Dissection et de la culture de la souris dopaminergique et des explants striataux en trois dimensions dosages matrice de collagène

L'objectif général de cette procédure est de cultiver des explants de neurones dopaminergiques et de corps strié afin d'étudier le développement des voies méso-striatale et striato-nigrale. Cette approche est réalisée en premier lieu par la microdissection du corps strié et du mésencéphale dopaminergique provenant d'embryons de souris à 14,5 jours post-coïtum. La deuxième étape consiste à découper des explants de taille appropriée à partir des tissus dissecés.

Ensuite, les explants sont positionnés au sein d'un gel de collagène à proximité immédiate les uns des autres. L'étape finale consiste à cultiver ces explants pendant une période de deux à trois jours afin de permettre la croissance des axones. Enfin, une immunohistochimie pour des marqueurs neuronaux spécifiques est utilisée pour visualiser et quantifier les réponses axonales attractives ou répulsives.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les cultures dissociées ou les cultures d'explants deux DX, est que la matrice de collagène fournit un substrat tridimensionnel pour les exons, imitant ainsi l'environnement extracellulaire. De plus, la matrice de collagène permet la formation de gradients relativement stables de protéines libérées par les explants X ou par des cellules placées à proximité. La procédure sera démontrée par Ava Smith et Francesca, deux étudiantes diplômantes de mon laboratoire.

Pour commencer cette procédure, disséquez les embryons de souris E 14,5 de l'utérus de la mère. Conservez-les dans le milieu L 15 sur de la glace jusqu'à utilisation. Ensuite, transférez un embryon sous le microscope et isolez le cerveau de l'embryon.

Ensuite, retirez le céphalon en coupant le long de la partie médiane de chaque vésicule céphalique. Après cela, retirez la gaine méningée. Effectuez une incision dorso-ventrale juste au rostral du mésencéphale.

Ensuite, effectuez une autre incision dorso-ventrale juste caudale au fléchisseur céphalique. Puis, réalisez une incision caudo-craniale le long de la ligne médiane dorsale à l’aide d’un couteau de microdissection afin d’exposer le tissu du mésencéphale ventral sous-jacent. Veillez à ne pas endommager le tissu du mésencéphale ventral, car il contient les neurones dopaminergiques.

Ensuite, effectuez deux incisions latérales parallèles à la ligne médiane ventrale afin de retirer le tissu du mésencéphale dorsal. Puis, divisez le tissu restant du mésencéphale ventral en X explants à l’aide d’un couteau de microdissection à l’extrémité d’un entrepôt. Conservez les X explants dans du milieu L 15 contenant 5 % de FBS sur de la glace jusqu’à utilisation.

Transférez maintenant les vésicules céphaliques du talon obtenues précédemment lors de la dissection du mésencéphale vers le microscope. Retirez le thalamus en coupant entre le thalamus et le satu à l’aide d’une pince. Ensuite, effectuez une incision médio-latérale au niveau rostral du striatum afin d’éliminer les structures rostrales telles que le bulbe olfactif.

Ensuite, répétez cette étape pour le tissu situé adjoint au striatum. Après cela, positionnez la tranche restante afin d'obtenir une vue coronaire du striatum. Le striatum peut être reconnu comme une partie du tissu légèrement plus transparente.

Ensuite, isoler le striatum, puis le découper en implants à l’aide d’un couteau de microdissection. Éviter le tissu légèrement plus foncé proche de la ligne médiane, qui contient les neurones en migration de l’éminence ganglionnaire latérale et médiale. Ajouter une goutte de collagène préparé sur un lamelle dans la cavité d’une plaque de culture à quatre puits.

Conserver au four à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 minutes. Le collagène va se gélifier durant cette incubation. Une fois que le collagène est gélifié, utiliser une pipette avec une pointe de 200 microlitres pour transférer les explants dopaminergiques ou sal vers le collagène.

Ensuite, rapprochez les explants les uns des autres à l'aide d'une aiguille, en les espaçant d'une distance approximative égale au diamètre d'un x explant. Puis, retirez le milieu en excès.

Ajouter 20 microlitres du collagène préparé au-dessus de l’explant. Cela provoque souvent le déplacement des explants. Replacer les explants à l’aide d’une aiguille.

Laisser la collagène durcir à température ambiante pendant 15 minutes. Ensuite, transférer à l’incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 minutes. Une fois la collagène prise, ajouter 400 microlitres de milieu explant et laisser croître pendant deux à trois jours dans l’incubateur à 37 degrés Celsius.

Pour fixer délicatement l'explant, ajouter du paraformaldéhyde à 4 % et le conserver à température ambiante pendant une heure. Après une heure, le laver dans du PBS à température ambiante trois fois, chaque fois pendant 15 minutes.

Ensuite, après avoir retiré le PBS, incubez-les dans du tampon de blocage pendant deux heures. Après cela, incubez-les toute la nuit avec l'anticorps primaire et le tampon de blocage à quatre degrés Celsius le jour suivant. Lavez-les cinq fois dans le PBS à température ambiante, chaque fois pendant une heure. Puis incubez-les avec l'anticorps secondaire conjugué à la flore appropriée.

Incuber quatre heures dans du tampon de blocage toute la nuit à quatre degrés Celsius. À partir de cette étape, recouvrir les explants de papier d’aluminium afin de minimiser leur exposition à la lumière. Les laver toute la nuit dans du PBS à quatre degrés Celsius, suivis de plusieurs lavages le jour suivant.

Ensuite, montez les explants sur la lame de microscope à l'aide d'un milieu de montage à base de réactif antifade prolongé, en orientant la face des explants vers le bas. Placez délicatement une lamelle sur le milieu de montage afin d'éviter d'emprisonner de l'air dessous. Puis, acquérez des images numériques des x explants à l'aide d'un microscope à fluorescence en épifluorescence.

À l'aide de ces images, divisez chaque explant X en quadrants afin de générer un quadrant proximal et un quadrant distal. Ensuite, mesurez la longueur des 20 neurites les plus longs émergeant de l'explant X, tant dans les quadrants proximaux que distaux. Utilisez la longueur moyenne des 20 neuros les plus longs pour calculer le rapport proximal-distal pour chaque explant individuel.

Un rapport proximal/distal supérieur à un indique une attraction de l'axone. Un rapport inférieur à un indique une répulsion de l'axone. On observe ici une explante de mésencéphale marquée avec un anticorps anti-hydroxylase de la tyrosine, révélant une croissance axonale.

La ligne pointillée indique les explants adjacents. Les flèches indiquent ici des neurites individuels et des cônes de croissance. Voici un exemple de quantification du rapport proximal-distal.

Les sont divisés en quadrants égaux. Le quadrant proximal est orienté vers les explants X adjacents, tandis que le quadrant distal est orienté à l'opposé. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de réaliser une co-culture d'explants dopaminergiques et striaux afin d'étudier le développement de la voie nigro-striée, ainsi que les mécanismes moléculaires impliqués dans la formation de ces voies.