Évaluer les changements tératogènes dans un modèle de poisson zèbre de l'exposition d'alcoolisation fœtale

L'objectif général de cette procédure est d'étudier les effets de l'exposition à l'éthanol sur le poisson zèbre en développement. Cela est réalisé en exposant d'abord le poisson zèbre à des doses d'éthanol dans de l'eau embryonnaire normale pendant les premières phases du développement. Ensuite, l'éthanol est éliminé et les poissons sont laissés en développement jusqu'au moment souhaité.

Ensuite, des modifications morphologiques globales ainsi que des altérations de l'expression génique sont analysées chez les embryons traités par rapport aux embryons témoins. Enfin, les embryons sont manipulés à l'aide d'ARNm, de morpholinos ou de médicaments afin de déterminer si les défauts développementaux induits par l'éthanol peuvent être modifiés. En définitive, une combinaison de PCR quantitative et d'hybridation in situ révèle que les effets de l'éthanol sur les embryons de poisson zèbre en développement sont liés à des changements d'expression génique.

La manipulation ultérieure des niveaux d'expression génique pourrait améliorer ou prévenir les anomalies développementales induites par l'éthanol. Les techniques que nous démontrons aujourd'hui approfondissent notre compréhension de la nature du syndrome d'alcoolisation fœtale, tout en mettant en évidence des processus développementaux conservés chez les vertébrés. La démonstration d'aujourd'hui sera réalisée par Steph Erhardt, technicienne dans mon laboratoire, pour traiter les embryons avec de l'éthanol.

Élever les embryons issus de croisements de type sauvage jusqu'au stade dôme à 28 degrés Celsius dans de l'eau pour embryons. Répartir les embryons d'une ponte dans le nombre souhaité de boîtes, avec entre 10 et 50 embryons par boîte. Ajouter une solution d'éthanol à une concentration comprise entre 0,2 et 2,5 % volume/volume dans l'eau d'aquarium aux embryons, puis replacer au laboratoire d'incubation pendant jusqu'à 24 heures après la durée d'exposition souhaitée.

Remplacez l'éthanol contenant de l'eau par de l'eau pour embryons fraîche pendant une période spécifique de développement afin de recueillir l'ARNm pour une PCR quantitative. Placez les embryons appariés H dans des tubes einor. Éliminez l'eau pour poissons et ajoutez du tampon de lyse avec du TCEP.

À l’aide d’un pulvérisateur motorisé, dissocier physiquement les embryons, puis placer dans la centrifugeuse pour une rotation lente. Transférer le soluté vers une colonne de pré-élimination, puis centrifuger la colonne afin d’éliminer les grands morceaux dissociés.

Utilisez un kit d'isolement de l'ARN pour extraire l'ARN. Ensuite, synthétisez l'ADNc en utilisant des méthodes standard pour l'analyse par QPCR ou par puces à ADN afin de préparer les embryons pour l'hybridation in situ et la coloration par anticorps. Fixez les embryons de six à 24 heures après la fécondation dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant une nuit à quatre degrés Celsius, après trois lavages au PBS contenant 0,1 % de Tween.

Retirer la chorion à l’aide de deux pincettes pointues sous microscope. Ensuite, transférer les embryons dans du méthanol en effectuant une série de changements de liquide avec une concentration croissante de méthanol et une concentration décroissante de PBT. Après avoir transféré les embryons dans du méthanol à 100 %, les conserver à moins 20 degrés Celsius pour colorer le cartilage.

Élever les embryons jusqu'à cinq ou six jours après la fécondation. Les fixer toute la nuit dans du paraformaldéhyde à 4 % à quatre degrés Celsius. Puis les laver trois fois dans du PBT afin de déterminer quels niveaux d'expression génique ont été modifiés par l'exposition à l'éthanol.

Réalisez une PCR quantitative en concevant d'abord des amorces pour valider les amorces. Testez-les sur trois échantillons biologiques. Ces échantillons biologiques témoins peuvent être d'un âge quelconque, pourvu que le gène d'intérêt soit exprimé à cet âge précis.

Une fois les amorces vérifiées, utilisez l'ADNc préparé précédemment pour réaliser une qPCR en effectuant les échantillons en triplets et en incluant un échantillon témoin pour un contrôle de zebrafish ; nous utilisons les amorces dirigées contre gap dh. Normalisez les résultats par rapport aux niveaux de gap DH. Calculez ensuite le niveau relatif d'expression génique à l'aide de la méthode du seuil de quantification (CT).

Variant de la méthode du double delta delta CT montrant la différence expérimentale par rapport au type sauvage. Pour le construct d'hybridation en deux hybrides. Éliminer les sondes ribos marquées ciblant le gène d'intérêt.

Ensuite, incubez-les avec des embryons de même âge dans des conditions standard et détectez le profil d'hybridation à l'aide de phosphatase alcaline. Observez les échantillons au microscope stéréoscopique afin d'évaluer le développement morphogénique, tel que la forme du corps. Prenez des images d'embryons vivants pour évaluer la distance interoculaire et la longueur du corps. Fixez d'abord les embryons dans du paraformaldéhyde. Puis recueillez des images pour examiner les effets du traitement à l'alcool sur les structures cartilagineuses en développement dans la larve colorée.

Fixer les embryons de poisson zèbre en utilisant lc et du bleu pendant plusieurs heures à toute la nuit afin de les immobiliser et les clarifier avant l'imagerie. Analyser la mort cellulaire dans les embryons vivants en les incubant pendant une heure dans du PBS contenant cinq milligrammes par millilitre d'orange aine. Rincer les embryons trois fois dans du PBS, puis monter les embryons sur des lames, imager les échantillons à l'aide d'un microscope confocal et utiliser une série Z pour créer des images composites.

Après avoir identifié les gènes dont l'expression a diminué en raison de l'exposition à l'éthanol, injecter de 25 à 200 picogrammes par nanolitre d'ARNm coiffé pour un gène d'intérêt dans des embryons au stade d'une à deux cellules. Laisser les œufs se rétablir dans un incubateur chauffé à 28 degrés Celsius jusqu'à ce qu'ils atteignent le stade dôme, puis les traiter à l'éthanol comme précédemment. Pour les gènes dont l'expression a augmenté suite à l'exposition à l'éthanol, réduire leur expression en injectant des quantités allant du picogramme au nanogramme d'oligonucléotides antisens (morpholinos) dans des embryons au stade d'une à deux cellules.

Ce protocole est similaire à celui utilisé pour l'ARNm coiffé. Si vous injectez un ARNm ou un morpholino ciblant l'épissage, mesurez l'efficacité à l'aide de la RT-PCR afin de comparer les quantités de transcrits épissés et non épissés pour analyser l'activité génique dépendante de la dose ; effectuez une titration du morpholino injecté et laissez les embryons se développer jusqu'au stade souhaité avant de les traiter avec de l'éthanol. L'exposition des embryons de poisson zèbre à l'éthanol provoque un certain nombre de défauts développementaux et génétiques associés aux phénotypes observés chez d'autres vertébrés.

Un développement anormal des tissus axiaux, incluant le notocorde, conduit à un raccourcissement et parfois à une interruption du notocorde, ce qui contribue en partie aux anomalies ultérieures des somites, comme illustré ici. Alors que les contrôles non traités présentent une forme en chevron marquée, les somites traités à l'éthanol adoptent l'aspect en forme de U observé lors d'une réduction de la signalisation du sonic hedgehog. Comme on le voit ici.

Une autre conséquence de l'exposition à l'éthanol, éventuellement en aval du retard du développement précoce et des défauts ultérieurs de Noor, est une longueur réduite de l'embryon. Cette observation est comparable à la persistance d'une taille réduite prépubère observée chez les enfants exposés à l'éthanol pendant le développement, suggérant que le modèle de poisson zèbre est pertinent pour la compréhension de ce défaut congénital humain. Il a été démontré chez des modèles animaux qu'une exposition sévère à l'éthanol conduit à des phénotypes prononcés du syndrome d'alcoolisation fœtale, incluant la synchie et l'opie.

Chez le poisson zèbre, la distance interoculaire (IOD) diminue de manière dépendante de la dose d'éthanol, ce qui est conforme à la nature du défaut congénital humain. L'opie n'est observée qu'avec des doses très élevées, mais des doses plus faibles entraînent déjà une réduction significative de la distance interoculaire, suggérant que ce modèle animal présente un défaut similaire dans le développement facial médian. Sur cette figure, les niveaux d'expression génique précoces de six trois B et glee un sont comparés chez des embryons non traités et traités à l'éthanol.

Les deux gènes ont montré des niveaux d'expression réduits dans les échantillons traités à l'éthanol. À l'aide de l'hybridation NC deux, les profils d'expression du six trois B et du gooID ont été analysés comme indiqué. Ici, les deux gènes présentaient une diminution de l'expression spatiale dans les embryons traités à l'éthanol par rapport aux témoins non traités.

Étant donné que les deux gènes sont exprimés dans des tissus destinés à devenir des tissus médians crâniens et faciaux, leur diminution huit heures après la fécondation est compatible avec la réduction de la distance interpupillaire observée ultérieurement au cours du développement. Une fois identifiés les gènes affectés par l'éthanol, il existe des mécanismes permettant d'augmenter ou de diminuer leur expression. Dans cet exemple, un ARN messager a été injecté pour le sonic hedgehog, un ligand qui augmente les niveaux de glee one, ce qui a permis de corriger les défauts morphologiques provoqués par la diminution de glee one et par le traitement des embryons à l'éthanol.

L'injection de six trois B, toutefois, n'a pas permis de corriger le phénotype exposé à l'éthanol. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment explorer les anomalies génétiques et développementales provoquées par l'éthanol chez l'embryon de poisson zèbre en développement. Les techniques utilisées ici peuvent également être appliquées à ceux qui souhaitent étudier la toxicité d'autres composés solubles dans l'eau sur l'embryon de vertébré en développement.