Système de culture de la soie du film pour In vitro Analyse et conception des biomatériaux

Films en soie sont une nouvelle classe de biomatériaux facilement personnalisables pour un large éventail d'applications biomédicales. Le système de soie présenté la culture cinématographique est très adaptable à une variété de

L’objectif global de cette procédure est de mettre en place un système de culture in vitro sur film de soie. Ceci est accompli en produisant d’abord la solution de soie pour fabriquer le film souhaité. La deuxième étape consiste à couler la solution de soie sur la surface de moulage en caoutchouc de silicone et à laisser le film sécher.

Le film de soie est ensuite traité pour la culture cellulaire. Ensuite, le système de culture est assemblé à l’aide d’une technique stérile. La dernière étape consiste à ensemencer les films de soie avec le type de cellule souhaité.

En fin de compte, les surfaces de culture du film de soie peuvent être soit directement imagées, soit analysées dans la culture. Les plaques ou les échantillons peuvent être retirés pour être fixés et traités au besoin. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la culture sur du plastique de culture tissulaire standard est que les biomatériaux de film de soie sont hautement biocompatibles et peuvent être facilement transférés par les chercheurs vers des applications in vivo et in vitro en aval.

Cette méthode peut être utilisée pour répondre à des questions clés dans les domaines de la biologie cellulaire et des biomatériaux, telles que : comment la topographie de surface peut-elle être utilisée pour affecter la réponse cellulaire ? Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la réponse épithéliale cornéenne, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes où les expériences initiales in vitro peuvent fournir des réponses préliminaires à des systèmes in vivo plus complexes. Pour commencer la fabrication de moules en caoutchouc de silicone, obtenez la surface topographique souhaitée pour le moulage Pour cette démonstration.

Une plaquette de silicium gravée standard de 100 millimètres est utilisée à l’extérieur. Solution d’enrobage et de catalyseur PDMS dans un rapport de neuf pour un, telle que fournie à partir d’un kit acheté. Mélangez soigneusement les solutions pour lancer le processus de durcissement.

Après avoir placé la surface de la plaquette de silicium dans une boîte de coulée, pesez 4,5 grammes de solution PDMS sur la plaquette de silicium. Une fois que la solution PDMS s’est répartie uniformément sur la plaquette, couvrez la plaquette avec un couvercle de boîte de Pétri de 100 millimètres de diamètre et placez-la à 10 millimètres de mercure pendant deux heures. Pour dégazer les bulles d’air de la solution PDMS, placez la configuration de coulée sur une surface plane dans un four à 60 degrés Celsius pendant la nuit du lendemain, placez la plaquette de silicium PDMS durcie dans un bain 100 % éthanol.

Avant de retirer le PDMS, commencez à retirer le PDMS de la plaquette à l’aide d’une lame de rasoir pour soulever le bord de la circonférence à l’aide d’une pince. Retirez doucement le PDMS dans le bain à 100 % d’éthanol. En prenant soin de ne pas déchirer le caoutchouc de silicone, perforez les moules PDMS individuels à l’aide d’un poinçon de 14 millimètres. Ce diamètre est conçu pour s’adapter aux puits d’une plaque de 24 puits.

Pour préparer la solution de soie, portez à ébullition deux litres d’eau distillée. Dans un haut-parleur en verre, coupez cinq grammes de cocons de vers à soie maoris bombex en trois, jetez les cocons largement contaminés comme l’indiquent les particules d’insectes excessives recouvrant la surface interne du cocon. Ajoutez lentement 4,24 grammes de carbonate de sodium au volume d’eau bouillante pour éviter de trop déborder.

Une fois le carbonate de sodium dissous, ajoutez les morceaux de cocon à l’eau bouillante et remuez avec un barreau de tungstène pendant 40 minutes. Après ébullition, égouttez soigneusement l’eau distillée dans l’évier et essorez l’extrait de soie à la main pour éliminer l’excès d’eau. Lavez ensuite l’extrait de soie en le plaçant dans un bécher en plastique avec un litre d’eau distillée et en remuant pendant 20 minutes.

Répétez ce processus de lavage à l’eau douce deux fois. Faites sonner l’extrait de soie lavé à la main et placez l’extrait de fibre de soie à l’intérieur d’une hotte chimique pour permettre le séchage pendant une période de 12 heures. Le lendemain, pesez les fibres de soie séchées, qui pèsent généralement environ 3,5 grammes.

Préparez ensuite une solution de bromure de lithium à 9,3 molaires pour une solution de soie à 20 % en poids et en volume selon le protocole écrit. Après le placement de l’extrait de soie dans le bécher. Versez la solution de bromure de lithium sur les fibres de soie.

Assurez-vous que les fibres de soie sont immergées dans la solution. À l’aide d’une spatule de laboratoire, placez ensuite la soie dissoute dans un four à 60 degrés Celsius pendant quatre heures. Après quatre heures, utilisez une seringue de taille appropriée pour prélever 12 millilitres de la solution de soie.

Après la mise en place d’une aiguille de calibre 18. À l’extrémité de la seringue, injectez la solution dans une cassette de dialyse. Après le remplissage de la cassette, aspirez l’air restant de la cassette avec la seringue vide.

Placez la cassette de dialyse remplie dans un litre d’eau distillée. Changez l’eau après une heure, quatre heures, huit heures, puis trois fois toutes les 12 heures pour un total de six changements. Après la dialyse.

Recueillir lentement la solution de soie des cassettes à l’aide de la seringue et la transférer dans des tubes à centrifuger. Centrifuger la solution à 10 000 g et quatre degrés Celsius pendant 20 minutes après la centrifugation. Placez le super natin dans un nouveau tube.

Après avoir répété ce processus une deuxième fois, pipetez deux échantillons de solution de soie de 0,5 millilitre dans de petits plats de lactosérum séparés. Placez les plats de lactosérum dans un four sec à 60 degrés Celsius pendant 12 heures ou jusqu’à ce que la solution de soie roule. La solution de soie en vrac peut être conservée à quatre degrés Celsius.

Pesez le reste de la pellicule de soie solide des deux échantillons pour mesurer la densité de concentration en protéines de soie de la solution. Préparez les surfaces de coulée PDMS à l’aide de ruban adhésif transparent pour enlever toute poussière. Ensuite, nettoyez les substrats PDMS en les trempant dans de l’éthanol à 100 % pendant une minute.

Ensuite, retirez-les et laissez sécher. Pour produire un film de 50 micromètres d’épaisseur, étalez 70 microlitres de solution de soie à 8 % sur des moules PDMS. À l’aide d’un outil d’étalement de liquide tel qu’une pointe de seringue d’un millilitre, laissez les films de soie sécher à découvert sur un banc de nettoyage à flux laminaire en appliquant une pression de flux d’air de 150 pascals pendant une période de 90 minutes ou jusqu’à ce que les films soient secs.

Une fois que les films sont secs, placez l’ensemble des films, y compris les moules PDMS, dans une chambre d’eau et d’agenouillement pendant plus de quatre heures pour produire un film insoluble dans l’eau. Il s’agit généralement d’une chambre desséchée vide avec de l’eau au fond du bassin, tirée à un vide de 25 kilopascals après le retrait des pellicules de soie de l’eau et de la chambre d’agenouillement. Travaillez sur un banc propre à flux laminaire pour préparer un bain d’éthanol à 70 % dans une boîte de Pétri de 35 millimètres.

Placez ensuite les substrats de contrôle et les anneaux en acier inoxydable dans le plat pendant au moins 10 minutes afin de les stériliser. Ensuite, retirez les films de soie des moules PDMS à l’aide d’une pince. Trempez-les dans de l’éthanol à 70 % et placez chaque film dans un seul puits d’une plaque à 24 puits préremplie d’un millilitre d’éthanol à 70 %.

Assurez-vous que le côté du motif est orienté vers le haut pour permettre l’adhésion des cellules Pour assurer le succès de cette étape, il est important que les films de soie soient placés correctement et de manière stérile dans les puits Placez les anneaux en acier inoxydable sur les films SILT et laissez-les incuber pendant 10 minutes Après le lavage du film de l’échantillon comme indiqué dans le texte, Préparez la ligne cellulaire pour l’installation comme indiqué. Dans cette démonstration, une lignée cellulaire épithéliale limbique cornéenne humaine est utilisée comme étape finale Échantillonnez 500 microlitres de suspension HCLE par puits, généralement en utilisant une densité de 10 000 cellules par centimètre carré et procédez à l’exécution du protocole expérimental souhaité. On voit ici des micrographies électroniques à balayage de la lignée cellulaire HCLE, adhérant à des films de soie à motifs et plats au deuxième jour.

Dans la culture HCLE, les cultures continuent de proliférer jusqu’à la confluence sur des surfaces à motifs et planes au huitième jour. En culture ici, la culture de films de soie à motifs et plats, les cellules HCLE sont comparées à des substrats de contrôle en verre le premier jour, le quatrième jour et le huitième jour. En culture, la quantification avec la teneur en acide nucléique SQU et les données d’activité métabolique MTT démontrent la viabilité du HCLE sur des substrats de film de soie à motifs et plats par rapport aux surfaces de contrôle en verre au fil du temps.

Voici une imagerie par contraste de phase en accéléré de cellules HCLE migrant sur la surface d’un film de soie à motifs. Pendant une période de 18 heures, les cellules ont été placées à une densité de 10 000 cellules par centimètre carré et cultivées pendant deux heures avant que l’imagerie à contraste de phase en accéléré de comparaison des cellules HCLE migrant sur une surface de contrôle plane ne soit montrée pendant une période de 18 heures dans les mêmes conditions de culture. Une fois que la solution de soie et le moulage de silicone sont préparés, cette technique peut être réalisée en huit heures si elle est effectuée correctement après cette procédure.

D’autres méthodes telles que le balayage par immunofluorescence, la microscopie électronique et les techniques de biologie moléculaire telles que les transferts Western et les immunoessais, ainsi que les tests chimiques tels que la viabilité cellulaire, la prolifération cellulaire et le taux métabolique, peuvent être évaluées pour mieux comprendre la réponse cellulaire sur ces divers services de conception personnalisés. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de créer une solution de soie, de créer un motif personnalisé, des films de soie et de la culture. Tout type de cellule sur ces substrats.