Name: Transcription in vitro et plafonnement de lARNm de luciférase Gaussia Suivie par la transfection de cellules HeLa (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Découvrez la transcription in vitro et le plafonnement de l'ARNm de luciférase Gaussia pour des essais de transfection dans les cellules HeLa. Cette méthode optimise la synthèse d'ARN de haute qualité.

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Dongxian Yue, Brett Robb, George Tzertzinis, Tanya Bhatia, Breton Hornblower.

Les RNases sont couramment présentes sur la peau, les cheveux, la poussière, les surfaces de laboratoire, les solutions, etc. Portez des gants et nettoyez soigneusement la surface de la paillasse, les pipettes, etc. avant utilisation afin d'éviter toute contamination par les RNases. L'utilisation de pointes de pipette, de tubes, de matériel en verre et de réactifs exempts de nucléases est fortement recommandée.
1. Transcription in vitro à l'aide du kit de synthèse d'ARN à haut rendement T7
Le modèle d'ADN pour la réaction de transcription est un plasmide linéarisé contenant le gène de la luciférase de Gaussia et un promoteur T7 en amont de la séquence codante (Figure 1B).
<ol>
	<li>Dégeler les composants du kit de synthèse d'ARN à haut rendement T7 et les maintenir sur de la glace.</li>
	<li>Pour l'ARN non capé, préparer la réaction à température ambiante dans l'ordre suivant :</li>
</ol>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Composant</td>
			<td>Volume (μl)</td>
			<td>Final</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eau sans nucléase*</td>
			<td>X</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tampon de réaction 10X</td>
			<td>2</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADN matrice *</td>
			<td>X</td>
			<td>1 μg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mélange de polymérase ARN T7</td>
			<td>2</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total</td>
			<td>20</td>
			<td> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
*Ajouter 1 μg d'ADN et compléter le volume total de la réaction à 20 μl avec de l'eau sans nucléase. La quantité d'eau à ajouter variera en fonction de la concentration de l'ADN matrice.
<ol start="3">
	<li>Pour l'ARN coiffé : Préparer la réaction à température ambiante dans l'ordre suivant :</li>
</ol>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Composant</td>
			<td>Volume (μl)</td>
			<td>Final</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eau sans nucléase*</td>
			<td>X</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tampon de réaction 10X</td>
			<td>2</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP (20 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analogon de capuche 3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)G (ARCA) (40 mM)</td>
			<td>4</td>
			<td>8 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADN matrice*</td>
			<td>X</td>
			<td>1 μg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mélange de polymérase ARN T7</td>
			<td>2</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total</td>
			<td>20</td>
			<td> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
*Ajouter 1 μg d'ADN et compléter le volume réactionnel total à 20 μl avec de l'eau sans nucléase. La quantité d'eau à ajouter variera en fonction de la concentration de l'ADN matrice.
<ol start="4">
	<li>Mélanger soigneusement par vortexage et incuber les réactions à 37 °C pendant 2 heures dans un incubateur à air sec.</li>
	<li>En suivant les étapes 1.3 à 1.4, synthétiser des transcrits coiffés de la luciférase de Cypridina (CLuc) à partir d’un plasmide linéarisé contenant le gène CLuc. Cet ARNm sera co-transfecté avec l’ARNm GLuc coiffé et non coiffé afin de normaliser l’expression de GLuc.</li>
</ol>
2. Élimination de l'ADN matrice
Les réactions de transcription sont traitées avec la DNase I pour éliminer le modèle d'ADN avant de procéder à la purification.
<ol>
	<li>Ajouter 70 μl d'eau sans nucléase aux réactions de transcription, suivis de 10 μl de tampon de réaction de l'ADNase I.</li>
	<li>Ajouter 2 μl d'ADNase I aux réactions.</li>
	<li>Incuber à 37 °C pendant 15 minutes dans un incubateur à air sec.</li>
</ol>
3. Purification par colonne de l'ARN capé et non capé
<ol>
	<li>Purifiez l'ARN capé et non capé à l'aide du MEGAclearKit, conformément aux instructions du fabricant (tout kit de purification d'ARN basé sur des colonnes centrifugeables peut être utilisé).</li>
	<li>Quantifiez l'ARN à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDrop.</li>
	<li>Évaluez la qualité de l'échantillon d'ARN conformément aux instructions du fabricant, en utilisant le kit Agilent RNA 6000 Nano et l'analyseur bioanalytique Agilent 2100.</li>
</ol>
4. Capping d'ARN à l'aide du système de capping Vaccinia
<ol>
	<li>Prendre 10 μg d'ARNm GLuc purifié non coiffé.</li>
</ol>
Une réaction d'emboutissage standard peut caper jusqu'à 10 μg d'ARN (100 nu ou plus). Si une quantité plus importante d'ARN doit être capée, la réaction peut être augmentée en conséquence.
<ol start="2">
	<li>Porter le volume à 15 μl à l’aide d’eau sans nucléase.</li>
	<li>Chauffer l’ARN à 65 °C pendant 10 minutes afin d’éliminer les structures secondaires. Placer sur de la glace pendant 5 minutes.</li>
	<li>Pour préparer la réaction de coiffage, ajouter 2 μl de tampon de coiffage 10X, 1 μl de GTP (10 mM), 1 μl de S-adénosylméthionine fraîchement diluée (2 mM) et 1 μl (10 unités) d’enzyme de coiffage vaccinique au 15 μl d’ARN dénaturé.</li>
	<li>Mélanger soigneusement par vortexage doux et incuber la réaction à 37 °C pendant 30 minutes dans un incubateur à air sec.</li>
</ol>
5. Purification par colonne de l'ARN coiffé
<ol>
	<li>Purifiez l'ARN coiffé à l'aide du kit MEGAclear (tout kit de purification d'ARN basé sur des colonnes de centrifugation peut être utilisé).</li>
	<li>Suivant les instructions du fabricant, évaluez la qualité de l'échantillon d'ARN à l'aide du kit Agilent RNA 6000 Nano et de l'analyseur bioanalytique Agilent 2100.</li>
</ol>
6. Transfection de cellules HeLa à l'aide du kit de transfection TransIT mRNA
<ol>
	<li>Ensemencer des cellules HeLa dans une plaque de 48 puits contenant 150 μl de milieu de culture de Dulbecco (DMEM) à forte teneur en glucose, supplémenté avec 10 % de sérum de veau fœtal (0,7-2,3 × 105 cellules/puits).</li>
	<li>Incuber pendant 16 à 24 heures à 37 °C afin que les cellules atteignent une confluence de 60 à 90 %.</li>
	<li> Diluer les ARN GLuc (avec et sans capuchon) et CLuc à une concentration de 100 ng/μl.</li>
</ol>
Chaque transfection est effectuée en huit réplicats.
<ol start="4">
	<li>Préparer 8 microtubes tubes. Ajouter à chaque tube 1 μl ARN GLuc non capé, 1 μl ARN CLuc capé (pour la normalisation) et 25 μl de DMEM sans sérum. Mélanger soigneusement.</li>
	<li>Préparer 8 tubes Eppendorf. Ajouter à chaque tube 1 μl ARN GLuc coiffé (analogon de capuche), 1 μl ARN CLuc capé (pour la normalisation) et 25 μl de DMEM sans sérum. Mélanger soigneusement.</li>
	<li>Préparer 8 tubes Eppendorf. Ajouter à chaque tube 1 μl ARN GLuc coiffé (Vaccinia), 1 μl ARN CLuc avec cap (pour la normalisation) et 25 μl de DMEM sans sérum. Mélanger soigneusement.</li>
	<li>Ajouter 0.2 μl Réactif de renforcement d'ARNm au premier ensemble de 8 tubes et mélanger.</li>
	<li>Ajouter 0.2 μl TransAjouter le réactif d'ARNm IT aux huit premiers tubes et mélanger.</li>
	<li>Incuber à température ambiante pendant 2 à 5 minutes. (Ne pas incuber plus de 5 minutes).</li>
	<li>Ajouter la mixture de transfection goutte à goutte dans les puits contenant les cultures de cellules HeLa (se référer Figure 3 pour la préparation de la plaque).</li>
	<li>Répétez les étapes 7 à 10 avec le 2nd et 3rd ensembles de 8 tubes</li>
	<li>Incuber toute la nuit (16 heures) à 37 °C dans 5 % de CO2.</li>
</ol>
7. Dosage de la luciférase de Gaussia (GLuc)
Dosage du surnageant de chaque puits pour l'activité GLuc à l'aide du kit de dosage de la luciférase Gaussia BioLux selon les étapes suivantes :
<ol>
	<li>Préparez une solution fraîche de dosage en ajoutant 15 μl de BioLux GLuc Substrate à 1,5 ml de BioLux GLuc Assay Buffer (50 μl de solution de dosage requis par échantillon). Préparez une quantité suffisante pour les échantillons et pour amorcer l'injecteur du luminomètre (reportez-vous aux instructions du fabricant).</li>
	<li>Mélangez soigneusement en retournant le tube plusieurs fois (ne pas vortexer).</li>
</ol>
La luminescence est mesurée à l'aide du luminomètre pour microplaque Centro LB 960 de Berthold Technologies.
<ol start="3">
	<li>Régler le luminomètre sur un volume d'injection de 50 μl et une intégration de 2 à 10 secondes.</li>
	<li>Ajouter 10 μl du surnageant de culture cellulaire de chaque puits dans une plaque noire de 96 puits.</li>
	<li>Amorcer l'injecteur avec la solution d'essai et procéder à la mesure de la luminescence.</li>
	<li>Les valeurs obtenues à partir des puits non transfectés seront utilisées comme témoins négatifs.</li>
</ol>
8. Dosage de la luciférase de Cypridina (CLuc)
Dosage du surnageant de chaque puits pour l'activité CLuc à l'aide du kit de dosage de la luciférase Cypridina BioLux selon les étapes suivantes :
<ol>
	<li>Préparez le substrat fraîchement reconstitué (100x) conformément aux instructions fournies dans le manuel du kit.</li>
	<li>Décongelez le tampon de dosage de la luciférase BioLux Cypridina et mélangez soigneusement (protégez de la lumière).</li>
	<li>Pour préparer la solution de dosage CLuc, ajoutez 15 μl de substrat reconstitué (100x) à 1,5 ml de tampon de dosage de la luciférase BioLux Cypridina (50 μl de solution de dosage requis par échantillon). Préparez une quantité suffisante pour les échantillons et pour amorcer l'injecteur du luminomètre (reportez-vous aux instructions du fabricant).</li>
	<li>Mélangez soigneusement en retournant plusieurs fois le tube (ne pas vortexer).</li>
	<li>Gardez la solution à température ambiante pendant 30 minutes (protégez de la lumière).</li>
</ol>
La luminescence est mesurée à l'aide du luminomètre pour microplaques Centro LB 960 de Berthold Technologies.
<ol start="6">
	<li>Régler le luminomètre sur une injection de 50 μl, un délai de 1 à 2 secondes et une intégration de 2 à 10 secondes.</li>
	<li>Ajouter 10 μl du surnageant de culture cellulaire de chaque puits dans une plaque noire de 96 puits.</li>
	<li>Amorcer l'injecteur avec la solution d'essai CLuc et mesurer la luminescence.</li>
	<li>Les valeurs obtenues à partir des puits non transfectés seront utilisées comme témoins négatifs.</li>
</ol>
9. Résultats représentatifs
Le kit de synthèse d'ARN à haut rendement T7 peut produire jusqu'à 180 μg d'ARN non coiffé et de 40 à 50 μg d'ARN coiffé par réaction de 20 μl. Lorsqu'on analyse l'ARN sur l'Agilent 2100 Bioanalyzer, un ARN de bonne qualité et intact doit présenter un pic unique et net correspondant au transcrit d'ARN. Un pic large ou plusieurs pics indiquent une dégradation de l'ARN. Il est également important de vérifier la taille de l'ARN. La présence de transcrits d'ARN plus longs que prévu peut être due à une digestion incomplète de l'ADN plasmidique matrice. La dégradation de l'ARN et un rendement plus faible sont généralement dus à des contaminants introduits dans la réaction à partir de l'ADN matrice. Figure 2 illustre un exemple d'électrophérogramme et d'image de gel obtenus après analyse d'un ARN de haute qualité et intact sur le Bioanalyzer.
La transfection de cellules HeLa avec des ARN GLuc capés et non capés est suivie d'une incubation et d'un dosage de l'activité luciférase dans les surnageants de culture cellulaire. La structure de coiffe en 5' est importante pour protéger l'ARN contre la dégradation par les exonucléases8 et pour favoriser l'initiation de la traduction de l'ARNm9. Par conséquent, la capylation de l'ARN constitue une étape essentielle pour les expériences de transfection. La méthode co-transcriptionnelle (analogue de coiffe) permet d'obtenir environ 40 μg d'ARN capés à 80 %. Le protocole utilisant l'enzyme de capylation vacciniale capyle jusqu'à 10 μg d'ARN (100 nucléotides ou plus) par réaction avec une efficacité quasi totale.
Figure 4 illustre la différence d'expression de la luciférase entre des cultures transfectées avec des échantillons d'ARN capés et non capés. On observe clairement que les cultures cellulaires transfectées avec de l'ARN capé présentent une expression de la luciférase nettement plus élevée par rapport à celles transfectées avec de l'ARN non capé (qui ne montrent aucune activité luciférase). De plus, Figure 4 confirme également que les deux techniques de capage, utilisant un analogue de capuchon ou l'enzyme de capage de la vaccine, produisent avec succès des transcrits d'ARN fonctionnels et capés pouvant être traduits en protéines. La valeur de p bilatérale obtenue à partir du test t était de 0,2583, ce qui indique qu'il n'existe aucune différence statistique significative entre les données de luminiscence des deux méthodes de capage.
<img alt="Schéma de la transcription par la T7 ARN polymérase ; matrice ADN, transcrit ARN ; processus de séquence nucléotidique." src="/files/ftp_upload/3702/3702fig1A.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1.">
Figure 1A. Synthèse d'ARN par la polymérase ARN T7
 
<img alt="Schéma de la carte du plasmide pCMV-GLuc, 5764 pb ; expression génique, vecteurs de clonage, sites de restriction." src="/files/ftp_upload/3702/3702fig1B.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2."> 
Figure 1B. Vecteur pCMV-GLuc contenant le gène GLuc et le promoteur T7.
 
<img alt="Résultats de la chromatographie d'ARN ; analyse d'ARN coiffé et non coiffé ; graphique d'électrophorèse." src="/files/ftp_upload/3702/3702fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2."> 
Figure 2. Électrophérogrammes du Bioanalyzer et image en gel d'ARN coiffé et non coiffé. L'axe des abscisses représente la taille de l'ARN en nucléotides (nt) et l'axe des ordonnées indique les unités de fluorescence (FU). A) Électrophérogramme de l'ARNm GLuc (non coiffé) après purification. B) Électrophérogramme de l'ARNm GLuc (coiffé à l'aide de l'enzyme de coiffage de la Vaccinia). C) Électrophérogramme de l'ARNm GLuc (coiffé de manière co-transcriptionnelle à l'aide d'un analogue de coiffe). D) Image similaire à un gel générée par le Bioanalyzer. La voie « L » correspond à l'échelle d'ARN, la voie 1 à l'ARNm GLuc non coiffé, la voie 2 à l'ARNm GLuc coiffé à l'aide de l'analogue de coiffe et la voie 3 à l'ARN GLuc coiffé à l'aide de l'enzyme de coiffage de la Vaccinia.
 
<img alt="Schéma de disposition de la plaque pour une expérience d'expression génique ; types d'échantillons : GLuc et CLuc sans ou avec capuchon." src="/files/ftp_upload/3702/3702fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3."> 
Figure 3. Exemple de configuration de plaque pour la transfection de cellules HeLa. Chaque puits contient des cellules HeLa ensemencées ayant une confluence de 60 à 90 %. Le mélange de transfection, composé de l'ARN GLuc approprié (sans capuchon, avec capuchon ajouté à l'aide d'un analogue de capuchon ou avec l'enzyme de capuchonnage de la Vaccinia), de l'ARN CLuc capuchonné (pour la normalisation), du réactif mRNA Boost et du réactif TransIT mRNA, est ajouté dans chaque puits. Chaque transfection est réalisée en huit réplicats (puits de même couleur sur la figure).
 
 
<img alt="Graphique à barres de la luminiscence normalisée ; ARN GLuc capé et non capé ; résultats de l'analyse de l'ARN." src="/files/ftp_upload/3702/3702fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4."> 
Figure 4.Expression de GLuc dans des cellules HeLa. Des ARN messagers GLuc purifiés, capés et non capés, ont été transfectés dans des cellules HeLa et incubés toute une nuit (16 h) à 37 °C. Les surnageants de culture cellulaire provenant de chaque puits ont été analysés pour l'activité de GLuc et de CLuc, et les valeurs de luminiscence ont été enregistrées. Les valeurs de luminiscence de GLuc ont été normalisées par rapport aux valeurs de luminiscence de l'ARN CLuc capé.
<img alt="Formule du rapport de luminescence GLuc, mesure de luminescence, équation pour valeurs normalisées, ULR." src="/files/ftp_upload/3702/3702eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Équation 1">
* La luminescence des cellules non transfectées a été soustraite des valeurs de GLuc et de CLuc avant la normalisation.
 
Marques déposées
BioLux est une marque déposée de New England Biolabs, Inc.
TransIT est une marque déposée de Mirus Bio LLC.
MEGAclear est une marque déposée d'Ambion.

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<li>Stepinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+properties+of+mRNAs+containing+the+novel+%22anti-reverse%22+cap+analogs+7-methyl+%283%27-O-methyl%29GpppG+and+7-methyl+%283%27-deoxy%29+GpppG%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Synthesis and properties of mRNAs containing the novel "anti-reverse" cap analogs 7-methyl (3'-O-methyl)GpppG and 7-methyl (3'-deoxy) GpppG.</a> RNA. 7, 1486-1495 (2001).</li>
<li>Kuge, H., Brownlee, G. G., Gershon, P. D., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap+ribose+methylation+of+c-mos+mRNA+stimulates+translation+and+oocyte+maturation+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Cap ribose methylation of c-mos mRNA stimulates translation and oocyte maturation in Xenopus laevis.</a> Nucl. Acids Res. 26, 3208-3214 (1998).</li>
<li>Schagat, T., Paguio, A., Kopish, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalizing+Genetic+Reporter+Assays%3A+Approaches+and+Considerations+for+Increasing+Consistency+and+Statistical+Significance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Notes%22%5BJournal%5D)">Normalizing Genetic Reporter Assays: Approaches and Considerations for Increasing Consistency and Statistical Significance.</a> Cell Notes. 17, 9-12 (2007).</li>
<li>Barbosa, E., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+%28nucleoside-2%27-%29+-+methyltransferase+from+Vaccinia+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">mRNA (nucleoside-2'-) - methyltransferase from Vaccinia Virus.</a> J. Biol. Chem. 253, 7698-7702 (1978).</li>
<li>Lockless, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+capped+RNA+substrates+by+VP39%2C+the+vaccinia+virus-encoded+mRNA+cap-specific+2%27-O-methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Recognition of capped RNA substrates by VP39, the vaccinia virus-encoded mRNA cap-specific 2'-O-methyltransferase.</a> Biochemistry. 37, 8564-8574 (1998).</li>
</ol>

Tous les auteurs sont employés de New England Biolabs, Inc.

In vitro, la transcription est une méthode utile pour obtenir de forts rendements d'ARN destinés à diverses applications. Le principal avantage de l'utilisation du kit de synthèse d'ARN à haut rendement T7 réside dans sa formulation optimisée pour produire de hauts rendements d'ARN. De plus, les réactifs fournis dans le kit sont exempts de nucléases contaminantes, ce qui permet d'obtenir des transcrits d'ARN de haute qualité et intacts. Le kit est conçu pour offrir une grande stabilité et une grande souplesse d'utilisation, permettant ainsi la synthèse d'ARN messagers, d'ARN marqués par des colorants, de sondes radiomarquées à haute activité spécifique et d'ARN capés. Le manuel du kit contient une liste de protocoles spécifiques ainsi que les matériaux supplémentaires nécessaires pour chacune de ces applications. Il inclut également des informations techniques sur l'utilisation de produits de PCR et d'oligonucléotides d'ADN synthétiques comme matrices pour la transcription. Il est important de noter que le kit de transcription ne peut utiliser que des matrices d'ADN contenant un promoteur T7.
La méthode décrite dans cet article démontre le capage post-transcriptionnel de l'ARN à l'aide de l'enzyme de capage du virus vaccinia, ainsi que le capage co-transcriptionnel à l'aide d'un analogue de la structure du cap de l'ARN. Nous avons montré que les deux méthodes produisent un ARN capé fonctionnellement actif après transfection. La structure du cap en 5' améliore la stabilité de l'ARN et l'efficacité de la traduction, et est donc importante pour les expériences de microinjection11 et de transfection7. La méthode de capage co-transcriptionnel permet d'obtenir 40 à 50 μg d'ARN capé à environ 80 %. Il est important de noter que l'utilisation de l'analogue de cap d'ARN 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G (ARCA), bloqué au niveau du groupe hydroxyle en 3' du m7G, garantit l'incorporation du cap dans l'orientation correcte17. Pour caper des quantités plus importantes d'ARN, il est possible d'augmenter l'échelle des réactions standard pour les deux méthodes de capage. Toutefois, l'utilisation du système de capage vaccinia représenterait une option plus économique, car le capage co-transcriptionnel utilise un analogue de cap, composant relativement coûteux. Le système de capage vaccinia constitue également une meilleure méthode, car son efficacité de capage atteint presque 100 %.
Les méthodes de coiffage de l'ARN décrites ci-dessus synthétisent un ARN portant une structure de type cap 0 à l'extrémité 5'. La structure cap 1 implique une méthylation supplémentaire au niveau de la position 2'-O du sucre ribose du premier nucléotide à l'extrémité 5' de l'ARN. La structure cap 1 a été signalée comme améliorant l'efficacité de traduction de l'ARN18 et peut être intégrée en utilisant une 2'-O-méthyltransférase20, 21.
La méthode décrite dans cet article peut être utilisée pour transcrire, caper et transfecter tout ARNm souhaité. Les luciférases GLuc et CLuc ont été spécifiquement utilisées dans ce protocole en raison de leurs nombreux avantages. Elles sont directement sécrétées dans le milieu cellulaire, évitant ainsi la nécessité de lyser les cellules. De plus, elles produisent une intensité élevée de signal bioluminescent, et les dosages d'activité sont très sensibles et faciles à réaliser. Il est important de noter que l'expression de GLuc dans les cellules peut être influencée par divers facteurs autres que la fonctionnalité de l'ARN lui-même. Parmi ces facteurs, citons les erreurs de pipetage, le nombre variable de cellules par puits, l'efficacité de la transfection, etc. La normalisation des données permet de tenir compte de ces facteurs. Dans notre protocole, nous co-transfectons l'ARN CLuc comme témoin interne avec l'ARN GLuc. Lorsque la luminescence de GLuc est divisée par les valeurs du témoin CLuc, elle est normalisée par rapport aux erreurs et à la variabilité de la transfection19.

<table><tbody><tr><td>Kit de synthèse d'ARN à haut rendement T7</td><td>New England Biolabs</td><td>E2040S</td><td></td></tr><tr><td>Analogue de structure de coiffe ARN 3&amp;rsquo;-0-Me-m&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;G(5&amp;rsquo;)ppp(5&amp;rsquo;)G</td><td>New England Biolabs</td><td>S1411S</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (sans RNase)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>Système de coiffage vaccinia</td><td>New England Biolabs</td><td>M2080S</td><td></td></tr><tr><td>Kit MEGAclear</td><td>Ambion</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre NanoDrop</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit Agilent RNA 6000 Nano</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transfection d'ARNm &lt;em&gt;Trans&lt;/em&gt;IT</td><td>Mirus Bio LLC</td><td>MIR2250</td><td></td></tr><tr><td>Milieu liquide classique HyClone* : milieu de Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s, haute teneur en glucose</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30285.01</td><td></td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels HyClone</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>Centro LB 960</td><td>Berthold Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de dosage de la luciférase &lt;em&gt; Gaussia&lt;/em&gt; BioLux</td><td>New England Biolabs</td><td>E3300S</td><td></td></tr><tr><td>Kit de dosage de la luciférase &lt;em&gt;Cypridina&lt;/em&gt; BioLux</td><td>New England Biolabs</td><td>E3309S</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de RNase, murin</td><td>New England Biolabs</td><td>M0314</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de RNase, placenta humain</td><td>New England Biolabs</td><td>M0307</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide témoin pCMV-GLuc</td><td>New England Biolabs</td><td>N8081</td><td></td></tr></tbody></table>

transcription in vitro et plafonnement de l&#39;arnm de luciférase gaussia suivie par la transfection de cellules hela

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

La transcription in vitro correspond à la synthèse de transcrits d'ARN par une ARN polymérase à partir d'un modèle d'ADN linéaire contenant la séquence du promoteur correspondant (T7, T3, SP6) et le gène à transcrire (Figure 1A). Une réaction de transcription typique comprend l'ADN matrice, l'ARN polymérase, les ribonucléotides triphosphates, un inhibiteur de RNase et un tampon contenant des ions Mg2+.
De grandes quantités d'ARN de haute qualité sont souvent nécessaires pour diverses applications. L'utilisation de la transcription in vitro a été rapportée pour des études sur la structure et la fonction des ARN, telles que l'épissage1, des expériences d'ARNi dans des cellules de mammifères2, l'amplification d'ARN antisens par la « méthode d'Eberwine »3, l'analyse par puces à ADN4, ainsi que pour des études sur les vaccins à ARN5. Cette technique peut également être utilisée pour produire des sondes radiomarquées ou marquées par colorant6. Warren et al. ont récemment rapporté le reprogrammation de cellules humaines par transfection avec un ARN coiffé transcrit in vitro7. Le kit de synthèse d'ARN à haut rendement T7 de New England Biolabs a été conçu pour synthétiser jusqu'à 180 μg d'ARN par réaction de 20 μl. Des ARN d'une longueur allant jusqu'à 10 kb ont été transcrits avec succès à l'aide de ce kit. L'ADN plasmidique linéarisé, les produits de PCR et les oligonucléotides d'ADN synthétiques peuvent être utilisés comme matrices pour la transcription, à condition qu'ils contiennent la séquence promoteur T7 en amont du gène à transcrire.
L'ajout d'une structure de coiffe en position 5' sur l'ARN est un processus important chez les eucaryotes. Il est essentiel pour la stabilité de l'ARN8, la traduction efficace9, le transport nucléaire10 et l'épissage11. Ce processus implique l'ajout d'une coiffe de 7-méthylguanosine à l'extrémité triphosphate 5' de l'ARN. La coiffage de l'ARN peut être réalisé post-transcriptionnellement à l'aide d'enzymes de coiffage ou co-transcriptionnellement à l'aide d'analogues de coiffe. Dans la méthode enzymatique, l'ARNm est coiffé à l'aide de l'enzyme de coiffage du virus de la Vaccinia12,13. Cette enzyme ajoute une coiffe de 7-méthylguanosine à l'extrémité 5' de l'ARN en utilisant le GTP et la S-adénosylméthionine comme donneurs (structure cap 0). Les deux méthodes produisent un ARN coiffé fonctionnellement actif, adapté à la transfection ou à d'autres applications14, telles que la génération d'ARN génomique viral pour des systèmes de génétique inverse15 et des études cristallographiques de protéines liant la coiffe, comme l'eIF4E16.
Dans la méthode décrite ci-dessous, le kit de synthèse d'ARN à haut rendement T7 de NEB est utilisé pour synthétiser des ARN messagers capés et non capés de la luciférase de Gaussia (GLuc) et de la luciférase de Cypridina (CLuc). Une partie de l'ARN GLuc non capé est cappée à l'aide du système de capage vaccinia (NEB). Un plasmide linéarisé contenant le gène GLuc ou CLuc et un promoteur T7 sert d'ADN matrice. L'ARN transcrit est transfecté dans des cellules HeLa et les surnageants de culture cellulaire sont analysés pour mesurer l'activité luciférase. L'ARN CLuc cappé est utilisé comme témoin interne pour normaliser l'expression de GLuc.

Cette méthode décrit un rendement élevé in vitro synthèse d'ARNm capés et non capés à partir d'un plasmide linéarisé contenant le Gaussia gène de la luciférase (GLuc). L'ARN est purifié et une fraction de l'ARN non capée est capée enzymatiquement à l'aide du Vaccinia enzyme de coiffage viral. Dans la dernière étape, l'ARNm est transfecté dans des cellules HeLa et les surnageants de culture cellulaire sont analysés pour l'activité de la luciférase.

Transcription in vitro et plafonnement de l&#39;ARNm de luciférase Gaussia Suivie par la transfection de cellules HeLa

La transcription in vitro est la synthèse de transcrits d'ARN par l'ARN polymérase à partir d'une matrice d'ADN linéaire contenant la séquence promotrice correspondante...

L'objectif général de cette procédure est de transfecter des cellules HeLa avec des ARNm capés et non capés, transcrits à partir de la gal luciférase, puis de tester la culture cellulaire pour l'activité luciférase. Cela est réalisé en utilisant d'abord le kit de synthèse d'ARN à haut rendement T7 pour synthétiser, par transcription in vitro, des ARNm capés et non capés correspondant à la Gaia luciférase. Deux méthodes de capage de l'ARNm sont présentées.On utilise un analogue de capuchon lors de la transcription, tandis que l'autre méthode utilise l'enzyme de capuchonnage de la vaccine pour le capuchonnage post-transcriptionnel. L'étape suivante consiste à transfecter les ARNm capuchonnés et non capuchonnés dans des cellules Heli. Enfin, l'activité de la luciférase résultant d'ARNm capuchonnés ou non capuchonnés est comparée dans la culture de cellules Heli super nommée.L'avantage principal de cette méthode par rapport à la mise en place de votre propre réaction de transcription réside dans le fait que le kit de synthèse d'ARN à haut rendement T seven a été testé et optimisé pour produire un rendement élevé et, plus important encore, des ARN complets de haute qualité. Cela est extrêmement important pour une traduction ARN réussie et une expression de protéines fonctionnellement actives. Ainsi, cette méthode permet de mieux comprendre la transfection d'ARN ; les ARN transcrits in vitro peuvent également être utilisés pour d'autres applications telles que la microinjection, l'analyse par puces à ADN, les transferts par hybridation et les études sur la structure et la fonction des ARN.Le modèle d'ADN pour cette réaction exemple est un plasmide linéarisé contenant le gène de la luciférase de Gaussian ou le gène gluc. Avec un promoteur T7, des produits tant capés qu'uncapés seront synthétisés. Commencez par décongeler les composants du kit de synthèse d'ARN à haut rendement T7 et maintenez-les sur glace.Pour éviter la contamination par l'ARN, portez des gants et nettoyez soigneusement la surface de la paillasse, les pipettes et les autres matériaux. Il est fortement recommandé d'utiliser des pointes de pipette, des tubes et de la verrerie exempts de nucléases pour synthétiser l'ARN non coiffé. Préparez la réaction à température ambiante, en commençant par le tampon 10 x et l'eau, puis ajoutez les nucléotides, le modèle d'ADN, et enfin le mélange de polymérase.L'ordre d'ajout des réactifs est important pour synthétiser des ARN capés. À l'aide d'un analogue de capuchon, préparez un mélange réactionnel similaire, mais ajoutez les nucléotides analogues de capuchon. Après avoir ajouté les nucléotides standards, mélangez délicatement les composants réactionnels par vortexage doux, puis faites une courte centrifugation, et incubez les réactions à 37 degrés Celsius pendant deux heures dans un incubateur à air sec. En tant que contrôle interne, mettez en place une seconde réaction pour synthétiser des transcrits capés de c Luke à partir d'un plasmide linéarisé. L'expression de c Luke est utilisée pour normaliser l'expression de gluc.Après l'incubation, retirez le modèle d'ADN de chaque mélange réactionnel. Ajoutez 70 microlitres d'eau sans nucléase, suivis de 10 microlitres d'ADN, un tampon de réaction, puis deux microlitres d'ADN. Incubez les ADN pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius dans un incubateur à air sec.À présent, purifiez les réactions à l'aide de n'importe quel kit de purification d'ARN basé sur des colonnes de centrifugation et quantifiez l'ARN à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDrop™. Enfin, évaluez la qualité des ARN à l'aide du kit Agilent RNA 6 000 nano et de l'analyseur bioanalytique Agilent 2100. Pour une réaction de coiffage standard, portez à 10 microgrammes l'ARNm gluc non coiffé purifié dans 15 microlitres d'eau exempte de nucléase.Il est possible d’adapter cette procédure en fonction de l’échelle. Chauffer l’ARN à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes afin de rompre les structures secondaires, puis le placer sur de la glace pendant cinq minutes. Pour préparer la réaction de coiffage, ajouter au tampon de coiffage le GTP dilué récemment, la méthionine de limace et l’enzyme de coiffage vaccinia à l’ARN dénaturé. Vortexer doucement le mélange réactionnel, effectuer une courte centrifugation par impulsions, puis incuber la réaction à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes dans un incubateur à air sec.Après l'incubation, purifiez et analysez l'ARN comme indiqué à la fin de la section précédente. Commencez par ensemencer les cellules HeLa. Dans 28 puits d'une plaque de 48 puits, chaque puits doit contenir entre 70 et 230 000 cellules et 150 microlitres de DMEM à haute teneur en glucose, complété avec 10 % de sérum.Incuber la plaque à 37 degrés Celsius jusqu'à ce que les cellules atteignent une confluence de 60 à 90 %, ce qui devrait prendre entre 16 et 24 heures. Lorsque les cellules sont prêtes, préparer les mélanges de transfection. Diluer l'ARN à une concentration de 100 nanogrammes par microlitre.Préparez ensuite 24 tubes de microcentrifugation pour trois réactions différentes. Répétez chaque réaction en huit duplicats, soit huit tubes. Ajoutez un microlitre d'ARN gluc non coiffé, un microlitre d'ARN c luke coiffé pour la normalisation et 25 microlitres de sérum libre.DMEM, toujours bien mélanger à l’aide d’une pipette dans les huit tubes suivants. Mettre en place la même réaction, mais au lieu du gluc ARN non coiffé, ajouter dans les huit derniers tubes du gluc ARN coiffé préparé à l’aide d’un analogue de capuchon. Au lieu du gluc ARN préparé avec l’analogue de capuchon, ajouter maintenant dans le premier jeu de huit tubes du gluc ARN coiffé provenant de la réaction vaccinia avec le mélange d’ARNm non coiffé gluc, puis ajouter 0,2 microlitre de réactif amplificateur d’ARNm, suivi d’un mélange avec 0,2 microlitre. Le réactif d'ARNm de transit permet aux réactions de se dérouler à température ambiante pendant un maximum de cinq minutes. Deux minutes après le début de la réaction, commencez à transférer chaque mélange, goutte à goutte, dans un puits contenant des cellules en culture. Répétez cette étape avec les deux prochains jeux de tubes contenant le capuchon, l'analogue du capuchon gluc, l'ARN et l'ARN glucosylé capé provenant de la réaction vaccinia.Laisser quatre puits comme témoins négatifs, puis incuber les cellules toute la nuit à 37 degrés Celsius dans un atmosphère contenant 5 % de dioxyde de carbone. Le dosage supra mentionné utilise le kit d'essai Luciferase Biox GIA pour le dosage Gluc. Préparer une solution d'essai fraîche en ajoutant 15 microlitres de substrat biox gluc à 1,5 millilitre de tampon d'essai biox gluc.Ne pas vortexer une fois le mélange final obtenu. Mélanger par retournements du tube pour le dosage CLU. Préparer 100 x le substrat fraîchement reconstitué.Préparez ensuite la solution de dosage en ajoutant 15 microlitres de substrat reconstitué à 1,5 millilitre de tampon de dosage pour luciférase Blu Ciena. Mélangez la solution de dosage C Luke sans vortexer et incubez-la à température ambiante pendant 30 minutes, à l’abri de la lumière. Une fois les solutions de dosage préparées.Mesurez la luminiscence des cellules à l’aide d’un luminomètre pour microplaque. Réglez le luminomètre pour qu’il injecte 50 microlitres de solution d’essai en deux à dix secondes. Ensuite, transférez 10 microlitres de chaque surnom de culture cellulaire dans un puits d’une plaque noire de 96 puits.Amorcez l'injecteur avec la solution d'essai et procédez à la mesure de la luminescence. Le kit de synthèse d'ARN à haut rendement T7 peut produire jusqu'à 180 microgrammes d'ARN non capé et de 40 à 50 microgrammes d'ARN capé par réaction de 20 microlitres lorsqu'il est analysé sur l'analyseur bioanalytique Agilent 2100. ARN intact de bonne qualité.L'ARN doit présenter un pic unique et net correspondant au transcrit d'ARN. Un pic large ou plusieurs pics indiquent une dégradation de l'ARN. Il est également important de vérifier la taille du R-N-A-R-N-A.Des transcrits de longueur plus élevée que prévue peuvent être dus à une digestion incomplète du plasmide matrice. La dégradation de l'ADN-ARN et un rendement plus faible sont généralement le résultat de contaminants introduits dans la réaction à partir du matrice. La transfection d'ADN a été suivie d'une incubation et d'un dosage de l'activité luciférase. La structure du capuchon en 5' est importante pour protéger l'ARN contre la dégradation par les exonucléases et pour favoriser l'initiation de la traduction.Par conséquent, la coiffure de l'ARN est une étape essentielle pour les expériences de transfection. La différence de luminiscence mesurée entre les cultures cellulaires transfectées avec des ARN coiffés et non coiffés soutient clairement cette affirmation, et montre également que les deux techniques de coiffure — utilisant un analogue de capuchon ou l'enzyme de coiffure de la vaccine — produisent avec succès des transcrits d'ARN fonctionnels coiffés. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la synthèse de transcrits d'ARN coiffés de haute qualité destinés à la transfection et à diverses autres applications.

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