Name: Génération des cultures organotypiques de Raft kératinocytes humains primaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Apprenez à générer des cultures organotypiques de raft à partir de kératinocytes humains primaires. Cette méthode permet d'étudier la différenciation épithéliale et les interactions virus:hôte dans des conditions proches de l'in vivo.

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Les auteurs tiennent à remercier Sally Roberts (Université de Birmingham, Birmingham au Royaume-Uni) pour le don sorte de l&#39;anticorps E1E4. Ce travail a été soutenu par une subvention de l&#39;Institut national du cancer (4R00CA137160-03).

1. Préparation pour les cultures organotypiques Raft <ol><li> Les grilles métalliques radeau bien d&#39;abord être traités avec de l&#39;acide sulfurique chromique pour enlever tout résidu qui pourrait interférer avec le processus de différenciation. Immerger les grilles métalliques dans un récipient en verre contenant de l&#39;acide sulfurique pendant une heure, puis de façon continue rincés pendant la nuit avec l&#39;eau du robinet. Après la nuit de rinçage, les grilles de radeau doit être rincé pendant 3-5 heures dans de l&#39;eau bidistillée. </li><li> Pour fournir un soutien pour les radeaux, pliez trois côtés du radeau d&#39;environ 0,5 cm à égale distance les uns des autres. Les grilles métalliques doit alors être autoclavés. </li><li> Préparer le tampon de reconstitution 10X en ajoutant 2,2 g NaHCO3 et 4,8 g Hepes. Dissoudre dans 100 ml de 0,05 M NaOH. Filtrez stériliser et stocker en aliquots de 5 ml à -20 ° C. </li><li> Préparer le 10X DMEM sans bicarbonate de sodium. Filtrez stériliser et stocker en aliquots de 5 ml à -20 ° C. </li><li> Préparer le facteur de croissance épidermique de la souris: Dissoudre 100 mg de l&#39;EGF et 10 mg de BSA chaque dans 10 ml désionisée ddH 2 0. Combinez FEM et de la BSA et ajouter à 80 ml ​​d&#39;eau désionisée ddH 2 0 pour un volume total de 100 ml. Filtrez-stériliser, partie aliquote (5 ml) et un magasin dans le -20 ° C. Pour chaque litre de milieu E, ajoutez 5 ml de 1 mg / ml EGF (concentration finale de 5 ng / ml). </li></ol> 2. Préparation de gels de collagène <ol><li> Un gel de collagène est nécessaire pour chaque radeau. Le collagène doit être maintenu sur de la glace pour l&#39;empêcher de se solidifier. Chaque gel de collagène nécessite 3 ml de mélange de collagène consistant en: 2,4 ml de collagène de type à froid de queue de rat I (concentration finale 3-4 mg / ml), 0,3 ml de tampon de reconstitution 10X, 10X 0,3 ml DMEM et1-2 X 10 6 souris 3T3 J2 fibroblastes comme cellules nourricières. Pour les solutions à forte concentration de collagène de queue de rat, diluer dans 0,02 M d&#39;acide acétique pour obtenir la concentration de travail correcte. </li><li> Déterminer le nombre de gels de collagène (radeaux), vous devrez, puis calculer un mélange maître pour la quantité de collagène, reconstit 10Xtampon ution, 10X DMEM et J2 fibroblastes nécessaire. Inclure suffisamment chaque Master Mix pour 3-4 gels supplémentaires dus à la viscosité du collagène. </li><li> Pour préparer le gel de collagène, trypsiniser les J2 fibroblastes et neutraliser avec le milieu. Mélanger tous les fibroblastes et les placer dans un flacon de 50 ml conique. Compter les cellules pour déterminer le nombre de radeaux qui peuvent être faites. Encore une fois, le 1-2x10 6 fibroblastes sont requis par un gel de collagène et donc par radeau. Isoler les cellules à faible vitesse. </li><li> Aspirer le milieu de la fibroblastes et une pastille de remettre en suspension dans la quantité appropriée de tampon de reconstitution 10X, 10X DMEM et du collagène pour le nombre de radeaux calculés. Ajouter le collagène dernière pour empêcher le gel de se solidifier trop rapidement. Une fois que le collagène est ajouté, mélanger rapidement, mais avec précaution pour prévenir l&#39;introduction de bulles dans le gel. Le gel doit être d&#39;une couleur orange rougeâtre, indiquant le bon pH. Si le mélange de gel est trop jaune, ajouter quelques gouttes de 1N, stérilisée par filtrationNaOH et mélanger doucement afin d&#39;obtenir la bonne couleur. </li><li> Ajouter 3 ml du collagène: mélange des fibroblastes dans les puits d&#39;une boîte de culture à 6 puits. Le mélange de collagène devrait être introduit à la pipette lentement sur le côté de chaque puits pour éviter de générer des bulles. Placer la plaque à 37 ° C incubateur de culture de tissu et laisser se solidifier pendant 30 minutes. </li><li> Après 30 minutes, ajouter 3 ml de milieu E avec de l&#39;EGF au sommet du gel de collagène solidifié et retourner la plaque dans l&#39;incubateur. Les gels doivent être conservés à 37 ° C pendant au moins un jour, mais utilisé dans les quatre jours. Résultats optimaux après deux jours d&#39;incubation. </li></ol> 3. Préparer les kératinocytes différenciation <ol><li> Kératinocytes passage bas devrait être augmenté pour atteindre environ 70% de confluence. Chaque radeau nécessite 1-2x10 6 kératinocytes. Trypsiniser les kératinocytes et neutraliser avec le milieu E avec de l&#39;EGF. Compter les cellules pour déterminer le nombre de radeaux qui peuvent être faites. Isoler les cellules à faible SPEéd. Remettre en suspension le culot dans 1 ml de milieu E avec de l&#39;EGF pour chaque culture radeau calculée. </li><li> Aspirer le milieu des gels de collagène en inclinant la plaque à 6 puits. Ajouter 2 ml de milieu E frais avec de l&#39;EGF à chaque gel. Pour chaque gel, ajouter prudemment de 1 ml de kératinocytes remis en suspension les 2 ml de milieu E déjà présent dans le puits. Délicatement la pipette les kératinocytes, plus les 2 ml des médias, puis laisser tomber goutte à goutte de retour sur le gel. Agitant ou en faisant tourner la plaque peut entraîner la distribution inégale des cellules d&#39;un côté du gel de collagène. Placer la plaque dans l&#39;incubateur à 37 ° C. </li><li> Les cellules doivent être cultivées à confluence, remplaçant le milieu E par jour. Les cellules sont confluentes lorsque les changements de milieu au jaune un jour après un changement dans le milieu. Cela prend généralement 2-4 jours. Si le milieu n&#39;a pas changé par quatre jours, passez à l&#39;étape suivante. </li></ol> 4. Rendre les cultures Raft <ol><li> Utilisez une pince stérile pour placer une grille métallique stérile radeau, se pencha vers le bas côtés, Dans une boîte de 10 cm. Aspirer le milieu de gel de collagène. Pour desserrer le gel sur les côtés du puits, rendez-vous autour du périmètre du gel avec une spatule stérile en utilisant un mouvement ascendant et descendant. Pour retirer le gel de collagène, inclinez légèrement la plaque et soulever en plaçant un sous spatule. Fixer le gel de collagène sur la grille métallique sans générer des bulles entre la grille et le gel. Deux gels peuvent être placés sur chaque grille. </li><li> Afin de rendre l&#39;interface air-liquide, ajouter du milieu E sans EGF lentement vers le fond du plat de sorte que la grille de radeau est en contact avec les médias, mais le gel de collagène n&#39;est pas. Les supports ne devrait pas venir au travers des trous dans la grille. Ajouter le support lentement pour éviter de générer des bulles sous la grille, car cela permettra d&#39;éviter la différenciation uniforme. Incuber les radeaux à 37 ° C et changer le milieu tous les deux jours maintien de l&#39;interface air-liquide. Récolter les radeaux après 14 jours. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Lorsque te protocole est effectuée correctement avec des kératinocytes primaires, cette procédure se traduira par un épithélium bien différencié où les différentes couches de la peau sont évidentes. Ce sera atteint grâce à l&#39;examen histologique par coloration des sections de cultures radeau pour l&#39;hématoxyline et l&#39;éosine (H &amp; E), comme indiqué dans la figure 1B. Coloration H &amp; E est également utile d&#39;examiner la morphologie de radeaux et de l&#39;effet des virus ou des composés antiviraux sur la capacité des cellules de stratifier et de se différencier. Par exemple, radeaux fabriqués à partir de HPV-immortalisées primaires de kératinocytes humains (HFK-31) sont sensiblement plus épais par rapport aux radeaux fabriqués à partir de kératinocytes normaux de prépuce humain (HFK), reflétant une augmentation du taux de prolifération et la capacité des protéines HPV à maintenir les cellules de différenciation actifs dans le cycle cellulaire (figure 1B) 10. Il en résulte en matière de rétention des noyaux à travers l&#39;épithélium, alors que les kératinocytes normaux sortent du cycle cellulaire lors de la différenciation, ce qui entraîne une rupture de laenveloppe nucléaire. Examiner de plus près la différenciation, immunohistochimie peut être effectuée à examiner marqueurs de différenciation spécifiques, notamment cytokératines, ainsi que involucrine, et filaggrine. Cytokératines différentes sont exprimés à des stades spécifiques de la différenciation 7. Comme le montre la figure 2, la cytokératine 10 (K10) n&#39;est pas exprimé dans la couche basale, et ne se trouve dans les couches suprabasales qui se composent de cellules progressivement de différenciation. En radeaux HPV positives, l&#39;expression de K10 est retardée par rapport à celle des kératinocytes normaux, ce qui reflète l&#39;influence des protéines contre le VPH sur la différenciation des kératinocytes. L&#39;immunohistochimie peut également être utilisée pour examiner le profil d&#39;expression des gènes viraux. La figure 3 est une coloration représentant examinant l&#39;expression de la protéine E1 HPV ^ E4, qui est une protéine dont la fin de l&#39;expression est restreinte aux couches supérieures de l&#39;épithélium. Comme prévu, aucune coloration n&#39;est observée dans les cultures de radeau de la normale HUMAn kératinocytes de prépuce. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3668/3668fig1.jpg" /> Figure 1. Un Plan) de la méthode pour la préparation de cultures organotypiques radeau à partir de kératinocytes primaires ou de lignées de cellules épithéliales. B) coloration hématoxyline et éosine des cultures organotypiques radeau générés à partir de kératinocytes de prépuce humain maintenir de façon stable contre le VPH-31 (HFK-31) épisomes, ou à partir de kératinocytes normaux de prépuce humain (HFK). Les couches individuelles sont identifiées épithéliales, ainsi que le bouchon de collagène. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3668/3668fig2.jpg" /> Figure 2. Cytokératine 10 (K10) l&#39;expression est restreinte aux couches suprabasales de l&#39;épithélium. Immunohistochimie a été effectuée sur des sections transversales des cultures radeau organotypiques générés à partir hfk-31 cellules, ainsi que HFKs normales en utilisant un anticorps à K10. L&#39;ADN cellulaire a été DAPI. Les images ont été capturées à l&#39;aide confocal microscopie à fluorescence. Les flèches indiquent la couche basale de l&#39;épithélium. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3668/3668fig3.jpg" /> Figure 3. Le VPH E1 ^ E4 protéines est produite à la fin de la phase productive du cycle de vie virale. Immunohistochimie a été effectuée sur des sections transversales des cultures radeau organotypiques générés à partir hfk-31 cellules, ainsi que HFKs normales à l&#39;aide d&#39;anticorps E1E4. L&#39;ADN cellulaire a été DAPI. Les images ont été capturées à l&#39;aide microscopie confocale de fluorescence. Les flèches indiquent la couche basale de l&#39;épithélium.

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Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Nous décrivons ici une méthode qui peut être utilisé pour étudier la différenciation épithéliale en général, mais peut également être facilement adapté pour étudier la pathogenèse virale, ainsi que l&#39;efficacité de traitements potentiels. De nombreux virus cibler les cellules épithéliales, soit que le site primaire de l&#39;infection, comme dans le cas du VPH, ou à un certain moment dans le cycle de vie du virus, comme avec des herpèsvirus. Bien que de plus en plus les cultures organotypiques radeau prend du temps, l...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif </td><td> Entreprise </td><td> Le numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Le collagène de type queue de rat 1 (4-5mg/ml) </td><td> BD Biosciences </td><td> 354236 </td></tr><tr><td> DMEM sans NaHC0 3 </td><td> Invitrogen </td><td> 12100-061 </td></tr><tr><td> NaHC0 3 </td><td> Sigma </td><td> S5761 </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Calbiochem </td><td> 391338 </td></tr><tr><td> Grilles métalliques en acier </td><td> Williams et Mettle Co. </td><td> CR-03063-040-100-S </td></tr><tr><td> E milieu 11 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Epidermal Growth Factor </td><td> BD Biosciences </td><td> 354010 </td></tr></tbody></table>

génération des cultures organotypiques de raft kératinocytes humains primaires

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

Le développement de cultures organotypiques radeau épithéliales a fourni aux chercheurs un système efficace dans le système in vitro qui reproduit fidèlement la différenciation épithéliale récapitule. Il ya beaucoup d&#39;utilisations de ce système. Par exemple, la capacité de croître des cultures tridimensionnelles radeau organotypiques de kératinocytes a été un jalon important dans l&#39;étude du virus du papillome humain (VPH) 1. Le cycle de vie du VPH est étroitement liée à la différenciation de l&#39;épithélium pavimenteux 2. Organotypiques cultures radeau épithéliales comme démontré ici de reproduire le cycle de vie complet du virus du papillome, y compris la production de virus 3,4,5. En outre, ces cultures présentent des lésions dysplasiques radeau similaires à ceux observés lors de l&#39;infection in vivo par le VPH. Par conséquent ce système peut également être utilisée pour étudier les cancers des cellules épithéliales, ainsi que l&#39;effet des drogues sur la différenciation des cellules épithéliales en général. Initialement développé par Asselineau et Prunieras <sjusqu&#39;à&gt; 6 et modifié par Kopan et al. 7, le système épithélial organotypique culture radeau a mûri pour devenir un général, modèle de culture relativement facile, ce qui implique la croissance des cellules sur le collagène se branche maintenue à l&#39;interface air-liquide (figure 1A). Au cours de 10-14 jours, les cellules de stratifier et de différencier, formant un épithélium sur toute son épaisseur qui produit la différenciation spécifiques cytokératines. Radeaux récoltées peuvent être examinés histologiquement, ainsi que par des techniques classiques moléculaires et biochimiques. Dans cet article, nous décrivons une méthode pour la génération des cultures primaires de radeau des kératinocytes humains. La même technique peut être utilisée avec des lignées de cellules épithéliales, et peut facilement être adapté pour une utilisation avec du tissu épithélial à partir de biopsies normales ou malades 8. De nombreux virus cibles soit l&#39;épithélium cutané ou muqueux, dans le cadre de leur cycle de vie réplicative. Au cours des dernières années, la possibilité d&#39;utiliser le culte radeau organotypiqueres comme une méthode d&#39;étude des interactions virus-hôte cellulaire a été montré pour plusieurs virus de l&#39;herpès, ainsi que les adénovirus, parvovirus, poxvirus et 9. Cultures organotypiques radeau peut donc être adaptée afin d&#39;examiner la pathogenèse virale, et sont les seuls moyens pour tester de nouveaux agents antiviraux pour les virus qui ne sont pas cultivables dans des lignées cellulaires permanentes.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; La méthode pour imiter<em&gt; In vivo</em&gt; Différenciation épithéliale est décrite. De nombreux virus cibler les cellules épithéliales dans le cadre de leur cycle de vie virale, et cette méthode fournit un moyen d&#39;examiner le virus: les interactions hôte-qui ressemble plus à ce qui se produit<em&gt; In vivo</em&gt;. Cette technique peut être utilisée avec des kératinocytes primaires, des lignées cellulaires établies, ainsi que la normale ou pathologique des tissus de biopsie.

Génération des cultures organotypiques de Raft kératinocytes humains primaires

Le développement de cultures de radeaux épithéliaux organotypiques a fourni aux chercheurs un système in vitro efficace qui récapitule fidèlement...

L'objectif général de cette procédure est de générer des cultures organotypiques en radeau à partir de kératinocytes primaires ou de lignées cellulaires épithéliales établies. Cela est réalisé en premier lieu en préparant des embouches de collagène à base de fibroblastes. Ensuite, les cellules épithéliales sont déposées en couches au-dessus de ces embouches.Les prélèvements sont ensuite transférés sur des grilles flottantes et maintenus à l'interface air-liquide pendant 10 à 14 jours. Dans la dernière étape, les explants sont récoltés. En définitive, les modifications de la différenciation épithéliale peuvent être évaluées par analyse histologique ou immunohistochimique. Cette méthode permet d'obtenir des informations sur la différenciation épithéliale.Il peut également être appliqué à d'autres systèmes, comme les virus qui infectent l'épithélium cutané ou muqueux dans le cadre de leur cycle de vie. La procédure sera démontrée par Dan Anneker, étudiant diplômé dans mon laboratoire. Tout d'abord, versez de l'acide sulfurique chromique dans un bécher en verre et immergez les grilles en métal flottantes dans l'acide pendant une heure.Ensuite, rincez continuellement les grilles toute la nuit avec de l'eau du robinet. Après ce rinçage nocturne, rincez les grilles pendant trois à cinq heures supplémentaires dans de l'eau doublement distillée, puis laissez sécher les grilles porte-échantillons. Ensuite, repliez trois côtés du radeau, sur environ 0,5 centimètre, espacés à égale distance les uns des autres, puis stérilisez les grilles porte-échantillons en autoclave.Après avoir préparé le gel de collagène, utilisez la trypsine pour détacher les deux fibroblastes, puis neutralisez la trypsine avec du milieu. Transférez les fibroblastes dans un flacon conique de 50 millilitres et comptez les cellules afin de déterminer le nombre de radeaux pouvant être préparés. Ensuite, après avoir centrifugé les cellules pendant quatre minutes à 244 ×g à température ambiante, aspirez le milieu du culot de fibroblastes et remettez en suspension les cellules dans un volume approprié de tampon de réconstitution composé de DMEM et de collagène, en fonction du nombre de radeaux calculé.Ajouter le collagène en dernier pour éviter que le gel ne durcisse trop rapidement. Une fois le collagène ajouté, mélanger la solution rapidement mais délicatement pour éviter d'introduire des bulles dans le gel. Si le mélange de gel est trop jaune, ajouter quelques gouttes de solution stérilisée par filtration.Une solution normale d'hydroxyde de sodium. Mélanger doucement jusqu'à ce que le gel prenne une couleur orangée rougeâtre, signe du pH correct. Prélever ensuite trois millilitres du mélange de collagène et de fibroblastes à l'aide d'une pipette et les déposer lentement le long de la paroi de chaque puits d'une plaque de culture à six puits, en évitant la formation de bulles, puis incuber la plaque pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius afin de permettre la solidification du gel.Lorsque le gel est solidifié, ajouter trois millilitres de milieu E avec EGF sur le dessus du gel de collagène solidifié, puis replacer la plaque dans l'incubateur. Après avoir cultivé des kératinocytes de bas passage jusqu'à une confluence d'environ 70 %, détacher les kératinocytes à l'aide de trypsine, puis neutraliser la trypsine avec du eed. En présence d'EGF, compter les cellules afin de déterminer le nombre de radeaux pouvant être préparés.Après centrifugation des cellules, resuspendre le culot dans un millilitre de eed avec EGF pour chaque culture de radeau calculée. Retirer ensuite le milieu des gels de collagène en inclinant la plaque à six puits sur le côté, puis ajouter deux millilitres de eed frais avec EGF à chaque gel. Ensuite, ajouter soigneusement un millilitre de kératinocytes resuspendus aux deux millilitres de eed déjà présents dans chacun des puits.Prélèvez délicatement les kératinocytes avec les deux millilitres de milieu et laissez-les tomber goutte à goutte sur le bouchon de collagène. Placez la plaque dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant deux à quatre jours afin de permettre aux cellules de croître jusqu’à confluence. Les cellules sont prêtes lorsque le milieu devient jaune un jour après son remplacement, ou au plus tard le quatrième jour, utilisez une pince stérile pour placer une grille stérile en métal, les côtés incurvés orientés vers le bas, dans une boîte de 10 centimètres de diamètre.Aspirez le milieu à partir d'un gel de collagène, puis faites glisser une spatule stérile autour du périmètre du gel en effectuant un mouvement vertical afin de détacher le gel des parois du puits. Le transfert du bouchon de collagène de la plaque à six puits vers la grille constitue la partie la plus délicate de cette procédure. Veillez à glisser délicatement la spatule sous le bouchon sans le fendre, puis déposez-le à plat sur la grille sans créer de bulles d'air entre le bouchon et la grille.Ensuite, vous pouvez utiliser une spatule pour lisser les parties qui se sont repliées pendant cette procédure. Pour retirer le gel, inclinez légèrement la plaque et glissez la spatule sous le gel avant de le soulever. Placez le gel de collagène sur la grille métallique sans créer de bulles entre la grille et le gel.Pour créer une interface air-liquide, ajouter lentement l'EED sans EGF au fond de la boîte de manière à ce que la grille porte-échantillons touche le milieu, mais que le gel de collagène ne soit pas en contact. Incuber finalement les échantillons à 37 degrés Celsius. En maintenant l'interface air-liquide, récolter les échantillons après 14 jours. Comme le montre cette figure, les échantillons préparés à partir de kératinocytes humains primaires immortalisés par le VPH 31 ou Hfk, 30, sont nettement plus épais que ceux préparés à partir de kératinocytes humains normaux de la peau, ou hks.Ainsi, les protéines du VPH ont la capacité de maintenir les cellules différenciantes actives dans le cycle cellulaire. Ici, une analyse immunohistochimique a été réalisée sur des coupes transversales de cultures organotypiques en radeau provenant de HK 30 ainsi que de HKS normaux, à l'aide d'un anticorps dirigé contre la cytokeratine 10 ou K 10 en vert. La K 10 n'était pas exprimée dans la couche basale indiquée ici par les flèches, mais était plutôt détectée uniquement dans les couches suprabasales, composées de cellules en différenciation progressive.Dans cette figure, l'expression de la protéine du VPH, E un, E quatre, une protéine tardive restreinte aux couches les plus superficielles de l'épithélium et représentée ici en vert, est montrée comme prévu. Aucune coloration n'est observée dans les cultures en radeau provenant de kératinocytes humains normaux, comme dans la figure précédente.Les flèches indiquent une fois encore la couche basale de l'épithélium après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie du cancer pour étudier la pathogenèse des papillomavirus humains en utilisant un système qui imite la différenciation épithéliale in vivo. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de réaliser des cultures organotypiques en radeau à partir de kératinocytes primaires ou de lignées cellulaires épithéliales établies.

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Immunologie et infection

Cette vidéo décrit le protocole détaillé de génération de reconstructions cutanées organotypiques 3D in vitro pour étudier la progression du mélanome. Ce modèle de peau imite à la fois l’architecture et la complexité multicellulaire des organes in vivo.

Génération de reconstructions organotypiques de la peau complète : une procédure pour établir un modèle de peau 3D à l’aide d’échantillons de peau humaine

Cette vidéo décrit l'isolement des kératinocytes, les cellules les plus proéminentes de la couche épidermique de la peau humaine, en utilisant une combinaison de méthodes de digestion enzymatique et de perturbation mécanique. Cette méthode aide à la croissance préférentielle des kératinocytes par rapport aux autres types de cellules cutanées à l’aide d’un milieu de croissance sélectif.

Isolement des kératinocytes de la peau humaine : une méthode de culture des kératinocytes primaires à partir d’échantillons de peau

Cette vidéo décrit un protocole détaillé pour la production de rétrovirus recombinant de kératinocytes humains primaires génétiquement modifiés. Cette méthode peut être utilisée pour manipuler l’expression des gènes dans les kératinocytes.

Modification génétique de kératinocytes humains primaires : une méthode de manipulation génétique des kératinocytes à l’aide de rétrovirus recombinants

Ce protocole vidéo décrit une technique de culture in vitro basée sur cassette pour générer de la peau organotypique humaine à l’aide de kératinocytes épidermiques et de derme humain dévitalisé. Ils imitent la fonction et la physiologie de leurs homologues tissulaires in vivo.

Culture de peau 3D organotypique : une technique de culture in vitro sur cassette pour régénérer l’épiderme humain sur derme acellulaire

L’objectif de cet article est de fournir un protocole complet et détaillé sur la façon de générer de la peau organotypique humaine génétiquement modifiée à partir de kératinocytes épidermiques et de derme humain dévitalisé.

Génération des cultures organotypiques de peau génétiquement modifiées en utilisant Dévitalisées derme humain

La peau agit comme une première ligne de défense contre l’environnement externe. Nous présentons une méthode pour isoler des kératinocytes humains primaires de peau adulte. Ces kératinocytes isolés sont utiles dans nombreuses configurations expérimentales et sont un modèle très approprié pour l’étude des mécanismes moléculaires de la biologie cutanée in vitro.

Génération et culture de kératinocytes humains primaires de peau adulte

Ici, nous présentons un protocole pour générer un modèle 3D organotypique mélanome sphéroïde de peau qui reprend l’architecture et complexité multicellulaire d’un orgue/tumeurs in vivo , mais en même temps peut accueillir systématique expérimentale intervention.

Un modèle de peau 3D organotypique mélanome sphéroïde

Nous présentons ici un protocole pour isoler efficacement les kératinocytes humains primaires provenant de tissus de la peau adulte. Cette méthode simplifie la procédure conventionnelle en utilisant le Y-27632 inhibiteur ROCK dans le milieu de l’inoculation pour séparer spontanément les cellules épidermiques des cellules dermiques.

Une méthode simple et efficace d’isoler des kératinocytes humains primaires provenant de tissus de la peau adulte

Nous vous proposons un protocole qui montre comment différencier des fibroblastes et des kératinocytes de dérivés de cellules souches pluripotentes induites et générer un organoïde peau 3D, à l’aide de ces kératinocytes et des fibroblastes. Ce protocole comporte une étape supplémentaire de la génération d’un modèle de souris humanisées. La technique présentée ici permettra d’améliorer la recherche dermatologique.

Génération de peau 3D Organoïde de dérivés du sang de cordon induite par les cellules souches pluripotentes

Nous décrivons ici un protocole pour la culture systématique de sphéroïdes épidermiques en culture en suspension 3D. Ce protocole a de nombreuses applications pour une utilisation dans une variété de types de tissus épithéliaux et pour la modélisation de plusieurs maladies et affections humaines.

Établir un système de culture de sphéroïdes épidermiques à haut débit pour modéliser la plasticité des cellules souches kératinocytes

Ce protocole décrit la culture de kératinocytes fraîchement obtenus (passage 0) pour une utilisation en imagerie de cellules vivantes.

Génération de cultures primaires pour l’imagerie de cellules vivantes kératinocytes

Apprenez à générer des cultures organotypiques de raft à partir de kératinocytes humains primaires. Cette méthode permet d'étudier la différenciation épithéliale et les interactions virus:hôte dans des conditions proches de l'in vivo.

Génération des cultures organotypiques de Raft kératinocytes humains primaires

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