Transcription in vitro et plafonnement de l'ARNm de luciférase Gaussia Suivie par la transfection de cellules HeLa

L’objectif global de cette procédure est de transfecter des cellules hela avec de l’ARNm coiffé et non coiffé, des transcrits de gal luciférase et de tester la culture cellulaire pour l’activité de la luciférase. Ceci est accompli en utilisant d’abord le kit de synthèse d’ARN à haut rendement T seven pour synthétiser à la fois l’ARNm non coiffé et coiffé, les transcrits de Gaia luciferase par transcription in vitro. Deux méthodes de coiffage de l’ARNm sont démontrées.

L’un utilise un analogue de la coiffe pendant la transcription et l’autre utilise l’enzyme de coiffe de la vaccine pour la coiffe post-transcriptionnelle. L’étape suivante consiste à transfecter les transcrits d’ARNm coiffés et non coiffés dans des cellules hélicoïdales. En fin de compte, l’activité de la luciférase résultant d’un ARNm non coiffé ou coiffé est comparée dans la culture hélicellulaire super nommée.

Le principal avantage de cette méthode par rapport à la configuration de votre propre réaction de transcription est que le kit de synthèse d’ARN à haut rendement T seven a été testé et optimisé pour produire des transcrits d’ARN complets à haut rendement et, plus important encore, de haute qualité. C’est extrêmement important pour la traduction réussie de l’ARN et l’expression des protéines fonctionnellement actives. Ainsi, cette méthode donne un aperçu de la transfection de l’ARN in vitro Les ARN transcrits peuvent également être utilisés pour d’autres applications telles que l’analyse de micro-injection, l’analyse de puces à ADN, les transferts basés sur l’hybridation et les études de structure et de fonction de l’ARN.

La matrice d’ADN de cet exemple de réaction est un plasmide linéarisé contenant le gène gaussien de la luciférase ou du gluc. Avec un promoteur T sept, les produits plafonnés et non plafonnés seront synthétisés. Commencez par décongeler les composants du kit de synthèse d’ARN à haut rendement T seven et conservez-les sur la glace.

Pour éviter la contamination par l’ARN, portez des gants et nettoyez soigneusement les pipettes de surface de la paillasse et autres matériaux Il est fortement recommandé d’utiliser des pointes de pipette, des tubes et de la verrerie sans nucléases pour synthétiser l’ARN non coiffé. Configurez la réaction à température ambiante, en commençant par le tampon 10 x et l’eau, suivis des nucléotides, la matrice d’ADN. Et enfin, le mélange de polymérase.

L’ordre d’ajout des réactifs est important pour synthétiser l’ARN coiffé. À l’aide d’un analogue de capuchon, faites un mélange de réaction similaire, mais ajoutez les nucléotides analogiques de capuchon. Après avoir ajouté les nucléotides standard, mélangez maintenant les composants de la réaction en vortex doucement, puis pulsez, tournez et incuberez les réactions à 37 degrés Celsius pendant deux heures dans un incubateur à air sec en tant que contrôle interne mettre en place une deuxième réaction pour synthétiser les transcrits de chapeau de c Luke à partir d’un plasmide linéarisé L’expression de C Luke est utilisée pour normaliser l’expression de gluc.

Après l’incubation, retirez la matrice d’ADN de chaque mélange réactionnel. Ajoutez 70 microlitres d’eau exempte de nucléases, suivis de 10 d’ADN, d’un tampon de réaction, puis de deux microlitres d’ADN. Premièrement, laissez les ADN réagir pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius dans un incubateur à air sec.

Purifiez maintenant les réactions à l’aide de n’importe quel kit de purification d’ARN basé sur une colonne de spin et quantifiez l’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre NanoDrop TM. Enfin, évaluez la qualité des ARN à l’aide du nano Kitt Agilent RNA 6, 000 nano et du bioanalyseur Agilent 2100. Pour une réaction de bouchage standard, apportez 10 microgrammes de l’ARNm gluc purifié non bouché dans 15 microlitres d’eau sans nucléases.

Cela peut être augmenté en conséquence. Chauffez l’ARN à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes pour perturber les structures secondaires, puis placez-le sur de la glace pendant cinq minutes. Pour mettre en place la réaction de coiffage, ajoutez un tampon de coiffage GTP de méthionine d’escargot fraîchement diluée et l’enzyme de coiffage de la vaccine à l’ARN dénaturé Vortex doucement les composants de la réaction, pulsez, tournez et incubez la réaction à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes dans un incubateur à air sec.

Après l’incubation, nettoyez et analysez l’ARN comme fait à la fin de la section précédente. Commencez par plaquer les cellules Hela. Dans 28 puits d’une plaque de 48 puits, chaque puits doit contenir de 70 à 230 000 cellules et 150 microlitres de DMEM à haute teneur en glucose complétés par 10 % de sérum.

Incuber la plaque à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que les cellules soient confluentes à 60 à 90 %, ce qui devrait prendre entre 16 et 24 heures. Lorsque les cellules sont prêtes, préparez les mélanges de transfection. Diluez l’ARN à une concentration de 100 nanogrammes par microlitre.

Ensuite, installez 24 microtubes de centrifugation pour trois réactions différentes. Dupliqué huit fois en huit tubes. Ajoutez un microlitre d’ARN gluc non plafonné, un microlitre d’ARN c luke pour la normalisation et 25 microlitres de sérum gratuit.

Les DMEM se mélangent toujours bien à l’aide d’une pipette dans les huit tubes suivants. Mettez en place la même réaction, mais au lieu du gluc non coiffé, l’ARN, ajoutez de l’ARN gluque coiffé préparé à l’aide d’un analogue du capuchon dans les huit derniers tubes. Au lieu de l’ARN gluque préparé à l’aide d’un analogue de capuchon, ajoutez maintenant l’ARN gluque bouché de la réaction de vaccine dans le premier ensemble de huit tubes avec un mélange d’ARN gluque non bouché dans 0,2 microlitre de réactif d’amplification de l’ARNm, suivi d’un mélange de 0,2 microlitre.

Le réactif de transit de l’ARNm permet aux réactions de se dérouler à température ambiante pendant moins de cinq minutes au maximum. Deux minutes après le début de la réaction, commencez à transférer chaque mélange goutte à goutte dans un puits avec des cellules cultivées. Répétez cette étape avec les deux ensembles suivants de tubes contenant du gluc capuchon, du gluc de capuchon analogique, de l’ARN et de l’ARN gluc coiffé de la réaction de la vaccine

Laissez quatre puits comme témoins négatifs, incubez les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans un dosage de dioxyde de carbone à 5 %. Le supra nommé à l’aide du kit de dosage Biox GIA Luciferase pour le test Gluc. Préparez une nouvelle solution d’essai en ajoutant 15 microlitres de substrat de gluc biox à 1,5 millilitre de tampon de dosage de gluc biox.

Ne vortex pas le mélange final. Mélangez-le par inversions de tube pour le test CLU. Préparez 100 x substrat fraîchement reconstitué.

Ensuite, préparez la solution d’essai en ajoutant 15 microlitres de substrat reconstitué à 1,5 millilitre de tampon d’essai Blu Ciena luciférase. Mélangez la solution de dosage de C Luke sans tourbillonner et incubez-la à température ambiante pendant 30 minutes à l’abri de la lumière. Une fois les solutions de dosage préparées.

Mesurez la luminescence de la cellule à l’aide d’un luminomètre sur microplaques. Réglez le luminomètre pour injecter 50 microlitres de solution de dosage en deux à 10 secondes. Ensuite, transférez 10 microlitres de chaque super nom de culture cellulaire dans un puits d’une plaque noire de 96.

Amorcez l’injecteur avec la solution de dosage et procédez à la mesure de la luminescence. Le kit de synthèse d’ARN à haut rendement T seven peut produire jusqu’à 180 microgrammes d’ARN non coiffé et 40 à 50 microgrammes d’ARN coiffé par réaction de 20 microlitres lorsqu’il est analysé sur le bioanalyseur Agilent 2100. Bonne qualité intacte.

L’ARN doit présenter un seul pic pointu représentant le transcrit de l’ARN. Un pic large ou plusieurs pics indiquent une dégradation de l’ARN. Il est également important de vérifier la taille du R-N-A-R-N-A.

Les transcrits d’une longueur plus longue que prévu peuvent être dus à une digestion incomplète du plasmide matrice, à la dégradation du D-N-A-R-N-A et à un rendement plus faible sont généralement le résultat de contaminants introduits dans la réaction à partir de la matrice. La transfection de l’ADN a été suivie d’une incubation et d’un test de l’activité de la luciférase. La structure à cinq premiers sommets est importante pour protéger l’ARN contre la dégradation des exonucléases et pour favoriser l’initiation de la traduction.

Par conséquent, le plafonnement de l’ARN est une étape essentielle pour les expériences de transfection. La différence de luminescence mesurée entre les cultures cellulaires transfectées avec des transcrits coiffés et non coiffés soutient clairement cette affirmation, et montre également que les deux techniques de coiffage utilisant l’analogue de la coiffe et l’utilisation de l’enzyme de coiffage de la vaccine produisent avec succès des transcrits d’ARN coiffés fonctionnels. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de synthétiser des transcrits d’ARN coiffés de haute qualité pour une utilisation dans la transfection et d’autres applications diverses.