulaire a gagné en popularité au cours des deux dernières décennies en raison de la caractérisation détaillée des propriétés des matériaux de cette protéine et une meilleure compréhension de son utilité biomatériau 3,8. Le système de culture décrit ici représente un roman dans le système de test in vitro pour évaluer les interactions de surface cellulaire sur soie à motifs film de substrats biomatériau 7. Le système permet une analyse en profondeur des interactions cellulaires au cours du temps qui peut être facilement adoptées pour haut-débit de collecte de données. Ceci est en grande partie parce que les films ont permis de soie possèdent un certain nombre de propriétés des biomatériaux accordables qui peut être modifié pour influer directement sur ​​la fonction des cellules 8,9,12, y compris: le contrôle de la surface de micro / nano-topographie de la surface 7; chimies de surface différents grâce à la modification covalente ou par adsorption de molécules biologiquement actives 13; robuste mechpropriétés anical 15,16, le contrôle du matériel hydrophilie / hydrophobie 16; chargement en vrac de composés biologiques pour la libération 4,8,17, et la dissolution contrôlée / taux de dégradation enzymatique par le contrôle de la structure secondaire (contenu feuillet bêta) 11,18,19 . La transparence de films de soie est obtenu grâce à un recuit des films pendant une période de temps sous vide en présence de vapeur d&#39;eau 7,15. Cette approche de traitement permet à la formation de β-feuille de la structure secondaire, en favorisant l&#39;insolubilité de la matière dans l&#39;eau tout en permettant de diffraction de la lumière minimale 15. Cette transparence est la clé de films en permettant directe imagerie des cellules vivantes qui peuvent être employés en vertu d&#39;un certain nombre de modalités d&#39;imagerie (c.-à-grand-champ et de la fluorescence) en utilisant un certain nombre de systèmes de microscopes 12,20. En plus de l&#39;imagerie des cellules vivantes-, films de soie peut être facilement retiré de eSystème de culture pour permettre e pour la fixation et une analyse supplémentaires. Ainsi, la grande variété de directs des évaluations expérimentales qui peuvent être effectuées sur ce système sont applicables à une grande variété de cellules / tissus sources pour de nombreux domaines techniques 3,8,9,12,13,21. Les résultats d&#39;imagerie time-lapse d&#39;illustrer comment les données de la culture en temps réel peuvent être recueillis, et à titre d&#39;exemple ont été utilisés pour illustrer la façon dont la topographie de surface influe sur les interactions cellulaires. Les résultats représentatifs démontrer comment biomatériaux films de soie peut être utilisée pour soutenir la croissance de la culture HCLE, et sont modifiables à un certain nombre de prolifération cellulaire standard et tests métaboliques (Fig. 4). En outre, les cultures sont fixées et traitées à balayage électronique d&#39;imagerie ou d&#39;autres protocoles (fig. 3). Substrats de films de la soie sont produites dans le laboratoire avec une grande fidélité, la cohérence, et avec un coût relativement faible (fig. 1). Cela permet la reproductibilitébilité à la fois dans la configuration du système de la culture et les résultats expérimentaux. Il a été démontré que l&#39;eau-de recuit de traitement produit un tissu de soie stable film dans la culture qui a défini les taux de dégradation en attendant la concentration de protéases en solution 2,15,22. En conséquence, ces matériaux peuvent être utilisés pendant de longues périodes de temps pour la culture cellulaire à long terme, ou rester implanté depuis des mois ou des années en fonction de l&#39;emplacement physiologique 8. En outre, des travaux récents ont montré que la structure des protéines et les propriétés des matériaux de films de soie de l&#39;eau-recuits sont compatibles d&#39;un lot à permettre des résultats de culture reproductibles comme le montre par le biais de diverses méthodes d&#39;essais mécaniques et biophysiques 15,16. En outre, la surface du matériau a montré une grande fidélité parmi les lots de films, comme indiqué par SEM, atomique micrscopy vigueur (AFM), et les études de culture cellulaire {Laurent: 2008wr, Omenetto: 2008tc, Bray: 2011kq} 7,23,24. La stabilité des matériauxlité et la cohérence est un facteur important de la façon dont la cellule sentira le substrat de culture à travers les voies mécanotransduction différents, et finissent par produire une réponse désirée / indésirable cellulaire 25,26. Normes historiques pour substrats de culture, comme le plastique de culture tissulaire traitée ou en verre, des substrats adéquats pour la fixation des cellules. Toutefois, ces matériaux ne sont pas amendables pour cause d&#39;utilité encore in vivo. Il peut être envisagé que la soie du film biomatériau peuvent être personnalisés in vitro, et une fois les attentes expérimentales ont été réalisées le film personnalisé peut être directement convertis en un modèle in vivo. Une telle conception jumelé entre données in vitro et l&#39;expérimentation in vivo présente un grand avantage pour ces biomatériaux implantables de soie sur des substrats autres qui sont couramment utilisés in vitro.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du produit </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Cocons de soie </td><td> Tajima Shoji Co., LTD. </td><td> NA </td></tr><tr><td> PDMS monomère et l&#39;agent de réticulation </td><td> Momentive </td><td> RTV615A 01P </td></tr><tr><td> Carbonate de sodium </td><td> Sigma </td><td> S2127 </td></tr><tr><td> Bromure de lithium </td><td> Sigma </td><td> 213225 </td></tr><tr><td> Slide-A-Lyzer </td><td> Thermo Scientific </td><td> 66110 </td></tr><tr><td> Seringue de 1 ml </td><td> Becton Dickenson- </td><td> 309602 </td></tr><tr><td> Rondelle en acier inoxydable </td><td> Rondelle supérieure </td><td> 81610 </td></tr><tr><td> 24 et la plaque </td><td> VWR </td><td> 353047 </td></tr></tbody></table>

système de culture de la soie du film pour in vitro analyse et conception des biomatériaux

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

Films de la soie sont prometteurs à base de protéines biomatériaux qui peuvent être fabriqués avec une grande fidélité et économiquement dans un environnement de recherche en laboratoire 1,2. Ces matériaux sont souhaitables car elles possèdent très contrôlables caractéristiques dimensionnelles et matérielles, sont biocompatibles et favoriser l&#39;adhérence des cellules, peuvent être modifiées par un motif topographique ou par modification chimique de la surface, et peut être utilisé comme un dépôt de molécules biologiquement actives pour des applications de livraison liés à la drogue 3-8. En outre, les films de soie sont relativement simples à la conception personnalisée, peuvent être conçus pour se dissoudre en quelques minutes ou de dégrader au fil des ans in vitro ou in vivo, et sont de produire avec l&#39;avantage supplémentaire d&#39;être transparent dans la nature et donc très adapté pour les applications d&#39;imagerie 9 - 13. La méthodologie présentée ici système de culture représente une approche évolutive pour des évaluations rapides de la surface du film de cellule de soieinteractions. D&#39;intérêt particulier est l&#39;utilisation de films de surface de soie à motifs pour étudier les différences dans la prolifération cellulaire et les réponses des cellules pour l&#39;alignement 12,14. Les cultures ensemencées ont été cultivées à la fois sur les micro-motifs et plats substrats de films de soie, puis évalué par time-lapse d&#39;imagerie à contraste de phase, microscopie électronique à balayage, et l&#39;évaluation biochimique de l&#39;activité métabolique et la teneur en acide nucléique. En résumé, le film de soie dans le système de culture in vitro offre une configuration personnalisable expérimentale appropriée à l&#39;étude de la surface cellulaire des interactions sur un substrat biomatériau, qui peuvent ensuite être optimisés et ensuite traduit dans des modèles in vivo. Observations à l&#39;aide du système de culture présentées ici sont actuellement utilisés pour aider dans des applications allant des interactions cellulaires de base à la conception de dispositifs médicaux, et sont donc pertinents pour un large éventail de domaines biomédicaux.

Films en soie sont une nouvelle classe de biomatériaux facilement personnalisables pour un large éventail d&#39;applications biomédicales. Le système de soie présenté la culture cinématographique est très adaptable à une variété de<em&gt; In vitro</em&gt; Analyses. Ce système représente une offre de conception biomatériau plate-forme<em&gt; In vitro</em&gt; Optimisation avant la traduction directe d&#39;<em&gt; In vivo</em&gt; Modèles.

Système de culture de la soie du film pour In vitro Analyse et conception des biomatériaux

Les films de soie sont des biomatériaux protéiques prometteurs qui peuvent être fabriqués avec une grande fidélité et à moindre coût dans l'environnement d'un laboratoire de recherche...

L'objectif général de cette procédure est de mettre en place un système de culture in vitro de film de soie. Cela est réalisé en produisant d'abord la solution de soie permettant d'obtenir le film souhaité. La deuxième étape consiste à couler la solution de soie sur une surface de moulage en caoutchouc de silicone et à laisser le film sécher complètement.Le film de soie est ensuite préparé pour la culture cellulaire. Ensuite, le système de culture est assemblé en utilisant une technique stérile. La dernière étape consiste à ensemencer les films de soie avec le type cellulaire souhaité.En fin de compte, les surfaces de culture à base de films de soie peuvent être directement observées ou analysées au sein de la culture. Les plaques ou échantillons peuvent être retirés pour être fixés et traités davantage selon les besoins. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la culture sur du plastique standard pour culture tissulaire, est que les biomatériaux en film de soie sont hautement biocompatibles et peuvent facilement être transférés par les chercheurs vers des applications in vivo et in vitro en aval.Cette méthode peut être utilisée pour répondre à des questions clés dans les domaines de la biologie cellulaire et des biomatériaux, telles que la manière dont la topographie de surface peut être utilisée pour influencer la réponse cellulaire. Bien que cette méthode permette d'obtenir des informations sur la réponse épithéliale cornéenne, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes où des expériences initiales in vitro peuvent fournir des réponses préliminaires à des systèmes plus complexes in vivo. Pour commencer la fabrication de moules en caoutchouc de silicone, obtenez la surface topographique souhaitée pour le moulage. Pour cette démonstration.Une plaquette de silicium gravée standard de 100 millimètres est utilisée. Un mélange de résine et de catalyseur PDMS dans un rapport de neuf pour un, fourni dans un kit acheté, est préparé. Mélanger soigneusement les solutions pour amorcer le processus de réticulation.Après avoir placé la surface du wafer en silicium dans un moule, peser 4,5 grammes de solution de PDMS sur le wafer en silicium. Une fois la solution de PDMS uniformément répartie sur le wafer, recouvrir celui-ci d'un couvercle de boîte de Pétri de 100 millimètres de diamètre et placer l'ensemble sous une pression de 10 millimètres de mercure pendant deux heures. Pour éliminer les bulles d'air de la solution de PDMS, placer le dispositif de moulage à plat dans une étuve à 60 degrés Celsius pendant la nuit. Le jour suivant, placer le wafer en silicium en PDMS polymérisé dans un bain d'éthanol à 100 %.Avant le retrait du PDMS, commencez à retirer le PDMS du wafer en utilisant une lame de rasoir pour soulever le bord périphérique à l’aide de pinces. Retirez délicatement le PDMS dans le bain d’éthanol à 100 %. Veillez à ne pas déchirer le caoutchouc de silicone ; utilisez un poinçon circulaire de 14 millimètres pour découper individuellement les moules en PDMS. Ce diamètre est conçu pour s’adapter aux puits d’une plaque de 24 puits.Pour préparer la solution de soie, portez deux litres d'eau distillée à ébullition. Dans un bécher en verre, coupez cinq grammes de cocons de bombyx du mûrier en trois morceaux, et jetez les cocons fortement contaminés, reconnaissables à la présence excessive de particules d'insectes recouvrant la surface interne du cocon. Ajoutez lentement 4,24 grammes de carbonate de sodium au volume d'eau bouillante afin d'éviter les débordements.Une fois que le carbonate de sodium est dissous, ajoutez les morceaux de cocon à l'eau bouillante et mélangez à l'aide d'un barreau magnétique revêtu de téflon pendant 40 minutes. Après ébullition, versez soigneusement l'eau distillée dans l'évier et pressez l'extrait de soie à la main pour éliminer l'excès d'eau. Lavez ensuite l'extrait de soie en le plaçant dans un bécher en plastique contenant un litre d'eau distillée et en mélangeant pendant 20 minutes.Répétez ce processus de rinçage deux fois avec de l'eau fraîche. Essorez à la main l'extrait de soie lavé et placez l'extrait de fibres de soie à l'intérieur d'une hotte chimique pour permettre un séchage pendant une période de 12 heures. Le lendemain, pesez les fibres de soie sèches, dont la masse est généralement d'environ 3,5 grammes.Ensuite, préparez une solution de bromure de lithium à 9,3 molaire pour obtenir une solution de soie à 20 % poids/volume conformément au protocole écrit. Après avoir placé l'extrait de soie dans le bécher, versez la solution de bromure de lithium sur les fibres de soie.Veillez à ce que les fibres de soie soient immergées dans la solution. À l’aide d’une spatule de laboratoire, placez ensuite le soie dissous dans un four à 60 degrés Celsius pendant quatre heures. Après quatre heures, utilisez une seringue de taille appropriée pour prélever 12 millilitres de la solution de soie.Après avoir placé une aiguille de calibre 18. À l'extrémité de la seringue, injecter la solution dans une cassette de dialyse. Après le remplissage de la cassette, aspirer l'air restant dans la cassette à l'aide de la seringue vidée.Placer la cassette de dialyse remplie dans un litre d'eau distillée. Changer l'eau après une heure, quatre heures, huit heures, puis trois fois toutes les 12 heures, pour un total de six changements. Après la dialyse.Prélèvez lentement la solution de soie des cassettes à l’aide de la seringue et transférez-la dans des tubes de centrifugation. Centrifugez la solution à 10 000 g et à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes après la centrifugation. Placez le surnageant dans un nouveau tube.Après avoir répété ce processus une deuxième fois, prélevez à la pipette deux échantillons de solution de soie de 0,5 millilitre dans deux petits récipients en plastique distincts. Placez les récipients dans une étuve sèche à 60 °C pendant 12 heures ou jusqu'à ce que la solution de soie sèche complètement. La solution de soie restante peut être conservée à 4 °C.Pesez le film de soie solide restant provenant des deux échantillons afin de mesurer la densité de concentration des protéines de soie dans la solution. Préparez les surfaces de moulage en PDMS en utilisant du ruban adhésif transparent pour éliminer toute poussière. Ensuite, nettoyez les substrats en PDMS en les trempant dans de l'éthanol à 100 % pendant une minute.Ensuite, retirez-les et laissez sécher. Pour produire un film d'une épaisseur de 50 micromètres, étalez 70 microlitres d'une solution de soie à 8 % sur des moules en PDMS. À l’aide d’un outil de dispersion liquide tel qu’une embout de seringue de un millilitre, laissez sécher les films de soie à découvert sur un banc propre à flux laminaire en appliquant une pression d’air de 150 pascals pendant une période de 90 minutes ou jusqu’à ce que les films soient secs.Une fois les films secs, placer l'ensemble des films, y compris les moules en PDMS, dans une chambre d'hydratation contenant de l'eau pendant plus de quatre heures afin d'obtenir un film insoluble dans l'eau. Cette chambre est généralement une enceinte desséchante vide contenant de l'eau au fond du récipient, soumise à un vide de 25 kilopascals après retrait des films de soie de la chambre d'hydratation. Travailler sous un banc à flux laminaire pour préparer un bain d'éthanol à 70 % dans une boîte de Pétri de 35 millimètres.Ensuite, placer les substrats de contrôle et les anneaux en acier inoxydable dans la boîte pendant au moins 10 minutes afin de les stériliser. Puis, retirer les films de soie des moules en PDMS à l’aide de pinces. Les plonger dans de l’éthanol à 70 % et placer chaque film dans un puits individuel d’une plaque 24 puits préremplie avec un millilitre d’éthanol à 70 %.Veillez à ce que le côté du motif soit orienté vers le haut afin de permettre l'adhérence cellulaire. Pour garantir la réussite de cette étape, il est important que les films de soie soient placés correctement et de manière stérile dans les puits. Placez les anneaux en acier inoxydable par-dessus les films SILT et laissez-les incuber pendant 10 minutes. Après le lavage du film selon les instructions du texte, préparez la lignée cellulaire pour son ensemencement comme indiqué. Dans cette démonstration, une lignée de cellules épithéliales limbiques cornéennes humaines est utilisée comme étape finale. Ajoutez 500 microlitres de suspension HCLE par puits, en utilisant généralement une densité de 10 000 cellules par centimètre carré, puis procédez à la mise en œuvre du protocole expérimental souhaité. Sont montrées ici des microphotographies électroniques par balayage de la lignée cellulaire HCLE, adhérant à des films de soie texturés et plats au jour deux.Dans les cultures HCLE, les cellules continuent de proliférer jusqu'à confluence sur des surfaces structurées et planes au jour huit. Dans cette expérience, les cellules HCLE cultivées sur des films de soie structurés et plats sont comparées à des substrats témoins en verre aux jours un, quatre et huit. La quantification des cultures, basée sur la teneur en acides nucléiques SQU et les données de l'essai d'activité métabolique MTT, démontre la viabilité des cellules HCLE sur les substrats de film de soie structurés et plats par rapport aux surfaces témoins en verre au fil du temps.On voit ici une imagerie en contraste de phase en accéléré de cellules HCLE migrant sur une surface en film de soie structurée. Pendant une période de 18 heures, les cellules ont été ensemencées à une densité de 10 000 cellules par centimètre carré et cultivées pendant deux heures avant l’imagerie. Une imagerie en contraste de phase en accéléré comparative de cellules HCLE migrant sur une surface témoin plane est également présentée sur une période de 18 heures, dans les mêmes conditions de culture. Une fois la solution de soie et le moulage en silicone préparés, cette technique peut être réalisée en huit heures si elle est correctement exécutée selon cette procédure.D'autres méthodes, telles que le balayage par immunofluorescence, la microscopie électronique et des techniques de biologie moléculaire comme les immunotransferts (western blots) et les dosages immuno-enzymatiques, ainsi que des dosages chimiques comme la viabilité cellulaire, la prolifération cellulaire et le taux métabolique, peuvent être évaluées afin de mieux comprendre la réponse cellulaire face à ces divers services de conception personnalisée. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation de la solution de soie, de la création de motifs personnalisés, de films de soie et de la culture cellulaire sur ces substrats, quel que soit le type cellulaire utilisé.

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