Évaluer les changements tératogènes dans un modèle de poisson zèbre de l'exposition d'alcoolisation fœtale

L’objectif général de cette procédure est d’étudier les effets de l’exposition à l’éthanol sur le poisson zèbre en développement. Ceci est accompli en exposant d’abord le poisson zèbre à des doses d’éthanol dans de l’eau embryonnaire normale au cours du développement précoce. Ensuite, l’éthanol est retiré et les poissons sont laissés se développer jusqu’au point de temps souhaité.

Ensuite, les changements physiques grossiers ainsi que les altérations de l’expression des gènes sont testés chez les embryons traités par rapport aux embryons témoins. Enfin, les embryons sont manipulés avec de l’ARNm, des morphoses ou des médicaments pour déterminer si les défauts de développement induits par l’éthanol peuvent être modifiés. En fin de compte, une combinaison de PCR quantitative et d’hybridation en C deux montre que les effets de l’éthanol sur le développement des embryons de poisson-zèbre sont liés à la modification de l’expression des gènes.

La manipulation ultérieure des niveaux d’expression génique peut améliorer ou prévenir les défauts de développement induits par l’éthanol. Les techniques que nous démontrons aujourd’hui élargissent nos connaissances sur la nature du syndrome d’alcoolisation fœtale et préservent les processus de développement chez les vertébrés. La démonstration d’aujourd’hui sera Steph Erhardt, une technicienne de mon laboratoire pour traiter les embryons avec de l’éthanol.

Élevez-les des accouplements de type sauvage au stade de dôme à 28 degrés Celsius dans l’eau de l’embryon. Divisez les embryons d’une couvée dans le nombre souhaité de boîtes avec entre 10 et 50 embryons par boîte. Ajouter une solution d’éthanol entre 0,2 et 2,5 % volume à volume dans l’eau de poisson jusqu’aux embryons et retourner dans l’incubateur jusqu’à 24 heures après la durée d’exposition souhaitée.

Remplacez l’eau contenant de l’éthanol par de l’eau fraîche de l’embryon pendant une période spécifique de développement afin de recueillir l’ARNm pour la PCR quantitative. Placez les embryons H appariés dans les tubes einor. Retirez l’eau du poisson et ajoutez un tampon de lyse avec du TCEP.

À l’aide d’un pulvérisateur motorisé, dissociez physiquement les embryons, puis placez-les dans la centrifugeuse pour une rotation lente. Transférez le soluté dans une colonne de pré-nettoyage, puis centrifugez la colonne. Pour enlever les gros morceaux dissociés.

Utilisez un kit d’isolement d’ARN pour extraire l’ARN. Ensuite, synthétisez l’ADNC à l’aide de méthodes standard pour la QPCR ou l’analyse de microréseaux afin de préparer les embryons à l’hybridation en C deux et à la déclaration d’anticorps. Fixer six à 24 heures après la fécondation les embryons dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant la nuit à quatre degrés Celsius, après trois lavages et PBS plus 0,1 % de préadolescent.

Retirez le choon à l’aide de deux pinces tranchantes sous le microscope. Ensuite, déplacez les embryons dans le méthanol en utilisant une série de changements de liquide d’augmentation de la concentration de méthanol et de diminution de la concentration de PBT. Après avoir transféré les embryons dans du méthanol à 100 %, conservez-les à moins 20 degrés Celsius pour colorer le cartilage.

Élever les embryons jusqu’à cinq ou six jours après la fécondation. Fixez-les pendant la nuit dans de l’aldéhyde paraforme à 4 % à quatre degrés Celsius. Ensuite, lavez-les trois fois dans un PBT pour déterminer quels niveaux d’expression génique ont changé à la suite de l’exposition à l’éthanol.

Effectuez la QPCR en concevant d’abord des amorces pour valider les amorces. Testez-les sur trois échantillons biologiques. Ces échantillons biologiques de contrôle peuvent être de n’importe quel âge, à condition que le gène d’intérêt soit exprimé à cet âge particulier.

Une fois que les amorces ont été vérifiées, utilisez l’ADNC préalablement préparé pour effectuer la QPCR en analysant des échantillons en trois exemplaires et y compris un échantillon de contrôle pour un contrôle de poisson-zèbre, nous utilisons les amorces pour écarter le dh. Normalisez les résultats en fonction des niveaux de DH de l’écart. Calculez ensuite le niveau relatif d’expression des gènes à l’aide de la méthode puissante.

Variation sur deux tomodensitogrammes delta-delta montrant une différence expérimentale par rapport au type sauvage. Pour en C deux construction d’hybridation. Le ribo marqué Ditch sonde le gène d’intérêt.

Ensuite, incubez-les avec des embryons du même âge en utilisant des conditions standard et détectez le modèle d’hybridation à l’aide de la phosphatase alcaline, imagez les échantillons à l’aide d’un microscope à dissection pour évaluer le développement morphogénique, de sorte que cela pourrait façonner des embryons vivants pour évaluer la distance interoculaire et la longueur du corps. Tout d’abord, fixez les embryons dans du para formaldéhyde. Ensuite, collectez des images pour examiner les effets du traitement à l’alcool sur le développement des structures cartilagineuses dans la coloration de la larve.

Correction du poisson-zèbre utilisant lc et bleu pendant plusieurs heures pour retenir et éliminer les embryons pendant la nuit avant l’imagerie. Analysez la mort cellulaire dans des embryons vivants en les incubant dans cinq milligrammes par millilitre d’orange aïnée dans du PBS pendant une heure. Lavez les embryons trois fois dans du PBS, puis montez les embryons sur des lames, imagez les échantillons à l’aide d’un microscope confocal et utilisez la série Z pour créer des composites.

Après avoir identifié les gènes dont l’expression a diminué en raison de l’exposition à l’éthanol, injectez 25 à 200 picogrammes par nanolitre d’ARNm bouché pour un gène d’intérêt dans un à deux stades cellulaires. Laissez les œufs récupérer dans un incubateur chauffé à 28 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils atteignent le stade du dôme, puis traitez-les avec de l’éthanol comme auparavant. Pour les gènes dont l’expression a augmenté à la suite de l’exposition à l’éthanol, éliminez-les en injectant des quantités de picogramme à nanogramme de morphes antisens dans un ou deux embryons au stade cellulaire.

Ce protocole est similaire à celui de l’ARNm coiffé. Si vous injectez un morpho d’ARNm, mesurez l’efficacité à l’aide de R-T-P-C-R pour comparer les quantités de transcrits épissés et non tranchés afin d’analyser l’activité génique dose-dépendante, de titrer le morino injecté et de permettre aux embryons de se développer jusqu’à un stade souhaité avant de les traiter avec de l’éthanol. L’exposition des embryons de poisson-zèbre à l’éthanol entraîne un certain nombre de défauts développementaux et génétiques liés aux phénotypes trouvés chez d’autres vertébrés.

Le développement anormal des tissus axiaux, y compris Noor, conduit à un noorde raccourci et parfois perturbé, ce qui conduit en partie aux anomalies ultérieures chez les somites comme montré ici. Alors que les commandes non traitées ont une forte forme de chevron, les somites traitées à l’éthanol prennent l’apparence en forme de U observée avec une signalisation sonore de hérisson réduite. Comme on le voit ici.

Une autre conséquence de l’exposition à l’éthanol, peut-être en aval du retard de développement précoce et des anomalies Noor ultérieures, est la réduction de la longueur de l’embryon. Cette constatation est similaire à la persistance de la prépuberté, de petite taille observée chez les enfants exposés à l’éthanol au cours du développement, ce qui suggère que le modèle du poisson-zèbre est pertinent pour la compréhension de cette anomalie congénitale humaine. Il a été démontré dans des modèles animaux qu’une exposition sévère à l’éthanol entraîne des phénotypes prononcés du syndrome d’alcoolisation fœtale, y compris le synthia et l’opia.

Chez le poisson-zèbre, la distance intraoculaire ou IOD diminue d’une manière dépendante de la dose d’éthanol, conformément à la nature de l’anomalie congénitale humaine. L’opia n’est détecté qu’à des doses très élevées, mais des doses plus faibles produisent une réduction significative de l’IOD, ce qui suggère que ce modèle animal présente un défaut similaire dans le développement médian du visage. Dans cette figure, les niveaux précoces d’expression génique de six, trois, B et glee un sont comparés chez des embryons non traités et traités à l’éthanol.

Les deux gènes ont montré des niveaux d’expression réduits dans les échantillons traités à l’éthanol. En utilisant l’hybridation NC deux, les profils d’expression de six trois B et gooID ont été analysés comme vu. Ici, les deux gènes ont montré une diminution de l’expression spatiale chez les embryons traités à l’éthanol par rapport aux témoins non traités.

Parce que les deux gènes sont exprimés dans les tissus destinés à devenir des tissus craniofaciaux C, leurs réductions huit heures après la fécondation sont compatibles avec la réduction de l’IOD plus tard dans le développement. Une fois que les gènes affectés par l’éthanol sont identifiés, il existe des mécanismes par lesquels leur expression peut être augmentée ou diminuée. Dans cet exemple, l’ARNm a été injecté pour le hérisson sonique, un ligand qui augmente les niveaux de Glee One, et il a sauvé les défauts flagrants dus à la réduction de Glee One et d’embryons traités à l’éthanol.

L’injection de six trois B n’a cependant pas permis de sauver le phénotype exposé à l’éthanol. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’explorer les défauts génétiques et de développement produits par l’éthanol, un embryon de poisson-zèbre en développement. Les techniques utilisées ici peuvent également être appliquées à ceux qui veulent étudier la toxicité d’autres composés solubles dans l’eau de l’embryon de vertébré en développement.